Введение к работе
Актуальность. В последнее десятилетие отмечается . четкая тенденция роста заболеваемости и смертности от болезней, легких (Чучалин А.Г. , 1991). Наряду с этим прогресс хирургической техники, развитие трансплантологии требует уточнения возможностей компенсации утраченных тканей и обеспечение анатомической состоятельности пересаженного органа. В этих условиях особую значимость приобретают исследования механизмов регенерации поврежденного легкого и способов регуляции восстановительных реакций организма. Различные аспекты проблемы регенерации постояннно изучаются. Установлено, что при заживлении ран легкого в кесте дефекта может формироваться непропорционально малый рубец (Давыдовский И.В., 1969, Montgomery G.L., 1944). В работах Есиповой И.К.(1976), Биркун А.А.(1981), Романовой Л.К. (1984), Ерохина В.В. (1987).показано, что легкие -(многокомпонентный орган со способностью регенерировать за счет митотического деления основных клеточных элементов эпителиальной выстилки бронхов и альвеол. Особенно важное значение имеет изучение состояния альвеолоцитов 2 типа, которые учавствуют в формировании эпителиальной выстилки альвеол и секретируют сурфактант. Исследуя закономерности пострезекционной гипертрофии легких, Романова Л.К. считает перспективным изучение условий, способствующих сокращению продолжительности деструктивно-реактивной фазы регенерационных реакций и обеспечивающих полное восстановление ультраструктур поврежденных клеток. Принципиально важным является уточнение характера клеточных и внутриклеточных источников репаративной регенерации легкого. Положения Саркисова Д.С. (1987) о внутриклеточной регенерации и гиперплазии ультраструктур, являющихся структурными основами адаптации и компенсации нарушенных функций, внесло существенный вклад в наше понимание процессов взаимодей-
ствия и взаимовлияния структуры и функции поврежденной клетки. В области изучения ультраструктурных основ патологии клеток легкого достигнуты определенные успехи. Однако исследование молекулярных механизмов регенерации поврежденных клеток находится пока на стадии накопления отдельных фактов. Анатомические особенности легких диктуют необходимость изучения прежде всего мембранозависимых процессов. Известно, что ряд важных функций легких регулируется адренергическои и холинергической рецепцией (Голиков С.Н., 1985; Сыромятникова Н. В., 1987: Широков Ю.А., Долго-Сабуров В.Б., 1989; Bruch R..Thayer W. .1983: Jackson M., Jones D., 1984). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению в основном адренергических рецепторов, вопрос о спектре нейрорецепторов паренхимы легких при различных патологических состояниях- и принципах их взаимодействия остается нераскрытым. Исследование рецепторов легких является многообещающим также, с точки зрения пептидергической регуляции рецепторных каскадов в клетках-мишенях. Одним из ценных методов изучения механизмов регенерации является культура ткани (Мэттсон П.. 1982). Исследование морфокинетики клеточных элементов в культуре переживающих легочных эксплантатов при туберкулезе, раневом процессе показало, что метод воспроизводит особенности межклеточных взаимодействий, свойственных той или иной паталогии (Куничан А.Д., 1974: Буроє А.А., 1981; Корнилова З.Х., Зурабян М.С., 1991). Возможность подсчета клеточных элементов, выселяющихся из культивируемого кусочка легких, позволяет дать количественную оценку.регенера-ционных потенций поврежденного легкого in vitro. Наряду с этим с помощью метода первичной эксплантации легких можно изучить действие лекарственных средств, регулирующих репаративные процессы в органе, и подобрать их оптимальные дозы. Возбудить и изменить функцию клеток способно значительное число природных средств, но наибольший интерес представляют регуляторные пептиды в связи с их участием в различных физиологических процессах организма с обеспечением многих жизненно важных функций. В настоящее время создан массив информации об эндогенных олиго-петидах, разработана их классификация по первичной структуре
(Замятнин А.А., 1991X Исследованиями последних лет установлено, что легкие являются пептидергической системой, продуцирующих довольно широкий спектр пептидных соединений ССыромятнико-ва Н.В. , 1987: Чучалин А.Г., 1989: Булгаков С.А., Гомогоров И.В.,1991: Barnes P.J., 1984, 1987; Barta V.K. et al., 1990). Синтезированные отечественные пептиды бокбезин, даларгин, фактор роста нервов, карнозин рассматриваются в .качестЕз потенциальных лекарственных средств. Однако недостаточно изучена биологическая активность исследуемых соединений, не определены условия их введения и оптимальные дозы.
Неменьший интерес представляют липиды. В исследованиях Singh G., Kotyal S. С1980) показано, что липиды, депонируемые из крови, а также из перфузата, используются легкими для синтеза сурфактанта. По данным Shelley S.A., (1982) поверхнос-гно-активная фракция сурфактанта состоит на 80 % из фосфати-цилхолина и на 8 % из фосфатидилглицерола. Источник фосфолипи-цов - альвеолоциты 2 типа, которые пополняют запасы собствен--юго фосфатидилхолина за счет экзогенных липидов (Finkelstein J.M., 1983). Наряду с этим липиды, являясь одним из основных сомпонентов клеточных мембран, выполняют регулирующую роль в іроцессах .перекисного окисления липидов (Бурлакова Е.Б., L990). Вышеизложенное позволяет рассматривать липиды в качес-гве ценного лекарственного средства при любых повреждениях іегких. В настоящее время уже имеются несколько препаратов на тапидной основе, которые с успехом используются при гепатите, :ахарном диабете, бронхите ( Швец В.И., 1990). Поэтому іальнейшая разработка лекарственных препаратов на основе раз-шчных комбинаций липидов с подбором доз и оптимальных усло-іий их введения является весьма перспективной.
Таким образом, исход восстановления поврежденных легких )ависит от суммарного взаимодействия различных регулирующих :истем. В связи с этим представляется важным выявление нанбо-іее активных клеточных и внутриклеточных источников регенерати поврежденного легкого, определение состояния органелл кле-ок паренхимы легкого в процессе восстановления, сопоставле- [ іие этих данных с состоянием рецепции легких при различных па- і
_ 4 -
тологических состояниях, создание условий наиболее благоприятного течения компенсаторно-восстановительных реакций организма путем использования различных комбинаций эндогенных регуляторних веществ. Решение этих задач актуально и значимо, так как в конечном итоге направлено на ликвидацию последствий повреждения и обеспечение выздоровления. Цель исследования :
- изучение механизмов регенерации поврежденного легкого и
регуляция этих процессов с помощью пептидов и новых
комбинаций природных эндогенных соединений.
Задачи исследования :
разработка экспериментальных моделей ран легкого на мелких животных;
изучение процессов заживления поврежденного легкого на ультраструктурном уровне:
выявление наиболее активных клеточных и внутриклеточных источников регенерации поврежденного легкого:
изучение динамики морфокинетических параметров клеточных элементов в культуре поврежденных легких:
изучение адрененергических и М-холинергических рецепторов паренхимы легкого при раневом процессе,- туберкулезе, пневмонии и раке:
проведение скрининга среди ряда амнокислот, пептидов, фосфолипидов по качеству их ростостимулирующего влияния на процессы заживления поврежденного легкого и отбор наиболее эффективных из них:
изучение биологической активности карнозина, фосфати-дилхолина 80-90% чистоты и смеси липидов, которая содержит 45-50% фосфатидилхолина, 30% фосфатидилэтанола-мина и в качестве минорных компонентов холестирин и сфингомиелин,а также смеси карнозина и фосфолипидов, оценка эффективности их различных концентраций".
Научная новизна. На клеточном, ультраструктурном и молекулярном уровнях установлено взаимозависимое участие всех клеточных элементов в процессах заживления паренхимы легких. Наиболее активны при восстановлении поврежденного легкого альвео-
лоциты 2 типа, обеспечивайте регенерацию альвеолярной выстилки и продукции сурфактанта легких. Установлены морфокинетичес-кив пграызтры клеточных популяций в культура легких при раневой процессе и выяснены условия, необходимые для сохранения продолжительности фазы некротических реакций, а именно, увеличение в зона повреждения числа лимфоцитов и их контактов с макрофагами, усиление пролифэративнол активности фибробластов. Показана корреляционная зависимость между структурными нарушениями и изменениями в состоянии нейрорецепции клеток паренхимы легких: чем вырагязннее анатомические повреждения легких, тем значительнее падение числа адренергических рецепторов и тенденция повышения числа М-холинорецепторов. Выявлена стереотипность рецепторных нарушений при раневом процессе, пневмонии, туберкулезе, что свидетельствует о единстве патофизиологических неханизжв развития болезни, а, следовательно, некоторых подходов в их лечении. Впервые установлено сопряженное изменение^-адренорецепторов и М-холинергических рецепторов при раке, раскрьзахкее один из механизмов активации клеточной пролиферации.
. Разработано новое направление фармакологической регуляции восстановительных процессов в легком'с помощью природных эндогенных соединений. Осуществлен подбор препаратов с учетом метаболических потребностей поврежденного легкого. Впервые при повреждении легкого применены фактор роста нервов, инсулин, даларгин, карнозин и комбинация карнозина с липидами. Обоснованы иммуномодулирувдие и ростостимулирующие свойства карнозина, проявлявшиеся в ускорении заживления поврежденного легкого в 2 раза с формированием нежного рубца. Доказано, что липи-' ды по сравнению с карнозином способствуют значительному снижению явлений эмфиземы и септального отека в околораневой зоне. Смесь карнозина и Фосфолипидов обеспечивает наиболее полноценное восстановление архитектоники легкого.
Теоретическая значимость.
- построена логическоая цепь исследования от структуры к функции: поврежденное легкое -> оценка структурных нарушений на уровне тканевых процессов, клеток и клеточ-
- б -
ных органелл -> состояние нейрорецепторов легких -> регуляция клеточного метаболизма с помощью пептидов, ли-пидов;
выявлены обшие закономерности изменения нейрорецепторов легких при различных патологических состояниях".
изучено влияние карнозина HaJJ-адренорецепторы и активность аденилатциклазы при заживлении раны легкого -первая попытка анализа взаимодействия пептида с нейро-рецепторами легких;
изучены механизмы лечебных эффектов пептидов как-то активация пролиферации фибробластов, усиление клеточной и внутриклеточной регенерации поврежденных легких, появление ассоциации иммунокомпетентных клеток.
Положения, выносимые на защиту. В процессе регенерации поврежденного легкого принимают зависимое участие клеточные элементы паренхимы легких и периферической крови. В раневом дефекте активны альвеолярные макрофаги, лимфоциты и фиброблас-ты в краях его - альвеолоциты 2 типа и эндотелиоциты. Наиболее полноценная регенерация поврежденных легких возможна при условии усиления активности иммунокомпетентных клеток, восстановления цитофосфолипосом альвеолоцитов 1 типа и повышения пролиферативной способности фибробластов.
Имеется параллелизм реакции in vitro и in vivo. .В культуре поврежденных легких также наиболее активны макрофаги, лимфоциты и фибробласты. Показана возможность пептидергической регуляции процессов заживления in vitro и ее регистрации по активности иммунокомпетентных клеток и фибробластов.
Структурные изменения (степень выраженности воспаления и пневмосклероза) в паренхиме легких коррелируют с изменениями адренергической и холинергической рецепции. Стереотипность ре-цепторных нарушений при различных повреждениях и патологических состояниях свидетельствует о единых патогенетических подходах в координации этих "нарушений..
Для лечения ран легкого использованы аминокислоты, пептиды, обладающие белковосинтазирущими свойствами, а также фос-фолипиды, способствующие стабилизации альвеол. Выделены, как
наиболее эффективные, карнозин, фосфолипиды. Создан новый препарат на основе комбинации карнозина и смеси фосфолипидов с высокой биологической активностью, ускоряющий процесс заживления экспериментальной раны легкого в 2 раза. ; Практическая ценность. Разработана модель колото-резаной и операционной ран легкого на мелких животных с 98-100% выживаемостью их. Предложена новая методика комбинированного эндотра-хеального наркоза с предварительной атропинизацией и использованием смеси эфира и гексенале или тиопентала, или калипсола. Созданы атравматические легочные щипцы для проведения хирургических вмешательств на мелких животных, получено авторское, свидетельство N 48014000/14 (015127).
Установлены качественные и количественные клеточные характеристики процесса заживления с помощью культивирования легочных эксплантатов, что может найти применение в клинической медицине, особенно в связи с развитием эндоскопических исследований и возможностью культивирования биопсийного материала. Разработана тест-система для оценки действия лекарственных препаратов, в частности, пептидов на клеточном уровне. Определены оптимальные дозы карнозина. Разработана новая группа лекарственных препаратов на основе природных соединений, оценена их специфическая активность, проведены доклинические исследования. На два препарата подготовлены документы для фармакологического комитета. На три средства получены авторские свидетельства. Продолжается разработка новых препаратов на основе карнозина.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на рабочем заседании кафедры биохимии МГУ "Компоненты аденилатциклаз-ной систеш" (Москва, 1985), на ученом совете МНИИТ МЗ РСФСР (Москва, 1986). на конференции, посвященной открытию Российского общества пульмонологов (Москва. 1986), на рабочем совещании морфологов по экспериментальной фтизиатрии (Москва, 1986), на III межвузовской конференции "Перспективы проведений совместных научных исследований МГУ и ММА" (Москва, 1987), на рабочих заседаниях кафедры биохимии МГУ, посвященных изучению свойств карнозина и его влияния на различную патологию
(Москва, 1987 - 1990), на научно - практической конференции врачей-пульмонологов (Барнаул, 1989). на Всесоюзном симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторних пептидов" (Нижний Новгород, 1990), на Всесоюзной конференции "Местное лечение ран" (Москва, 1991), на Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (Челябинск, 1991), на Всесоюзной конференции биохимиков "Карнозин: биологическая роль и применение в медицине" (Москва, 1992), на Всесоюзном съезде химиков " Антиоксиданти и их применение в медицине" (Москва, 1992), на совещании "Мэрфоген - III" ИБК-РАН (Пушино, 1992).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 20-ти опубликованных работах и 4-х авторских свидетельствах.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 209 страницах машинописного текста и состоит из"введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Во введении отражены актуальность проблемы, цель, задачи, научная и теоретическая значимость работы. В 1 главе наряду с описанием методов исследования дан первичный анализ собственного материала. Все остальные главы построены по единому принципу - краткий обзор по тематике и изложение полученных данных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 100 рисунками. Библиография : 310 названий. Идея и общий план настоящего исследования были предложены академиком РАЖ Перельманом М.И.. В-выполнении работы принимал участие большой научный коллектив: Приймак А.А., Соловьева И.П., Бойков А.К., Пауков B.C., Селищева А.А., Бу-
