Введение к работе
Актуальность работы. Лимфоциты периферической крови циркулируют во всех тканях организма, являясь носителями многих физиологических функций. Облучение, химические вещества экзогенной и эндогенной природы, вирусы воздействуют на геном, вызывая повреждения. В ответ клетки вовлекают три процесса: задержку клеточного цикла, репарацию ДНК и гибель [Imyanitov et al., 2005]. Для того, чтобы правильно оценить действие повреждающих агентов, и в частности, облучения, используют цитогенетические методы, благодаря довольно точным и повторяющимся результатам [Amundson et al., 2001; Mettler and Voelz, 2002; Leonard et al., 2005; Sevan’kaev et al., 2005; Levy et al., 2007]. Однако широко используемый в целях радиационной диагностики метод определения числа дицентрических хромосом имеет ряд недостатков [Edwards et al., 2005; Lamadrid et al., 2007]. При облучении в малых дозах он информативен только при анализе большого числа метафаз [Voisin, 2001, 2004]. В отдаленные сроки часть дицентрических хромосом элиминируется, снижая тем самым реальную дозу облучения [Рубинович и соавт., 2006; Wang et al.,2007]. Кроме того, после облучения, вирусных инфекций, а также с возрастом происходит уменьшение размера теломер, что увеличивает число теломерных ассоциаций и приводит к числу ложноположительных случаев [Stewenius et al., 2005; Sguara et al., 2006; Castella et al., 2007; MKacher et al., 2007]. Флуоресцентная in situ гибридизация - один из наиболее точных методов для обнаружения облученности организма. Он лишен ряда недостатков предыдущих методов, так как позволяет регистрировать стабильные аберрации, которые сохраняются в течение длительного периода [Sorokine-Durm et al., 2000; Camaparoto et al., 2003]. Кроме того, метод может быть использован для выявления микротранслокаций [Bauchinger et al., 2001; Tucker, 2001; Pouget et al., 2004; Durante et al., 2004; Edwards et al., 2005; Szeles et al., 2006]. Как правило, для определения факта облученности используют библиотеку генов нескольких хромосом с последующим пересчетом выявленных повреждений на весь геном [Lucas et al., 1993]. Однако такой пересчет не всегда бывает адекватным, так как хромосомы имеют разную радиочувствительность за счет длины теломер, экспрессии генов, наличия общих ломких сайтов и т. д. [Martin-Subero et al., 2002; Narath et al., 2005; Lamadrid et al., 2007]. Все эти проблемы можно решить при использовании мультиколорного FISH [Braselman et al., 2005]. Однако высокая стоимость метода и большая трудоемкость не могут способствовать широкому внедрению метода в практику [Pouzoulet et al., 2007].
В последние годы благодаря своей простоте достаточно широкое распространение, наряду с методом анализа хромосомных аберраций (ХА), получил метод анализа микроядер (МЯ) [Fenech, 1997, 2000, 2006; Miller et al., 2007]. В течение ряда лет дискутируется вопрос об эквивалентности этих двух методов для биологической дозиметрии [Bhat and Rao, 2003; Edwards et al., 2004; Fenech, 2006; Hatayoglu and Orta, 2007]. Оба показателя имеют в определенном диапазоне доз линейную или линейно-квадратичную зависимость. При этом спонтанный уровень МЯ выше, и по своей чувствительности к радиации этот метод несколько уступает методу анализа ХА. Возможно, причина кроется в механизме формирования МЯ [Tanaka et al., 2000; Norppa and Falck, 2003; Thomas et al., 2003; Fenech, 2007].
Известно, что структура и количество хромосом должны оставаться постоянными в течение жизни, поэтому многие изменения, возникшие в результате повреждающих воздействий, элиминируются из организма. Некоторые остаются в течение многих лет, формируя состояние генетической нестабильности [Paz-y-Mino et al., 2001; Kawamura et al., 2004; Rossner et al., 2005]. Изменения в геноме лимфоцитов могут происходить при физиологическом старении [Blasco, 2005; Gerdes et al., 2005; Zijno et al., 2007] и старении, вызванном воздействием различных агентов, в том числе и радиацией [Любимова и Воробцова, 2007; Krishnaja and Sharma, 2006; Suzuki et al., 2007]. Наличие генетических перестроек в геноме опухолей является хорошо доказанным фактом. В настоящее время установлено, что 90% всех опухолей человека имеют цитогенетические повреждения. Однако до сих пор не ясно, являются ли эти повреждения причиной или следствием формирования опухоли. Имеются данные о том, что неправильное расположение генетической информации может привести к серьезным нарушениям в состоянии здоровья человека, даже если ни один из участков хромосом не утерян [Tefferi et al., 2005; Kreskova et al., 2007].
Цель исследования: в клинико-экспериментальных исследованиях оценить повреждения генома лимфоцитов при развитии патологических состояний, вызванных воздействием радиации в сравнении с другими повреждающими факторами.
Основные задачи исследования:
-
Изучить частоту хромосомных аберраций (ХА) и микроядер (МЯ) в лимфоцитах периферической крови после облучения in vitro.
-
Выявить зависимость индукции апоптотических лимфоцитов при облучении проб крови человека in vitro и лабораторных животных in vivo.
-
Выявить дозовую зависимость стабильных ХА у человека и обезьян методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
-
Исследовать влияние облучения на уровень ХА и МЯ у больных с нарушением тиреоидного гомеостаза.
-
Провести сравнительный анализ ХА и МЯ у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС
-
Исследовать цитогенетические изменения у детей, рожденных у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС
-
Определить характер повреждений генома лимфоцитов у больных с хроническим гепатитом С.
-
Установить особенности формирования хромосомных повреждений у лиц, участвующих в ликвидации химического оружия.
-
Изучить распределение ХА в лимфоцитах периферической крови больных с различными формами лимфом.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Исследование генома лимфоцитов периферической крови при различных патологических состояниях, вызванных действием радиации, вирусов, химических веществ, при условии нарушения тиреоидного гомеостаза, при лимфомах выявляет развитие сходных изменений цитогенетического статуса лимфоцитов, проявляющихся в формировании ХА и МЯ. Характер и выраженность цитогенетических проявлений экстремальных воздействий на лимфоциты определяются видом действующего фактора, его дозой, временем воздействия, а также степенью нарушения гомеостаза организма.
-
Сравнение дозовых зависимостей радиационно-индуцированных ХА и МЯ, аппроксимирующихся линейно-квадратичными уравнениями, выявляет их различия по линейной и квадратичной компонентам. Количество повреждений в хромосомах не зависит от длины хромосомы. Образование МЯ нельзя однозначно ассоциировать с ацентрическими фрагментами.
-
Лимфоциты периферической крови (ЛПК) аккумулируют полученные в результате действия облучения и других вредных факторов повреждения в виде стабильных ХА и сохраняют их в течение ряда лет. Если такие повреждения образуют клон, они становятся потенциальным источником образования гемобластозов и могут быть выявлены с помощью цитогенетических методов.
Научная новизна. При сравнительном исследовании двух цитогенетических методов на большой группе участников ликвидации в разные сроки после аварии на ЧАЭС, в том числе в течение первого месяца после воздействия, впервые установлено, что:
а) микроядерный тест с использованием цитокалазина В позволяет оценивать поглощенную дозу облучения с погрешностью, эквивалентной определению ее по уровню ХА, начиная с дозы 0,1 Гр;
б) наличие двуядерных лимфоцитов с двумя и более МЯ позволяет регистрировать дозу облучения, начиная с дозы 0,25 Гр;
в) отсутствие корреляции между дозовой зависимостью числа МЯ и частоты ХА не позволяет отождествлять МЯ с ацентрическими фрагментами;
г) МЯ, образованные в процессе митоза и в процессе апоптоза, не отличаются по морфологическим критериям, выявленным на световом и электронно-микроскопическом уровне исследования.
При сравнительном исследовании кривой доза-эффект, полученной методом FISH для ЛПК обезьян и человека, установлено, что для корректного определения дозы облучения необходимо использовать не менее трех ДНК-зондов для целых хромосом. Гибридизация хромосом 1, 4 и 13 человека с хромосомами 1, 4 и 16 обезьян позволяет использовать их для определения дозы облучения in vivo.
Установлено, что радиация вызывает зависимое от дозы увеличение суммарного числа МЯ и ХА, при этом число дицентрических хромосом более чем в два раза ниже числа МЯ при соответствующих дозах облучения. Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме формирования МЯ. Длительный прием трийодтироксина приводит к достоверному увеличению числа ХА. Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С появляются маркерные хромосомы и клональные разрывы.
Практическая значимость работы заключается в получении новых фактов о закономерностях процесса апоптотической гибели лимфоидных клеток в нормальных физиологических условиях и при лучевом воздействии, на основе которых разработан метод быстрой диагностики лучевых повреждений. Предложенный метод анализа апоптотических (или аномальных) ядер имеет ряд преимуществ перед анализом частоты МЯ, так как экономит время за счет отсутствия культивирования и может быть применен при аварийных ситуациях для сортировки больших групп людей на облученных и необлученных. Впервые использованы ЛПК с целью диагностики цитогенетических повреждений при лимфомах и доказана их диагностическая значимость для клинических исследований.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзной конференции “Радиобиологические последствия аварии на ЧАЭС” (Минск, 1991), 2-м радиобиологическом съезде (Киев, 1993), (25-th Annual Meeting of EEMS (Стокгольм, 1995), New Activities of WHO Collaborating (Монпелье, 1996), интернациональной конференции по радиационной биологии “Повреждения ДНК, репарация и канцерогенез” (Индия, 1998), Всесоюзной конференции “Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний” (Адлер, 1999), международной конференции по цитогенетике опухолей (Париж, 2001), Российско-голландской научной конференции “Диагностика и лечение лимфом” (СПб., 2002), международной конференции “Гемобластозы: диагностика и лечение” (СПб., 2003), научной конференции “Биологическая защита” (СПб., 2006), международной конференции “Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в экспериментах на обезьянах” (Адлер, 2007), 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (СПб., 2008),
Диссертация апробирована на совместном совещании кафедр военной токсикологии и медицинской защиты, военно-полевой терапии, клинической биохимии, НИО отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ 29 января 2008 г. (протокол № 10).
Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебную, научную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники Военно-медицинской академии и ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий». На основании полученных данных выпущены методические рекомендации “Использование микроядерного теста для индикации пострадиационных эффектов у человека” (М: Минздрав, 1993), “Диагностическая значимость цитогенетических повреждений при лимфомах” (СПб.: ВМедА, 2000), “Диагностическая значимость цитогенетических показателей при миелопролиферативных заболеваниях” (СПб.: ВМедА, 2000), сделаны 3 рационализаторских предложения, получено авторское свидетельство на изобретение № 310946.
Личный вклад автора. Автором лично выполнены цитогенетические исследования для построения дозовых кривых для МЯ и ХА, для стабильных ХА, выявленных методом FISH, и цитогенетические исследования больных со злокачественными лимфомами, статистическая обработка, обобщение результатов исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 7 разделов собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 501 источника (в том числе 49 источников на русском языке и 452 источника на иностранных языках). Работа включает 22 таблицы и 27 рисунков.
