Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование структурно-функциональных нарушений генома в клетках человека и животных, подвергнутых воздействию ионизирующими излучениями (ИИ), остается актуальной проблемой. Многие основополагающие исследования по данной проблеме проводятся, ориентируясь на важнейшую мишень радиационного поражения - ядерную ДНК (яДНК). Однако, хорошо известно, что в клетках млекопитающих, кроме я ДНК, содержатся и множество копий митохондриальной ДНК (мтДНК). В настоящее время рассматривается, что мтДНК является более уязвимой мишенью клетки, по сравнению с яДНК, для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [LeDoux, Wilson, 2005; Wallace et al., 2010].
МтДНК в структурной организации и функционировании имеет ряд особенностей, отличных от яДНК. Так, мтДНК содержит гены, кодирующие белки системы дыхательной цепи [Shadel and Clayton, 1997; Falkenberg et al, 2007]. Для нее характерна повышенная мутабильность, благодаря повреждениям, индуцируемым активными формами кислорода (АФК), генерируемыми в самих митохондриях и ошибками репликативного синтеза [Graziewicz et al., 2006; Larsson, 2010]. В тканях (в том числе в постмитотических тканях мозга, сердца, скелетных мышц) мтДНК может реплицироваться независимо от клеточного цикла в течение всей жизни организма [Wallace 2005; Falkenberg et al., 2007]. Результаты многих исследований показывают, что в мтДНК возникает в 3-50 раз больше повреждений, чем в соразмерном фрагменте яДНК, при воздействии на клетки ИИ, химических мутагенов [Marcelino., Thilly , 1999; Газиев, Шайхаев, 2008]. Процессы репарации ДНК в митохондриях клеток функционируют недостаточно эффективно [Газиев., Подлуцкий, 2003; Stuart., Brown, 2006; Gredilla et al., 2010]. Если репликация поврежденной яДНК блокируется индуцибельной системой контроля точек хода клеточного цикла до завершения ее репарации, то эта система не блокирует репликацию поврежденной мтДНК в митохондриях [Cleaver, 1992; Kulawiec et al., 2009]. Возможно, именно по этим
причинам в мтДНК наблюдается накопление мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК [Marcelino., Thilly , 1999; Khrapko, Vijg, 2009], с которым связаны клеточная гибель, нестабильность генома [Skulachev, 2006; Norberg et al, 2010].
Вместе с тем, хотя в радиобиологических исследованиях много внимания уделяется радиационному нарушению энергетического метаболизма, сведения по радиационному мутагенезу мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся воздействию ИИ на уровне целого организма, в литературе ограничены и противоречивы.
Стабильность и сохранение митохондриального генома, изменение количества копий мтДНК (дозы генов мтДНК) в клетках играют важную роль в адаптации человека к различным условиям внешней среды. С нарушениями мтДНК ассоциируются широкий спектр заболеваний, ослабление функций тканей, нарушения иммунной системы, развитие опухолевых патологий, старения [Schapira, 2006; Koene, Smeitink, 2009; Wallace, Fan, 2009; Krishnan, Turnbull, 2010; Baines, 2010; Shutt, Shadel, 2010]. Поэтому, исследование возникновения, аккумуляции мутантных копий мтДНК и изменения количественного содержания копий мтДНК в клетках тканей организма млекопитающих, подвергнутых воздействию ИИ, представляется актуальным и востребованным.
Цель исследования:
Цель исследования состояла в определении уровня мутантных копий мтДНК и общего содержания копий мтДНК в тканях и в плазме крови мышей, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения.
В задачи работы входило:
Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК тканей мышей.
Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей в пострадиационный период.
3. Определение динамики изменения количества внеклеточных мутантных копий и общего содержания копий мтДНК, относительно ядерной ДНК, в плазме крови мышей в пострадиационный период.
Научная новизна работы.
Адаптирован и впервые применен метод, основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК с неспаренными основаниями, для выявления мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ in vivo. Сравнение результатов, получаемых CEL- I эндонуклеазным методом и TTGE-методом (temporal temperature gradient gel electrophoresis -метод) показало, что первый метод более чувствителен, он позволяет анализировать большое количество образцов, дает воспроизводимые результаты и экономичен.
В работе впервые установлено, что в клетках тканей (головной мозг, селезенка) мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения, резко возрастает уровень мутантных копий мтДНК с максимумом на 8-й день после облучения и последующим снижением их содержания к 28-у дню пострадиационного времени.
Мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, как и мутагенез ядерных генов (литературные данные), имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения (в пределах 1-5 Гр). Результаты анализов мутантных копий мтДНК головного мозга и селезенки облученных мышей показывают снижение количества мутантных копий мтДНК в пострадиационный период. В ткани селезенки этот процесс происходит более активно, чем в ткани головного мозга. Вместе с тем, общее количество копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, определяемое относительно гена яДНК методом ПНР в реальном времени (ПЦР-РВ), остается в течение всего пострадиационного времени (8-28 дней) без изменения, хотя и ниже на 25-40% данных контрольной группы (при дозе облучения 5 Гр).
В данном исследовании впервые установлено, что в кровоток облученных мышей в течение пострадиационного времени поступает большое количество
циркулирующей вк-мтДНК, существенная часть которой представлена мутантными копиями. Уровень вк-мтДНК с мутациями в плазме крови мышей зависит от дозы их облучения. Динамика изменения общего содержания циркулирующей вк-мтДНК и уровня ее мутантных копий в плазме облученных мышей отличается от таковой в тканях селезенки и мозга этих же животных. Увеличение содержания мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей совпадает со снижением их уровня в тканях этих же животных. Повышенное содержание мутированных вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей свидетельствует об их активной элиминации из клеток тканей в пострадиационный период.
Практическая ценность работы. Результаты исследования радиационного мутагенеза мтДНК и изменения уровня мутантных копий мтДНК в тканях облученных животных в пострадиационной период существенно дополняют знания о механизмах развития лучевой реакции организма. Полученные результаты и использованные методические подходы могут быть применены в дальнейших экспериментальных исследованиях и в клинической практике при радиотерапии опухолей.
Важным результатом, ориентированным на практическое использование, является обнаружение повышенного уровня мутантных копий вк-мтДНК и увеличения содержания общей мтДНК в плазме облученных животных. Поскольку мтДНК является более уязвимой мишенью (чем яДНК) для ИИ и других генотоксических агентов, то повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями в плазме крови мышей после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для оценки радиационного поражения и наличия генотоксического груза.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.); на конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии» (Санкт-Петербург, 2008 г.); на конференции «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (Дубна, 2009
г.); на XVI Международной научной конференции молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009 г.); на Симпозиуме «Пространственно-временные эффекты в радиационной биологии (Испания, Сант Фелиу де Гишолс, 2009); на 37-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Прага, 2009); на III Евразийском конгрессе по медицинской физике «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской физики и инженерии» (Москва, 2010); на 38-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Швеция, Стокгольм, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе, 5 статей в журналах из списка ВАК и 15 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 221 источников литературы.
