Содержание к диссертации
Список сокращений 6
Введение 8
Глава 1. Представления о биотрансформации ксенобиотиков (обзор
литературы) 17
Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы - 1 фаза биотрансформации ксенобиотиков 18
Реакции конъюгации - 2-я фаза биотрансформации ксенобиотиков 23
Система антирадикальной и антиперекисной защиты , 26
Роль процессов ПОЛ в метаболизме ксенобиотиков 29
Влияние химических веществ на состояние систем биотрансформации в печени 32
Цитохром Р450 и диоксиноподобные соединения 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Экспериментальное исследование влияния ТХДД на состояние
изучаемых систем и процессов 43
Экспериментальные исследования влияния ППУ на состояние изучаемых систем и процессов 46
Обследование персонала, контактирующего в производственных условиях с ППУ ..50
Обследование пожарных, участвовавших в ликвидации пожара на АО "Иркутсккабель" в 1992 году 52
Краткая характеристика пожара и его влияния на здоровье пожарных 52
Методы обследования пожарных (1999-2002 годы) 57
Методы обследования пожарных (2002-2005 годы) 58
2.5. Статистическая обработка результатов 63
Глава 3. Экспериментальное исследование влияния диоксинов и содержащего их комплекса токсических соединений на состояние процессов
биотрансформации ксенобиотиков 65
3.1. Исследование состояние микросомных монооксигеназ в условиях
воздействия ТХДД 65
3.1.1. Исследование состояние микросомных монооксигеназ в условиях 20-
кратного воздействия ТХДД 65
3.1.2. Исследование состояния процессов пероксидации в условиях 20-
кратного воздействия ТХДД 67
3.1.3. Исследование влияния ТХДД на состояние процессов
биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс в условиях 4-кратного
воздействия 68
3.2. Исследование влияния ТХДД и содержащего его комплекса токсических
веществ на состояние процессов биотрансформации ксенобиотиков 72
Изучение первичных и отсроченных эффектов ТХДД и комплекса токсических веществ на микросомные монооксигеназы печени крыс 72
Изучение первичных и отсроченных эффектов ТХДД и комплекса токсических веществ на состояние 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков печени крыс 76
Изучение первичных и отсроченных эффектов ТХДД и комплекса токсических веществ на состояние процессов пероксидации в печени крыс 78
Изучение первичных и отсроченных эффектов ТХДД и комплекса
токсических веществ на состояние порфиринового обмена 80
Глава 4. Изучение влияния предельных полициклических углеводородов на состояние системы биотрансформации липофильыых ксенобиотиков в печени
экспериментальных животных 85
4.1. Изучение воздействия МЦП на системы биотрансформации
ксенобиотиков в печени 85
Влияние МЦП на состояние монооксигеназной системы и процессы пероксидации в микросомах печени крыс в условиях in vitro 85
Влияние МЦП на состояние микросомных монооксигеназ печени крыс
в условиях острого внутрижелудочного отравления 87
4.1.3. Исследование возможности метаболизма МЦП в полной
гидроксилирующей системе микросом печени крыс 90
4.1.4. Влияние МЦП на состояние процессов пероксидации в печени крыс в
условиях острого внутрижелудочного отравления 92
4.1.5. Изучение влияния модификаторов микросомных монооксигеназ и
антиоксидантов на токсические свойства МЦП 95
4.2. Изучение воздействия ТГДЦПД на системы биотрансформации
ксенобиотиков в печени... 99
Влияние ТГДЦПД на состояние монооксигеназной системы и процессы пероксидации в микросомах печени крыс в условиях in vitro 99
Влияние ТГДЦПД на состояние микросомных монооксигеназ печени крыс в условиях острого внутрижелудочного отравления 101
4.2.3. Исследование возможности метаболизма ТГДЦПД в полной
гидроксилирующей системе микросом печени крыс 103
4.2.4. Изучение влияния модификаторов МОГС и антиоксидантов на
токсические свойства ТГДЦПД 105
4.3. Изучение воздействия ПЦД на системы биотрансформации
ксенобиотиков в печени 111
Влияние ПЦД на состояние монооксигеназной системы и процессы пероксидации в микросомах печени крыс в условиях in vitro Ill
Влияние ПЦД на состояние микросомных монооксигеназ печени крыс в условиях острого внутрижелудочного отравления 113
4.3.3. Влияние ПЦД на состояние системы конъюгации и процессов
пероксидации в печени крыс в условиях острого внутрижелудочного
отравления 115
4.3.4. Исследование возможности метаболизма ПЦД в полной
гидроксилирующей системе микросом печени крыс 117
4.3.5. Исследование содержания продуктов основных реакций конъюгации в
моче крыс в условиях острого внутрижелудочного отравления ПЦД 121
4.3.6. Изучение влияния модификаторов МОГС и антиоксидантов на
токсические свойства ГЩД 123
Глава 5. Исследование состояния монооксигеназной системы и процессов пероксидации у сотрудников предприятий, контактирующих в производственных условиях с предельными полициклическими
углеводородами 126
5.1 Обследование персонала, контактирующего в производственных
условиях с МЦП 126
5.2. Обследование персонала, контактирующего в производственных
условиях с ТГДЦПД и ДЦПД 133
Глава 6. Установление возможной роли диоксинов в нарушениях здоровья пожарных, участвовавших в ликвидации пожара на АО "Иркутсккабель"..141
6.1. Обследование когорты "шелеховских" пожарных (1999-2002 годы)...,141
6.1.1. Определение энзиматической активности цитохромаР4501А2 у
"шелеховских" пожарных 141
6.1.2. Оценка состояния 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков у
"шелеховских" пожарных 150
6.1.3. Состояние порфиринового обмена у "шелеховских" пожарных 155
6.2. Обследование когорты "шелеховских" пожарных (2002-2005 годы).. ..157
6.2.1. Определение уровней ГГХДД, ПХДФ И ПХБ в сыворотке крови
пожарных 158
6.2.2. Исследование метаболизма антипирина у "шелеховских" пожарных
164
6.2.3. Связь между показателями метаболизма антипирина и экспрессией
диоксин-индуцируемых генов у "шелеховских" пожарных 169
Заключение 174
Выводы 212
Список литературы 215
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ТГДЦПД - тетрагидродициклопентадиен
ТХДД - 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин
ФБ - фенобарбитал
ФЦ - фенацетин
ЭРОД - этоксирезоруфин-Одеалкилаза
CLt - клиренс элиминации
CYP - принятое в современной номенклатуре обозначение
цитохрома Р450
I - интенсивность хемилюмииесценции
NAP - норантипирин
4НАР - 4-гидроксиантипирин
ЗНМАР - 3-гидроксиметилантипирин
Т]/2 - период полувыведения
Vd - кажущийся объем распределения
TEQ - суммарный токсический эквивалент
5-АЛК — 5-аминолевулиновая кислота
- светосумма хемилюмииесценции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интенсивное загрязнение окружающей среды ксенобиотиками техногенного происхождения неизбежно порождает вопросы о том, в какой степени организм человека может адаптироваться к химическим нагрузкам, каковы при этом возможности организма и как их следует учитывать при регламентировании химических веществ, поиске методов диагностики и профилактики отравлений.
В процессе эволюции выработались определенные способы адаптации
организма к действию ксенобиотиков [Арчаков А.И., 1983; Тиунов Л.А.,
1995]. Ведущую роль при этом играют метаболические механизмы,
обезвреживающие липофильные токсические вещества экзогенного и
эндогенного происхождения. Эти механизмы включают преимущественно
три группы реакций: энзиматическую биотрансформацию ксенобиотиков при
участии цитохром Р450-зависимых монооксигеназ (1-я фаза
биотрансформации), конъюгацию реактивных метаболитов и гидрофильных
соединений (2-я фаза биотрансформации) и антиоксидантную защиту,
объединяющую антирадикальные и антиперекисные механизмы [Голиков
С.Н. и соавт., 1986]. Комплекс этих реакций, присущий всем живым
организмам, рассматривается как универсальная биохимическая система
естественной детоксикации. Нарушение согласованного процесса
детоксикации является одним из общих механизмов токсичности и приводит
к нарушению гомеостаза и развитию патологических процессов [Тиунов
Л.А., 1995; Ляхович В.В. и соавт., 1997]. Принципиально, что в процессе
функционирования системы возможно образование более
реакционноспособных метаболитов по сравнению с исходными соединениями [Watkins Р.В., 1990], а также образование активных форм кислорода [Bast А., 1986; Kappus Н., 1993; Карузина И.И. и соавт., 1995; Lewis D.F.V., 2001]. Результатом этих процессов могут быть, в частности,
взаимодействия с ДНК, приводящие к мутациям [Parke D.V. et al., 1991], а также развитие окислительного стресса [Nebert D.W., Duffy J.J., 1997], являющегося основной причиной инактивации многих ферментов и повреждения внутриклеточных мембран [Тиунов Л.А., 1995]. Существенно, что детоксикация и активация ксенобиотиков может происходить как на 1-ой, так и на 2-ой стадиях биотрансформации [Parke D.V., Obrebska-Parke M.J., 1987]. Соотношение этих процессов зависит от активности изоформ ферментов биотрансформации, для которых конкретный ксенобиотик является субстратом [Гуляева Л.Ф. и соавт., 2000]. Несмотря на широкий размах исследований, посвященных процессам детоксикации и пероксидации, в немногих работах названные процессы рассматривались как согласованно функционирующие звенья единой системы.
В полной мере вышеизложенное может быть отнесено к предельным полициклическим углеводородам. Данные такого рода относительно названного класса соединений в литературе отсутствуют, что затрудняет формирование представлений о биохимических механизмах их патогенного действия и разработку средств диагностики и профилактики интоксикаций.
С середины 90-х годов в связи с обострением проблем, связанных с воздействием на окружающую среду и человека стойких органических загрязнителей [Vallack H.W. et al., 1998], проводятся интенсивные изыскания, направленные на выявление эффективных биохимических маркеров воздействия диоксинов - особо опасных полициклических соединений [Birnbaum L.S., 1994]. Одними из перспективных в этом плане являются исследования, связанные с феноменом индукции диоксинами продуктов суперсемейства генов цитохрома Р450 - CYP1A1, 1А2 и 1В1, обусловливающих активацию CYP-содержащих монооксигеназ в организме млекопитающих [Осташевский В.А. и соавт., 1994; Clark G. et al., 1992; Spencer DX. et al., 1998, 1999; Masten S. et al., 1997, 1998; Sibiryak D. et al., 2000; Grassman J. et al., 1999, 2000, 2002; Edwards T. et al., 2001; Abraham K. et
al., 2002; Baccarelli A. et al, 2004; Landi M.T. et al, 2003, 2005]. Подобные разработки крайне важны, поскольку учитывают высокую межиндивидуальную вариабельность чувствительности к воздействию токсикантов и генетический полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков [Grassman J. et al., 1998; Вавилин B.A., 2001].
Существенно, что в основе эффективного действия этой целостной системы лежат оптимальные соотношения составляющих ее компонентов. Это открывает уникальные возможности для использования показателей, характеризующих состояние системы естественной детоксикации, на пути разработки подходов к методам диагностики, профилактики и терапии отравлений липофильными химическими соединениями, патогенные эффекты которых формируются за счет модификации механизмов эндогенного обезвреживания.
Вышеизложенное определило цель настоящей работы, заключающуюся в раскрытии закономерностей и механизмов биотрансформации ксенобиотиков в печени животных и человека при воздействии полициклических соединений для патогенетического обоснования методов диагностики, профилактики и терапии интоксикаций.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать экспериментальную модель интоксикации организма
пожарных, вызванной воздействием содержащего диоксины комплекса
токсических веществ (КТВ), на примере пожара на АО "Иркутсккабель".
2. Установить закономерности формирования первичных и
отсроченных эффектов воздействия 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина
(ТХДД) отдельно и совместно с компонентами КТВ на состояние системы
биотрансформации ксенобиотиков в печени крыс и оценить возможность
модифицирующего влияния КТВ на реализацию патогенных свойств ТХДД.
3. Изучить влияние предельных полициклических углеводородов
(ППУ) на состояние системы биотрансформации липофильных
ксенобиотиков в печени животных в условиях in vitro и in vivo и оценить
метаболизм ППУ в гидроксилирующей системе микросом печени.
Изучить в эксперименте на животных эффективность модификаторов микросомных монооксигеназ и антиоксидантов для профилактики и терапии интоксикаций ППУ.
Исследовать состояние цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и процессов пероксидации у лиц, контактирующих с предельными полициклическими углеводородами в производственных условиях,
Провести фармакокинетическую оценку активности цитохрома Р4501А2 и исследовать состояние 2-оЙ фазы биотрансформации ксенобиотиков у пожарных, принимавших участие в тушении пожара на АО "Иркутсккабель" в 1992 г.
Патогенетически обосновать подходы к оценке воздействия диоксинов совместно с КТВ на организм пожарных для выделения групп риска развития отдаленных последствий их воздействия.
Научная новизна работы. Впервые показано, что компоненты комплекса токсических веществ, содержащего индукторы подсемейства CYP1A - ПАУ и классический ингибитор цитохрома Р450 - СО, в условиях раздельного и комбинированного 10-кратного воздействия не модифицировали патогенные свойства ТХДД, оцениваемые по активности CYP1A1 и CYP1A2 в микросомах печени экспериментальных животных. ТХДД в условиях 20-кратного воздействия в дозе 0,1 мкг/кг вызывает активацию CYP1A в микросомах печени, сохраняющуюся в течение 11 месяцев.
Впервые получены данные о состоянии системы биотрансформации ксенобиотиков в печени экспериментальных животных, подвергнутых воздействию МЦП, тетрагидродициклопентадиена (ТГДЦПД) и пентацикло-
декана (ПЦЦ). Показана возможность метаболизма изученных ППУ в полной гидроксилирующей системе микросом печени.
В специальных сериях опытов с модификаторами активности микросомных монооксигеназ и антиоксидантами впервые установлено, что метаболиты МЦП и ТГДЦПД менее, а ГЩД - более токсичны по сравнению с исходным соединением. Выявлен профилактический и лечебный эффект антиоксидантов, индукторов и ингибиторов микросомных монооксигеназ в условиях воздействия ППУ.
Впервые при обследовании персонала, контактирующего в производственных условиях с МЦП и ТГДЦПД, и в опытах на животных установлен сходный характер влияния ППУ на состояние цитохром Р450-зависимых монооксигеназ (МОГС) и интенсивность процессов пероксидации экспериментальных животных и человека. ППУ оказывали разнонаправленное действие на состояние монооксигеназ печени и процессы пероксидации: МЦП угнетал функциональную активность МОГС при отсутствии изменений показателей процессов пероксидации, а ТГДЦПД индуцировал МОГС с последующей активацией процессов пероксидации.
Впервые использован антипирин в качестве маркера активности CYP1A2 в совокупности с определением содержания диоксинов у пожарных, подвергшихся в 1992 году воздействию содержащего диоксины комплекса токсических веществ, образовавшихся при пожаре. Выявлены высокие уровни содержания диоксинов в организме, позволяющие рассматривать "шелеховских" пожарных как экспонированную диоксинами когорту. Установлена связь между 3-гидроксиметилантипирином, характеризующим активность CYP1A2 метаболитом антипирина в моче, и суммарным ТЕРпхдд/пхдФ/пхБ в сыворотке периферической крови, а также экспрессией диоксин чувствительных генов (AhR и CYP1А1).
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований определили значение
системы биотраисформации ксенобиотиков при воздействии полициклических соединений, в значительной мере расширили представления о механизмах патогенеза и позволили обосновать подходы к изысканию методов диагностики, профилактики и. терапии интоксикаций. Полученные результаты позволили установить связь между эффектами, обусловленными экспрессией диоксин чувствительных генов, с последующими системными и функциональными нарушениями у пожарных. Это позволяет рассматривать активность цитохрома Р4501А2 (по результатам антипиринового теста) и экспрессию генов AhR и CYP1A1 как важные показатели для выделения групп риска по развитию отдаленных патогенных эффектов и оценки воздействия содержащего диоксины комплекса токсических веществ.
Полученные результаты использованы при подготовке пособия для врачей "Диагностика и медицинская реабилитация в отдаленном периоде профессиональной нейроинтоксикации у пожарных" — Иркутск: Изд-во РИО ИГИУВа, 2004. Разработанные подходы оценки состояния 1-ой и 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков в печени используются при проведении обследования пожарных в клинике АФ - НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН. Результаты обследования пожарных рекомендованы к использованию практическими врачами профильных лечебных учреждений для выработки тактики наблюдения за состоянием здоровья лиц с высоким содержанием диоксинов в организме и экспрессией генов CYP1A. Разработана и утверждена методика "Дициклопентадиен. Спектрофотометрический метод определения в моче1' (утвержден Главным сан. врачом СССР, Per. № 12-91). Результаты исследований были использованы при подготовке материалов к обоснованию предельно допустимых концентраций двух предельных полициклических углеводородов в воздухе рабочей зоны (утверждены зам. главного Гос. сан. врача РФ, Per. № 3-93 и Per. № 10-94).
Основные положения, выносимые на защиту:
Компоненты образовавшегося при пожаре комплекса токсических веществ существенно не модифицируют патогенное действие 2,3,7,8-тетрахлордибензо-;?-диоксина в условиях разработанной экспериментальной модели.
Предельные полициклические углеводороды, тетрагидродицикло-пеитадиен и МЦП, сопоставимо воздействуют на состояние системы биотрансформации липофильных ксенобиотиков и процессы пероксидации животных и человека, при этом ТГДЦДД проявляет свойства индуктора фенобарбиталового типа, а МЦП - ингибитора цитохром Р450-зависимых монооксигеназ.
Патогенетически обоснована необходимость применения антиоксидантов и модификаторов активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ для профилактики и лечения интоксикаций предельными полициклическими углеводородами.
Диоксины играют значимую роль в . формировании синдромокомплекса (токсической энцефалопатии с органическими расстройствами психики и сенсорной полиневропатией с вегетативными нарушениями конечностей) пожарных, принимавших участие в тушении пожара на АО "Иркутсккабель", а показатели экспрессии диоксин чувствительных генов и активность CYP1A2 являются маркерами для выделения групп риска по развитию отдаленных патогенных эффектов и оценки воздействия содержащего диоксины комплекса токсических веществ.
Апробация результатов исследований
Основные результаты работы доложены на Всесоюзной конференции "Цитохром Р450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), Всесоюзной конференции "Токсикологические проблемы химических катастроф" (Ленинград, 1991), 7-ой International Conference "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450; Structure and Function, Biotechnological and Ecological
Aspects" (Москва, 1991), Всероссийской конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" (Санкт-Петербург, 1994), 1-ой Всероссийской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995), 14-ом и 15-ом European Workshop on Drug Metabolism (Париж, Франция, 1994; Йена, Германия, 1996), 3-ей Российско-Американской встрече "Снижение опасности загрязнения окружающей среды диоксинами и защита здоровья населения" (Байкальск, 1998), Круглом столе по проблемам "шелеховского" пожара в Гарвардской Школе Общественного Здравоохранения (Бостон, США, 1999), Семинаре группы диоксинов отдела фармакокинетики Исследовательского Центра Агентства по охране окружающей среды США (Северная Каролина, США, 1999), Российской конференции с международным участием "Национальный план действий по экологически обоснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксииоподобными веществами" в рамках Проекта Программы ООН по окружающей среде и Центра международных проектов "Укрепление национального управления в области химических веществ в СНГ" (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской Конференции по проблеме стойких органических загрязнителей (Москва, 2002), 1-ом и 2-ом съездах токсикологов России (Москва, 1998 и 2003), Президиуме Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН (Иркутск, 2004), 20-, 21-, 22-, 23-, 24- и 25-ом International Symposium on Halogenated Environmental Organic Pollutants and POPs "Dioxin" (Монтерей, США, 2000; Кянджоу, Ю. Корея, 2001; Барселона, Испания, 2002; Бостон, США, 2003; Берлин, Германия, 2004; Торонто, Канада, 2005), 6-ом Annual Pilot Research Project Symposium (Цинциннати, США, 2005), заседании экспертной комиссии диссертационного совета Д.001.054.01 (Иркутск, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 61 печатная работа, в том числе 14 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования
РФ, 8 - в иностранных периодических изданиях, в двух монографиях, одном пособии для врачей и разделе в монографию.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 250 страницах, иллюстрирована 47 таблицами и 20 рисунками, состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы из 310 источников.
