Регуляторные гены, опосредующие генетическую стабильность и радиочувствительность дрожжей Saccharomyces cerevisiae Колтовая Наталия Алексеевна

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. МИЮХОНДРИАЛЬНЫИ ГЕНОМ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisia

(обзор литературы) 10

1. Структура митохондриальной ДНК 11

2. Структурная организация митохондрий 13

3. Функции митохондрий .14

1.3.1 Образование энергии 15

4. Окислительное фосфоршшрование 15

5. />е///е-позитивные и pe/z/e-негативные дрожжи 19

1.3 2 Образование активных форм кислорода 25

13.3 Метаболизм железо-серных белков 26

1.3.4 Апоитоз 28

6. Программируемая гибель клеток млекопитающих 28

7. Программируемая гибель дрожжей 35

4. Наследование митохондрий 43

5. Наследование митохондриальной ДНК 57

6. Репликация митохондриального генома 69

7. Сегрегация митохондриального іенома 75

8. Индукция мутаций petite бромистым этидием 79

9. Репарация митохондриальной ДНК 83

10. Нарушения митохондриального генома и его наследования вызывают заболевания человека 100

11. Выделение мутаций srm, снижающих спонтанную г/ю"-мутабильность....Ю2

1. Получение мутаций srml-srmS 103

2. Попарное взаимодействие мутаций srml, srm2, srm3 и srm5 105

1 11.3 Влияние мутаций чш1-чгт5 на спонтанную /"Ао'-мутабильность 106

4. Влияние мутаций srml-srm5 на /-//(/-мутагенез под действием БЭ 108

5. Влияние мутаций srml-srmS на стабильность хромосом 110

6. Влияние мутаций srml-srm5 на стабильность рекомбинантных нлазмид 112

7. Картирование мутации srm5 113

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 117

2.1 Линии 117

2. Плазмиды и библиотека геномной ДНК дрожжей 123

3. Состав сред и растворов 124

4. Основные методики 125

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСВА МУТАЦИЙ srm, ОДНОВРЕМЕННО
СНИЖАЮЩИХ СПОНТАННУЮ rho" -МУТАБИЛЬНОСТЬ И МИ ГОТИЧЕСКУЮ
СТАБИЛЬНОСТЬ ХРОМОСОМ 135

1. Получение мутаций srm8, srml2, srml5 и srml7 135

2. Попарное взаимодействие мутаций srm8, srml 2, srmln srm5 138

3. Фенотипические особенности отобранных мутантов чгт .139

4. Формаклеток 139

5. Время генерации 141

6. Хронологическое старение 143

7. Характер почкования 144

3.4 Влияние мутаций srm на митохондриальную /7ш'-мутабилыюсть 147

8. Влияние мутаций srm на спонтанную г/ш"-мутабильность 147

9. Влияние мутаций srm на rho'-мугаі енез под действием бромистого

этидия 148

3.4.3 Влияние мутаций srm на индукцию мутаций rho' под действием
УФ-света 150

5. Мутации srm и точечный митохондриальный мутаї енез 152

6. Рекомбинация и сегрегация митохондриальных генетических маркеров у мутантовшя 153

7. Влияние мутаций srm на теми возникновения ядерных і енных мутаций

и митотической рекомбинации 157

3.8 Влияние мутаций srm на митотическую стабильность хромосом 160

3 9 Влияние мутаций srm на митотическую стабильность рекомбинантных

плазмид 164

10. Влияние нарушений митохондриального генома на стабильность плазмид 167

11. Обсуждение 168

ГЛАВА 4. КАРТИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ
SRM 176

4.1 Ген 5Ш5 176

1. Локализация гена SRM5 176

2. Влияние различных аллелей cdc28 на скорость размножения 177

3. Влияние различных аллелей cdc28 на спонтанный rho' -мутагенез 178

4. Влияние различных аллелей cdc28 на радиочувствительность 178

5. Определение нуклеотидной последовательности аллеля cdc28-srm 180

6. Молекулярно-динамическое моделирование киназы 181

7. Ген CDC28 (обсуждение) 193

4.2ГенД'Ш5 1%

4 2.1 Картирование мутации мт8 196

4.2.2 Клонирование и идентификация нуклеотидной последовательности
KU&SRM8 197

4.2.3 Определение нуклеотидной последовательности аллеля srm8/netl-srm 201

4.2 4 Ген CFI1/NET1 (обзор литературы) 204

4.3VenSRMI2 209

1. Клонирование и идентификация нуклеотидной последовательное і и генаШ/72 209

2. Определение нуклеотидной последовательности аллеля &rml2/hfil-srm.. .210

4.3.3 Ген HFI1 (обзор литературы) 211

4.4 Обсуждение 218

ГЛАВА 5. МОДИФИКАЦИЯ ГЕНАМИ SRM ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К у- ИЗЛУЧЕНИЮ
И CHECKPOINT-КОНТРОЛЯ 231

5.1 Чувствительность мутантов srm к у-излучению 231

3. Чувствительность гаплоидных клеток мутантов wm к летальному действию у-излучения и УФ-света 231

4. Чувствительность диплоидных мутантов srm к летальному действию у-излучения 232

5. Взаимодействие мутаций srml,srm2 и srm5 235

6. Влияние элиминации митохондриального генома на радиочувствительность штаммов дикого типа и мутантов srml usrm2 237

7. Пострадиационное восстановление жизнеспособности мутантов

srm2 nsrm5 239

5.1.6 Пострадиационное восстановление жизнеспособности дыхательно-
недостаточных мутантов с генотипом SRKf, srm2, srm5 244

5.2 Взаимодействие іенов SRM с генами репарации и checkpoint-контроля 245

8. Мутация cdc28-srm и эпистатические группы мутаций чувствительности к ионизирующему излучению RAD6 и RAD52 246

9. Взаимодействие генаSRM5/CDC28 с checkpoint-генами RAD9, RADII, RAD24,RAD53 247

3. Взаимодействие между checkpoint-генами RAD9, RAD 17, RAD24 250

4. Взаимодействие гена RAD53 с ієнами RAD9, RAD17, RAD24 253

5 2.5 Взаимодействие гена SRM8/NET1 с checkpoint-генами RAD9, RAD17, RAD24,

RAD53 255

5.2 6 Взаимодействие гена SRM12/HFI1 с checkpoint-генами CDC28, RAD9,
RAD24,RAD53 257

5.3. Участие генов SRM в checkpoint-контроле 259

5 3 1 Влияние мутаций srm на остановку клеточного цикла в GO и G1/S под

действием УФ-света 260

5.3.2 Участие генов SRM8 и SRM12 в остановке деления клеток в фазе S под

действием гидроксимочевины 264

5.3 3 Ген CDC28 необходим для остановки клеточного цикла в фа^е G2 при
повреждении ДНК у мутантов cdc9-l и ссісб-1 при нспермиссивнои
температуре 268

5.3.4 Остановка деления клеток в фазе G2 при повреждении ДНК под действием
у-излучения 273

5.3.5 Влияние checkpoint-генов на мутабильность митохопдриального генома 277
5.4 Обсуждение 278

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 304

ВЫВОДЫ 306

ЛИТЕРАТУРА 308

Введение к работе

Изучение генетического контроля поддержания целостности геномов, как ядерного, так и митохондриального, является фундаментальной проблемой генетики В поддержании наследственного материала участвуют различные процессы, в том числе процессы восстановления от эндогенных и экзогенных повреждений ДНК, часто наблюдается корреляция между генетической стабильностью и радиочувствительностью. Изучение действия ионизирующих излучений на живые организмы и генетического контроля воздействия особенно актуально в связи с последствиями радиационных аварий и использованием радиации в диагностических и терапевтических целях.

Дрожжи сахаромицеты служат удобной моделью для анализа важнейших механизмов, действующих в клетках высших эукариот. Функциональные гомологи генов, ассоциированных с некоторыми заболеваниями человека, и многих генов, необходимых для репарации повреждений ДНК, вызванных ионизирующей радиацией в клетках человека, вначале были охарактеризованы у дрожжей (Resnick, Сох, 2000, Yu et al, 1999, Foury, 1997). Результаты анализа изменений экспрессии в масштабе іенома (genome-wide expression analysis) в ответ на изменения окружающей среды (DeRisi et al., 1997; Causton et al., 2001) и, в частности, на действие различных повреждающих агентов (Jelinsky et al., 2000), существенно расширяют возможности использования дрожжей в качестве модельного организма.

Систематический анализ делеционных мутантов выявил новые локусы, опосредующие у-чувствительность дрожжей (Bennett et al., 2001; Game et al., 2003) Идентифицированные іеньї разбиваются на группы ответственные за репликацию ДНК, генетическую рекомбинацию, ремоделирование хроматина, сегрегацию хромосом, checkpoint, транскрипцию, убиквитин-опосредованную деградацию белков, образование ядерных пор, поддержание клеточных стенок, активность аппарата Гольджи/вакуоли, цитокинез и активность митохондрий. Однако анализ делеционных мутантов имеет ограничения. Вне поля зрения остаются жизненно важные гены, для выделения которых необходимы иные подходы. Кроме того, при тотальном скринише возникают сложности с отбором генов слабо-чувствительных или снижающих жизнеспособность клеток. Часто именно такие гены оказываются регуляторными и являются многофункциональными и многомишенными, знание энзиматической функции которых недостаточно для понимания их роли в восстановлении клетки. Поэтому остается актуальным целенаправленное выделение и функциональный и генетический анализ отдельных генов.

При рассмотрении вопросов генетической стабильности и чувствиїельиости к повреждающим агентам, как правило, рассматривают повреждения ядерной ДНК. Однако

7 в клетке наследственный материал обнаруживается и в органеллах. К настоящему времени накоплен значительный объем сведений относительно механизмов, опосредующих стабильное поддержание хромосомного аппарата клеток Сведения по генетике поддержания наследственных структур оріанелл, в частности митохондрий, в целом более скромны. Для большинства эукариотических организмов митохондриальная ДНК (мтДНК) жизненно важна В частности, было показано, что делении, дупликации и точечные мутации мтДНК вызывают заболевания у человека (Grossman, Shoubndge, 1996; Howell, 1999; Larsson, Clayton, 1995; Wallace, 1999; Zeviani et al, 1997). Случаи, в которых мутантная мтДНК обнаруживается в культуре клеток вместе с нормальной немутантнои мтДНК определяют как гетероплазмию. Однако отношение двух митохондриальных гаплотипов часто изменяется в течение жизни индивидуума и может сильно отличаться между различными типами клеток. Обнаружено, что некоторые ядерные гены причастны к накоплению нескольких классов делетированных молекул мтДНК у одного и тою же индивидуума Несмотря на важность в фундаментальных и клинических исследованиях, факторы, ответственные за распределение между нормальными и мутантными молекулами мтДНК в процессе развития индивидуума, относительно слабо изучены. Только один из них в настоящее время клонирован и охарактеризован (Nishino et al, 1999) Он кодирует тимидин фосфорилазу, фермент, участвующий в катаболизме тимидина и возможно необходимый для поддержания мтДНК. Направление исследования роли ядерною генофона активно развивается (Dunbar et al., 1995).

Хотя на настоящий момент времени очень мало известно об ядерных генах, прямо или косвенно контролирующих поддержание мтДНК у высших эукариот, имеются многочисленные данные, касающиеся почкующихся дрожжей S cerevisiae, для которых характерна высокая частота выщепления дегенеративных митохондриальных мутанюв petite. Обзор этих данных содержится в главе 1 настоящей работы. У этого вида дрожжей развитие митохондриальной генетики и изучение ядерного контроля целостности и передачи мтДНК более доступно по двум причинам: 1) эти дрожжи являются факультативными аэробами, и 2) просты и доступны в смысле классической и молекулярной генетики. Несмотря на статус удобной модели их использование ограничено в связи с наличием свойств дрожжей 5 cerevisiae, которые отличают их от высших эукариот (одноклеточный организм, факультативный аэроб, не поддерживает стабильно гетероплазмическое состояние и структура их мтДНК значительно отличается от таковой для высших эукариот). Тем не менее, можно полагать, что, по крайней мере, некоторые ядерные факторы, контролирующие целостность и передачу молекул мтДНК консервативны в процессе эволюции. Понимание ядерно-митохондриальнот

8 взаимодействия у дрожжей может облегчить поиск соответствующих ядерных генов у высших эукариот.

Представления о функциональной значимости митохондрий в жизнедеятельности клетки постоянно расширяются. Большие усилия в настоящее время направлены на изучение роли митохондрий в апоптозе, запрограммированной і ибели клеток (Li et al, 1997). Внимание исследователей направлено также на изучение интеграции митохондрий в многочисленные клеточные процессы и динамику поведения в качестве субклеточной органеллы внутри клетки. Начинают вырисовываться механизмы репликации и экспрессии митохондриальною генома, но еще остается много вопросов в отношении возникновения мутаций, репарации и сегрегации мтДНК (Contamine, Picard, 2000). Главным достижением последних лет является понимание центральной роли мтДНК в некоторых заболеваниях человека. Наконец, расширяется ассортимент многочисленных антибиотиков с новыми мишенями, традиционно используемых для изучения биохимических механизмов в митохондриях. Таким образом, изучение стабильности митохондриального генома и роли митохондрий и ядерно-митохондриальных генетических взаимодействий в определении радиорезистентности и стабильности генома клеток представляет медицинский и общебиологический интерес.

Работа по идентификации ядерных генов (SRM - spontaneous rho~ mutability), необходимых для высокой мутабильности митохондриальною генома, и выяснение роли этих генов в жизнедеятельности дрожжевых клеток была начата около трех десятков лет назад. Исследования выявили наличие механизмов, одновременно оказывающих заметное влияние на митотическую стабильность различных генетических структур, митохондриальных и ядерных, природных и рекомбинантных; и связи этих механизмов с регуляцией прохождения клеточного цикла. В настоящей работе продолжено выделение новых іенов SRM. Для целенаправленного выделения мутаций, влияющих на генетическую стабильность различных наследственных систем, был разработан специальный селективный метод. Помимо изучения непосредственно і енетического контроля стабильности наследственных структур, сама генетическая стабильность использовалась в качестве инструмента для выделения генов, контролирующих радиочувствительность клеток дрожжей. Исследования, описанные в диссертации, впервые продемонстрировали тесную связь между изменчивостью митохондриального генома, поддержанием хромосом и радиочувствительностью клеток дрожжей, которая, как представляется, заслуживает специально! о исследования.

Введение митохондриальною генома в рассмотрение генетической стабильности позволяет усилить селекцию регуляторных генов. Поскольку репарация мтДНК

9 осуществляется в основном специфическими митохондриальными ферментами, то мутации влияющие на стабильность одновременно всех наследственных структур, ядерных и митохондриальных, скорее всею затрагивают регуляторные гены Действительно, нами впервые было показано участие генов, контролирующих локализацию деацетилазы (NET1), стабильность ацетилтрапсферазных комплексов {HFI1), а также жизненно-важною гена протеинкиназы CDC28, в поддержании целостности генома и контроле радиочувствительности. Влияние гена HFI1 на у-чувствительность было позднее обнаружено и при изучении делеционных мутантов (Bennett etal., 2001).

Известно, что существенный вклад в стабильность генома и определение радиочувствительности вносит репарация и checkpoint-контроль остановки клеточного деления. Значительный интерес исследователей к данному регуляторному механизму связан, в частности, с широко распространившимися представлениями о тесной связи между нарушениями checkpoint и малигнизацией клеток Несмотря на значительные успехи последних лет в этих исследованиях многие конкретные детали остаются неясными. У дрожжей S cerevisiae генетический контроль механизмов репарации и checkpoint наиболее изучен. Однако эпистатические взаимодействия checkpoint-генов, отражающиеся на у-чувствительности клеток, исследованы недостаточно. В настоящей работе среди генов SRM выделены новые гены, участвующие в этих процессах. Анализ взаимодействия между checkpoint-ієнами позволил выявить помимо остановки клеточного цикла их дополнительную роль в определении уровня радиочувствительности и охарактеризовать их принадлежность к путям, определяющим чувствительность клеток дрожжей к повреждающему действию ионизирующей радиации. Знание энзиматических активностей, определяемых выделенными генами, позволяет предположить, что обнаруженные іенетические и радиобиологические эффекты вызваны модификациями белков, в том числе, определяющих нуклеосомную структуру хромосом или нуклеоидную структуру мтДНК. Полученные данные хорошо вписываются в современные представления о молекулярных механизмах репарации и checkpoint, согласно которым для функционирования репарационных комплексов и комплексов, запускающих checkpoint, необходима предварительная модификация хроматина в области повреждения ДНК. Проверка высказанных предположений актуальна и открывает большие перспективы проводимых исследований.

Похожие диссертации на Регуляторные гены, опосредующие генетическую стабильность и радиочувствительность дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ЗАВИСИМОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЕМ МУТАГЕНЕЗА У SACCHAROMYCES CEREVISIAE ОТ ФАЗЫ РОСТА И ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛАЧепурной, Александр Иванович

Сравнительный анализ биологических эффектов нейтронных пучков ядерных реакторов при непрерывном и импульсном режимах облучения у клеток дрожжей SaccharomycesКомарова Елена Владимировна

Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeШабельская Светлана Васильевна

Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРябинкова Наталья Анатольевна

Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРогоза, Татьяна Михайловна

Молекулярно-генетический анализ функций гена HSM3 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeЧерненков, Андрей Юрьевич

Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей Saccharomyces CerevisiaeМоскаленко Светлана Евгеньевна

Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeКиктев Денис Александрович

Регуляция транскрипции генов теплового шока у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeЕркин, Александр Михайлович

Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastorisГрадобоева Анастасия Евгеньевна