Содержание к диссертации
Введение
1. Участие беспозвоночных животных в почвенных процессах
1.1. Размерная и функциональная классификации почвенных животных 16
1.2. Прямое и косвенное участие животных в почвенных процессах 18
1.3. Участие животных в физических процессах 20
1.3.1. Измельчение растительного опада 21
1.3.2. Перемешивание и перемещение подстилки и почвы 21
1.3.3. Образование экскрементов 22
1.3.4. Роющая деятельность 26
1.4. Участие животных в химических процессах 29
1.4.1. Деструкция органического вещества 29
1.4.2. Круговорот веществ 33
1.4.3. Плодородие, питание растений, вермикомпосты 41
2. Взаимодействия микроорганизмов и животных в пищевых цепях 48
2.1. Особенности питания почвенных животных 48
2.2. Пищевые предпочтения у животных по отношению к микроорганизмам 52
2.2.1. Простейшие 52
2.2.2. Микроартроподы 54
2.2.3. Макроартроподы, дождевые черви 57
2.3 Судьба микроорганизмов при прохождении пищеварительного тракта беспозвоночных 59
2.4. Регуляция беспозвоночными популяций и сообществ микроорганизмов 63
2.5. Взаимодействие между почвенными животными и микроорганизмами прикорневой зоны растений 65
2.6. Микроорганизмы как регуляторы беспозвоночных (биологический контроль) 67
2.6.1. Хищные нематофаговые хищные грибы 67
2.6.2. Энтомопатогенные бактерии 75
3. Симбиотические ассоциации микроорганизмов с беспозвоночными животными 82
3.1. Эндосимбиозы 83
3.1.1. Бактерии 83
3.1.2. Дрожжи и дрожжеподобные грибы 84
3.2. Эктосимбиозы 86
3.2.1. Пищеварительный тракт животных как среда обитания микроорганизмов 86
3.2.2. Ферментативная активность в пищеварительном тракте 88
3.2.3. Бактерии и простейшие 92
3.2.4. Дрожжи и дрожжеподобные грибы 100
3.3. Экзосимбиозы 104
3.3.1. Мицелиальные грибы 104
3.3.2. Дрожжи и дрожжеподобные грибы 105
3.4. Функциональная роль микробных симбионтов (резюме) 106
4. Объекты 107
4.1. Почвы и другие субстраты 107
4.2. Микроорганизмы 108
4.2.1. Генетически модифицированные грамотрицательные бак терии 109
4.2.2. Энтомопатогенные бациллы и другие грамположительные бактерии 110
4.2.3. Хищный гриб Arthrobotrys oligospora 111
4.2.4. Бактерии как пища нематоды Caenorhabditis elegans 111
4.3. Беспозвоночные животные 112
5. Методы 114
5.1. Методы работы с микроорганизмами 115
5.1.1. Световая микроскопия 115
5.1.2. Электронная микроскопия 116
5.1.3. Определение оптической плотности суспензий микробных клеток 116
5.1.4. Полярографический метод определения потребления кислорода микробами 116
5.1.5. Определение интенсивности дыхания почвы 117
5.1.6. Определение общей биомассы почвенных микроорганизмов в почве 117
5.1.7. Дифференцированное определение грибной и бактериальной биомассы в почве 118
5.1.8. Определение функционального разнообразия микроорганизмов в почве- 119
5.1.9. Определение численности и таксономического состава бактерий, ассоциированных с почвенными животными, методом микробиологического посева
5.1.10. Учет и идентификация бактерий, ассоциированных с сапро-трофными почвенными беспозвоночными животными
5.1.11. Селективное выделение и учет грамотрицательных и грамположительных бактерий из почвы, кишечника и экскрементов животных
5.1.12. Методы изучения динамики маркированных бактериальных популяций, интродуцированных в пищу
5.1.13. Скрещивание энтомопатогенных бацилл и энтерококков in vitro
5.1.14. Идентификация бактерий с помощью Biolog
5.1.15. Выделение и идентификация дрожжей из почвы, растительного опада, вермикомпоста, кишечника и экскрементов животных
5.1.16. Выделение бацилл и энтерококков из почвы
5.1.17. Получение споровой суспензии бацилл и определение структуры популяций бацилл, внесенных в почву
5.1.18. Получение суспензии мицелия стрептомицетов
5.1.19. Определение структуры комплекса микромицетов на растительном опаде, в почве и экскрементах животных
5.1.20. Качественный тест киллерного действия пищеварительной жидкости на микроорганизмы
5.1.21. Количественный тест киллерного действия пищеварительной жидкости животных на микроорганизмы
5.1.22. Определение кажущейся эффективности ассимиляции, скорости и эффективности разрушения микробных клеток кивсяками радиоизотопным методом
5.1.23. Определение антагонистического взаимодействия акти-номицетов с бактериями и дрожжами
5.1.24. Проверка способности дрожжей расти на среде с мочевой кислотой
5.1.25. Определение влияния целомической жидкости червей Eisenia fetida на рост дрожжей
5.2. Методы работы с беспозвоночными животными
5.2.1. Выделение пищеварительной жидкости из кивсяков и мокриц
5.2.2. Экстракция и подсчет численности нематод и микроартропод- 133
5.2.3. Выявление пищевых предпочтений у нематоды С. elegans и коллембол- 133
5.2.4. Разведение червей Eisenia fetida 134
5.3. Биохимические и молекулярно-биологические методы 134
5.3.1. Определение содержания минеральных форм азота в почве 134
5.3.2. Определение концентрации растворимого органического вещества в почве - 134
5.3.3. Хроматография на сефадексе LH-20 134
5.3.4. Электрофорез белков 135
5.3.5. ДНК-фингерпринт 135
5.3.6. Выделение плазмид из грамотрицательных и грамположительных бактерий - 135
5.3.7. Расчет время генерации бактерий в пищеварительном тракте 136
5.4. Методы статистической обработки результатов 136
6. Роль макрофауны в регуляции микробного комплекса почв 137
6.1. Изменения численности и структуры популяций микроорганизмов при пассаже через пищеварительный тракт животных- 137
6.2. Изменения таксономического состава микробного сообщества 145
6.3. Инициация прорастания спор бацилл 150
6.4. Влияние целомической жидкости червей Eisenia fetida на рост микроорганизмов151
6.5. Трофическая деятельность дождевых червей и распределение микроорганизмов в почвенном профиле153
6.6. Вклад макрофауны в продукционный процесс почвенных микроорганизмов- 154
6.7. Трофическая деятельность беспозвоночных (макрофауны) и генетический обмен между бактериями в почве- 156
7. Микроорганизмы и питание животных 161
7.1. Антимикробная активность пищеварительной жидкости животных- 162
7.2. Состав и киллерная активность пищеварительной жидкостиPachyiulus flavipes 167
7.3. Скорость разрушения и переваривания микроорганизмов в кишечнике кивсяка Pachyiulus flavipes- 173
7.4. Степень ассимиляции микроорганизмов на примере кивсякаPachyiulus flavipes 176
7.5. Уровень потребления у животных 176
7.6. Микроорганизмы как основная и дополнительная пища животных (микробные добавки и производство вермикомпостов) 177
8. Микробные сообщества, ассоциированные с пищеварительным трактом животных: состав и функции 183
8.1. Морфологическое разнообразие микроорганизмов пищевари тельного тракта беспозвоночных (макрофауна) 184
8.1.1. Бактерии 184
8.1.2. Дрожжи 185
8.1.3. Мицелиальные грибы 185
8.2. Таксономический состав и структура пристеночного и полостного микробного сообществ пищеварительного тракта- 185
8.2.1. Бактерии 185
8.2.2. Дрожжи 203
8.3. Симбионтное пищеварение и питание 206
8.4. Антагонистические свойства актиномицетов, ассоциированных с кишечником и экскрементами животных (устойчивость к колонизации) 211
8.5. Дрожжи как патогены беспозвоночных 212
8.6. Критерии, позволяющие выделить кишечную группировку дрожжей - 213
9. Роль микро- и мезофауны в регуляции динамики популяций, состава и активности микроорганизмов в почве 220
9.1. Влияние бактериоядной нематоды Caenorhabditis elegans как источника пищи на рост и развитие нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora- 220
9.2. Влияние бактериоядной нематоды Caenorhabditis elegans как источника пищи на сапротрофную активность (дыхание) Arthrobotrys oligospora- 225
9.3 Особенности питания хищного гриба Arthrobotrys oligospora как сапротрофа и хищника 225
9.4. Влияние комплекса почвенных нематод и микроартропод на состав и активность микробного комплекса 227
9.5. Влияние микроартропод на сапротрофную активность микроорганизмов и сукцессию микромицетов в подстилке 236
9.6. Пищевые предпочтения у микроартропод и нематод 240
9.7. Регуляция, зависимая от качественного состава органического вещества (соотношение углерода и азота) 243
9.8. Регуляция, зависимая от плотности животных 244
9.9. Роль прямого выедания в регуляции микробного комплекса 245
9.10. Деятельность беспозвоночных и продукция микроорганизмов 247
9.11. Концептуальная модель регуляции микро- и мезофауной микробного комплекса 248
9.12. Компенсаторные реакции у грибов и растений на поедание животными 252
10. Микроорганизмы как регуляторы популяций беспозвоночных в почве 254
10.1. Влияние хищного гриба Arthrobotrys oligospora на динамику комплекса нематод в ризосфере винограда и пшеницы 254
10.2. Влияние Bacillus thuringiensis на динамику комплекса почвенных нематод в ризосфере ячменя - 257
10.2.1. Нематоцидная активность Bacillus thuringiensis по отношению к комплексу почвенных нематод (эксперименты in vitro) 257
10.2.2. Нематоцидная активность Bacillus thuringiensis по отношению к комплексу почвенных нематод (эксперименты в вегетационных сосудах) 259
11. Заключение: принципы зоомикробных взаимодействий в почве 263
11.1 Микроорганизмы как источник углерода, энергии, биогенных элементов и физиологически активных веществ для почвенных животных 263
11.2. Каждое животное имеет свой круг микробных жертв 264
11.3. Киллерный механизм и индуцированный - универсальные механизмы переваривания микроорганизмов животными 264
11.4. Пищеварительный тракт животных - специфическое местообитание микроорганизмов в почве 265
11.5. Биотическая регуляция пищевых цепей основана на трофическом и метаболическом принципе взаимодействия 266
Выводы 270
Список литературы 273
- Прямое и косвенное участие животных в почвенных процессах
- Пищевые предпочтения у животных по отношению к микроорганизмам
- Эктосимбиозы
- Микроорганизмы
Введение к работе
Проблемы межорганизменных взаимодействий занимают центральное место в экологии. Взаимодействия между организмами в сообществе и сообщества с абиотической средой - главные факторы регуляция состава и стабильности экосистем (Беклемишев, 1970). Идеальная модель для изучения механизмов биологической регуляции в экосистемах - зоо-микробные взаимоотношения, поскольку в них реализуются все типы взаимодействий: от нейтрализма - до мутуализма.
В основе регуляции межорганизменных взаимодействий лежат топические, фабрические, форические, трофические связи, которые, в свою очередь, деляться на прямые и косвенные (Беклемишев, 1970). Форические связи касаются транспортировки организмами друг друга. Топические и фабрические связи возникают, когда партнеры предоставляют место для обитания или изменяют физико-химическую среду обитания друг для друга. Трофические связи между популяциями образуются, когда представители одной популяции питаются организмами другой популяции, или их мертвыми остатками, или продуктами жизнедеятельности. При этом происходит обмен субстратами роста или ростовыми факторами, удаление токсических продуктов обмена одного организма другим организмом. Существуют и метаболические связи, которые образуются благодаря экскреции продуктов жизнедеятельности в среду, выполняющих функцию "сигнальных метаболитов": антибиотиков, токсинов, атрактантов и репеллентов, физиологически активных веществ (Бабьева, Зенова, 1989).
В зоомикробном комплексе почвы, по-видимому, развиты все типы связей, но трофические и метаболические связи представляются определяющими в жизни почвенного сообщества. Действительно, трофические отношения определяют круговорот веществ (Беклемишев, 1970), им принадлежат важнейшие функции взаимодействия и ауторегуляции в биосфере (Уголев, 1991). Трофические связи лежат в основе формирования пищевых цепей, а, следовательно, и зоо-микробных взаимоотношений в почве. Метаболические связи - также неотъемлемый атрибут экосистем. Появляются доказательства наличия метаболических связей между микроорганизмами и животными в почве: 1) образование антибиотиков актиномицетами в кишечнике дождевых червей и кивсяков (Полянская и др., 1996), 2) распознавание запахов грибов микроартроподами (Hedlund et al., 1995), 3) выделение грибами веществ, отпугивающих хищников (Chen, Wise, 1997), 4) нематоцидная активность бацилл (Siddiqui, Mahmood, 1995).
Первые фундаментальные исследования по изучению структуры и функциональной роли зоомикробных взаимодействий в почве начались во второй полови не 20-го века. В нашей стране они связаны с именами М.С. Гилярова, Л.С. Козловской, Л.М Загуральской., Б.Р. Стригановой, Н. М. Черновой, И.В. Стебаева, Н.А. Мехтиевой, Д.Г. Звягинцева, Н.С. Паникова, А.Д. ГТокаржевского, а за рубежом -J. Anderson, D. Coleman, D. Parkinson, С. Edwards и других. Показано, что микроорганизмы и беспозвоночные животные образуют в почве пищевые сети, а трофическая и средообразующая деятельность животных является фактором, определяющим скорость и направление процессов, и активность микробного комплекса в почвах. У беспозвоночных установлены различные формы отношений с микроорганизмами, повышающих эффективность трансформации органических и неорганических веществ.
Участие организмов в почвенных процессах может быть и прямым, и косвенным. Прямое участие реализуется в метаболических процессах, а косвенное предполагает регулирующее действие организмов друг на друга. Метаболические функции осуществляются при использовании организмами химических соединений для получения энергии, углерода, азота и других элементов питания при фото-и хемотрофии, -фиксации и других метаболических процессах. Регулирующие функции предполагают модификацию одним из организмов активности другого. Их следствием являются большие потоки энергии и массопереноса, чем собственные метаболические потребности организмов, их вызывающих (Anderson, 1995). В экосистемах основные потоки углерода, энергии и питательных элементов проходят по пищевым связям между бактериями, грибами, простейшими и нематодами и меньше связаны с активностью мезо- и макрофауны - микроартропод, дождевых червей, многоножек и др. (de Ruiter et al., 1997). Беспозвоночные участвуют в метаболизме только 1-10% углеродного потока (Macfadyen, 1963; Reichle, 1975; Luxton, 1982), но за счет высокого уровня потребления и средообразующей деятельности они оказывают большое влияние на микробные процессы (Anderson, 1995).
Ключевым принципом, на котором основаны зоомикробные взаимодействия, является неспособность беспозвоночных к синтезу незаменимых аминокислот (Сравнительная физиология животных, 1977), а в почве животные абсолютно зависят от микроорганизмов как источника незаменимых аминокислот (Покаржев-ский и др., 1984).
В проблеме зоомикробных взаимодействий выделяются функциональное и структурно-функциональное направления. Функциональное направление ориентировано на выяснение роли беспозвоночных в почвенных процессах: в разложении органического вещества, эмиссии С02, динамике питательных элементов и др.. Большинство исследований посвящено именно этим вопросам (Coleman et al., 1983; Ingham et al., 1985; и др.). В значительной меньшей степени развито структурно-функциональное направление, в рамках которого изучаются взаимосвязи между организмами и их функциональное значение в почвах. Важнейшие достижения в этой области связаны с работами по выяснению роли животных в судьбе микроорганизмов (Козловская, 1976; Szabo, 1974; Hanlon, Anderson, 1979 и др.); средообразующей деятельности животных как вместителей микробных сообществ (Szabo, 1974; Bignell, 1984 и др.) или модификаторов среды обитания микробов (Edwards (Ed.), 1998 и др.); роли микробов в питании животных (Стриганова, 1980; Покаржевский и др., 1984 и др.).
Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью формулирования принципов зоомикробных взаимодействий в почве, возникающих при контакте микроорганизмов и животных в процессе питания (трофические взаимодействия) или их метаболитов (метаболические взаимодействия). Работа посвящена изучению регуляторных механизмов этих взаимодействий и их функциональной роли в экосистемах. Получение фундаментальных знаний в этой области необходимо для развития экологического направления, представляющего почвенный биотический комплекс как систему взаимодействующих организмов. Знание закономерностей зоомикробных взаимодействий важно для понимания того, как организованы и функционируют трофические сети в почве, а также для решения разнообразных прикладных проблем: при экологическом мониторинге, оптимизации режима питательных элементов в агроэкосистемах, контроля паразитических беспозвоночных (нематод и др.), производства вермикомпостов и многих других.
Цель исследования - разработка теоретических представлений о регуляции зоомикробных взаимодействий и их функциях в почве на основе изучения особенностей воздействия микро-, мезо- и макрофауны на микробное сообщество и роли микроорганизмов в жизнедеятельности беспозвоночных животных.
Направления исследования
1. Определение судьбы микробных популяции (в том числе генетически модифицированных бактерий) при их пассаже через пищеварительный тракт почвенных животных - макрофауны (дождевых червей, многоножек и мокриц).
2. Оценка роли беспозвоночных в формировании микробного комплекса почвы.
3. Изучение механизмов селективного переваривания микроорганизмов животными и его роли в формировании микробного комплекса почвы.
4. Выяснение особенностей питания животных разными микроорганизмами (разработка микробиологических основ вермикомпостирования).
5. Характеристика морфологического и таксономического разнообразия микроорганизмов пищеварительного тракта беспозвоночных и их функциональной роли.
6. Оценка воздействия микрофауны и мезофауны (нематоды и микроартропо-ды) на состав, активность и продуктивность микробного комплекса почвы; изучение механизмов регулирующего действия этих беспозвоночных на микробный комплекс.
7. Выяснение закономерности трофического поведения хищных грибов в почве: с чем связан переход от сапротрофизма к хищничеству?
8. Исследование нематоцидной активности энтомопатогенных бацилл в почве.
Научная новизна. Зоомикробный комплекс почвы действует как единая система, во многом определяющая протекание почвенных процессов. Установлены конкретные регулирующие механизмы, возникающие при прямом взаимодействии беспозвоночных животных и микроорганизмов или их метаболитов. Показана функциональная роль почвенных и симбиотических микроорганизмов в жизнедеятельности животных.
Пищеварительный тракт сапротрофных почвенных беспозвоночных животных, относящихся к макрофауне (диплоподы, дождевые черви), представляет собой особое местообитание микроорганизмов в почве. Экспериментально показано, что микробные сообщества пищеварительного тракта диплопод и дождевых червей состоят из специфических микроорганизмов. В этих сообществах различаются пристеночные и полостные микробные группировки. В пристеночных сообществах доминируют факультативно-анаэробные протеобактерии сем. Enterobacteriaceae и Vibrionaceae и актинобактерии. В пищеварительном тракте диплопод обнаружены аскомицетовые дрожжи. Доказана симбиотическая природа микроорганизмов пристеночного сообщества и показана их функциональная роль. Кишечные симбионты могут служить пищей животных, участвовать в пищеварении, реутилизируя продукты обмена животного, поддерживать устойчивость кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами за счет продукции антибиотиков, вызывать патологические процессы, приводящие к гибели животных.
Сформулировано новое представление о переваривании микроорганизмов беспозвоночными животными, основанном на "киллерном" эффекте пищеварительной среды животных на микробные клетки. Показано, что перевариванию предшествует гибель клеток, вызываемая веществами небелковой природы, затем происходит ферментативный гидролиз с участием ферментов животного и автоли-тических ферментов микробов. Киллерное воздействие имеет мембранотропный характер. У кивсяка Pachyiulus flavipes киллерный фактор связан с 16-сульфо-гидроксипальмитиновой кислотой, обнаруженной впервые. Киллерный механизм обнаружен у кивсяков P. flavipes, Megaphyllum rossicum, Rossiulus kessleri, мокрицы Arrnadillidium vulgare, у дождевых червей Lumbricus terrestris и Eisenia fetida. Установлено, что переваривание микроорганизмов животными видо- и штаммос-пецифично. Пребывание в кишечной жидкости животных может вызвать у некоторых микробов последующее замедление скорости размножения. Селективное переваривание является одной из главных причин формирования трофических сетей в почвах.
На примере мокрицы A. vulgare обнаружена передача рекомбинантных и естественных коньюгативных плазмид от интродуцированных штаммов бактерий к кишечными бактериям сем. Enterobacteriaceae. Участие беспозвоночных животных в генетическом обмене по-новому ставит проблему оценки последствий интродукции в почву микроорганизмов, в том числе генетически модифицированных, и роли беспозвоночных в создании условий, благоприятных для переноса генов между микроорганизмами в почве.
Показано, что реакция почвенных микроорганизмов на активность нематод и микроартропод зависит от соотношения углерода и азота в питательном субстрате, потребляемом микроорганизмами. Стимуляция микробного роста и активности отмечается только в условиях лимита по доступному азоту. Установлено, что нижний предел популяционной плотности животных, при котором осуществляется их регуляторное воздействие на микробный комплекс, может быть очень мал: около 10 нематод/г почвы или 10 коллембол/г опада. Реакция микробного комплекса на воздействие животных может быть быстрой (от 1 суток) и не пропорциональна количеству потребленной микробной массы, что свидетельствует о метаболической природе эффекта.
Особенности регуляторного воздействия нематод как жертв по отношению к хищным грибам проявляются в том, что эти животные являются источником физиологически активных веществ для грибов, а не их основным пищевым ресурсом.
Нематоды ограничивают рост и дыхание хищных грибов и стимулируют их репродуктивную активность.
Развивается концепция регуляции зоомикробных взаимодействий, включающая трофический и метаболический механизмы. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их экскреции и высвобождению в почву (вместе с микроорганизмами, размножающимися в пищеварительном тракте). Регуляция по метаболическому механизму предполагает физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих свойствами физиологически активных веществ. Метаболический механизм объясняет многие эффекты, например, быструю реакцию микроорганизмов на воздействие нематод и микроартропод, не пропорциональную количеству потребленной микробной массы.
Практическая значимость. Разработан ряд оригинальных приемов экспериментального изучения зоомикробных взаимодействий в почве. Предложены способы выделения пристеночного и полостного микробных сообществ пищеварительного тракта многоножек и червей, определения киллерной антимикробной активности пищеварительной среды животных. Предложен метод определения скорости разрушения микробных клеток. Разработан прием определения нематоцидной активности энтомопатогенных бактерий. Предложена модификация метода дефауниро-вания почвы. Создана коллекция микробных штаммов (протео- и актинобактерий, дрожжей).
Знания о роли беспозвоночных в создании условий для генетического обмена между бактериями (в особенности с бактериями кишечной группы), важно при оценке экологической безопасности интродукции микроорганизмов в почву, что тем более актуально, если интродуцент несет признаки устойчивости к антибиотикам или патогенности.
Предложен способ повышения продуктивности культуры червей Eisenia fetida и эффективности процесса вермикомпостирования на бедных органических субстратах (отработанный шампиньонный грунт) с помощью микроорганизмов-стимуляторов роста червей (дрожжей, мицелия грибов).
У природных изолятов энтомопатогенных бацилл Bacillus thuringiensis обнаружена неспецифическая нематоцидная активность, проявляющаяся как in vitro, так и в почве, которая может быть обусловлена термолабильными агентами белковой природы. Отобранные штаммы могут быть использованы для борьбы с фи-топатогенными нематодами.
Материалы работы используются в курсах лекций "Биология почв , "Почвенные животные и их взаимодействие с микроорганизмами".
Результаты исследования могут быть использованы в экологическом мониторинге, при разработке экологически безопасных биотехнологий, при изучении микробного разнообразия, при поиске микробов-продуцентов физиологически активных веществ, при оценке риска интродукции микроорганизмов в почвы.
Основные защищаемые положения. В основе регуляторного воздействия беспозвоночных животных на микробный комплекс лежат несколько основных принципов.
1. Беспозвоночные осуществляют отбор микробных популяций и модифицируют микробные сообщества, пассируя пищевые субстраты через свой пищеварительный тракт. Переваривание микроорганизмов животными основано на "киллерном" эффекте; оно - видо- и шмаммоспецифично. Киллерный механизм - фактор, определяющий разнообразие трофических связей в почвах. В ряде экосистем роль макрофауны в регуляции продукционного процесса микроорганизмов существенна.
2. Кишечник беспозвоночных - специфическое местообитание в почве, отличающееся по составу и активности микробов. Функциональная роль кишечных симбионтов беспозвоночных во многом аналогична таковой у позвоночных.
3. Животные регулируют рост и активность микроорганизмов и как хищники (микробофаги), и как жертвы (хищные грибы-нематоды). Результат регуляции меняется от стимулирования к ингибированию при увеличении обеспеченности микроорганизмов азотом и при возрастании популяционной плотности животных выше определенного уровня. Животные меняют скорость микробной сукцессии и состав доминирующих микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на воздействие животных может быть очень быстрой и проявляется при низкой популяционной плотности животных-хищников. И стимулирующее, и ингибирующее влияние фауны на микробный комплекс, регистрируемое в виде быстрого ответа, не пропорционально количеству потребленной микробной массы.
4. В регуляции со стороны микро-, мезо- и макрофауны много общего. Это - наличие пищевой специализации в отношении микробов; предпочтение в пищу темноокрашенных грибов; киллерный механизм переваривания; быстрый ответ микробов на поедание (появление) животных; увеличение доли бактерий в ходе сукцессии. Общим является и то, что в основе регуляции лежат трофические и метаболические механизмы. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их экскреции и высвобождению в почву микроорганизмов, размножающихся в кишечнике. Регуляция по метаболическому меха низму предполагает физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих свойствами физиологически активных веществ. Метаболический механизм объясняет быструю реакцию микробов на воздействие животных, не пропорциональную количеству потребленной биомассы.
5. Прямая регулирующая роль микро- и мезофауны во много превосходит таковую у макрофауны и сводится к активизации или подавлению отдельных микробных популяций в почве.
6. Отличительной особенностью взаимодействия микроорганизмов с макрофауной является наличие развитого микробного сообщества в пищеварительном тракте.
Место проведения работы. Работа выполнялась в период с 1987 по 2003 гг. на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.
Благодарности. В 1993-1994 гг. работа была поддержана Фондом Сороса и Правительства РФ (гранты NDAOOO и NDA300). В 1994-1996 гг. работа была поддержана фантом Министерства Образования, Науки и Технологии Германии и фантом РФФИ N 95-04-11942а. С 1996 г по настоящее время работа поддержана фантами РФФИ N 96-04-48418, N 99-04-48000, N 02-04-49049. Автор выражает благодарность своим учителям и коллегам Д. Г. Звягинцеву, B.C. Гузеву, И.П. Бабьевой, Т.Г. Мирчинк, Т.Г.Добровольской, Г.М. Зеновой, О.Е. Марфениной, Л.М. Полянской, Л.В. Лысак, А.Л. Степанову, By Нгуен Тхань, Я.М.Рабиновичу, Е.Б. Третьяковой, Н.Ф. Рябченко, Н.Д. Романенко, А.В. Куракову, Н.А.Кузнецовой, И.Ю Чернову, П.Н. Голышину, В.В. Демину, А.Г. Андрееву, А.Д. Покаржевскому, Л.Г. Ягловой, Г.В. Коссовой, А.Ш. Мамилову, И.Н. Мозговой, В.Д. Мигуновой, Нгуен Д.Т.Лыу, Н.И. Бабкиной, Н.В. Зи-нину, СВ. Левину, Г.И. Селецкому, Ю.Б. Бызовой, 3. Филипу, Дж. Андерсону, X. Клаусу, О. Дилли за поддержку идей, выполнение отдельных разделов экспериментальной работы, техническую помощь и дискуссии.
Личный вклад автора. Автор принимал личное участие во всех этапах исследования. Ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Автор участвовал в сборе значительной части полевого материала, в выполнении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке основного числа научных публикаций, многократно выступал с научными докладами. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, проводившими исследования под руководством автора.
Апробация. Основные положения диссертации докладывались на IX, XI и XII Международных коллоквиумах по почвенной зоологии в Москве (1985 г.), в Ювя-скила, Финдляндия (1992 г.) и в Дублине, Ирландия (1996 г); на IX Международном симпозиуме по биологии почв в Кетцхеи, Венгрия (1989 г.); на Всесоюзном совещании по проблемам почвенной зоологии в Тбилиси (1987 г.); на Всесоюзных конференциях "Биодинамика почв" в Таллине (1988 г.) и "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" в Ташкенте (1989 г.); на научном семинаре Института Гигиены почвы, воды и воздуха в Лангене, Германия (1993 г.); на Ломоносовских чтениях в МГУ (1996 и 2002 гг.); на XVIII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам в Бледе, Словения (1997 г.); на Международном нематологическом симпозиуме в Москве (1997 г.); на Республиканской научной конференции "Состояние и рациональное использование почв республики Казахстан" в Алма-Ате (1998 г.); на II (XII) Всероссийском совещании по почвенной зоологии в Москве (1999), на заседаниях и научных семинарах кафедры биологии. На конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Е.Н. Мишустина в Москве (2001 г). На Международном симпозиуме "Структура и функции почвенной микробиоты" в Марбурге, Германия (2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 работ, в том в числе 32 статей, 23 - в рецензируемых журналах, 5 - в сборниках, 3 - в коллективных монографиях; 25 работ опубликованы за рубежом.
Прямое и косвенное участие животных в почвенных процессах
Участие беспозвоночных животных в физических процессах, происходящих в почве, определяют следующие виды их деятельности: 1) измельчение растительных остатков; 2) перемещение и перемешивание подстилки и почвы; 3) образование экскрементов; 4) роющая деятельность. Потребители подстилки и детритофаги при поглощении органических остатков сильно измельчают их. Размер частиц в экскрементах диплопод и мокриц составляет деятые доли миллиметра. Микроартроподы, обладающие грызущим ротовым аппаратом, выгрызают листовые пластинки ("скелетирование" листьев), на и внутри которых растут микроорганизмы. В основном, это относится к орибатидным клещам. Их экскременты составляют доли миллиметра, а размер частиц в них - десятки микрометров. Дождевые черви перетирают органические остатки с помощью заглатываемых минеральных частиц в мускульном желудке.
При измельчении в сотни и тысячи раз увеличивается удельная поверхность субстрата. При этом резко возрастает его доступность для микроорганизмов и, как следствие, возрастает скорость разложения (Курчева, 1971; Стриганова, 1980; Hanlon, Anderson, 1980). Однако уплотнение мелких частиц в экскрементах может ограничить колонизацию их грибами. Наблюдения в сканирующем электронном микроскопе показывают, что бактерии колонизируют внутреннюю поверхность частиц в экскрементах мокриц и многоножек, а грибные гифы распространяются только по поверхности (Anderson, Ineson, 1984). Питаясь в разных горизонтах почвы и в подстилке животные из группы мезо- и макрофауны активно перемешивают органические остатки с минеральными частицами. Ключевую роль в этом процессе играют дождевые черви и термиты. Например, в ненарушенных широколиственных лесах дождевые черви -главный первичный разрушитель подстилки. Ежегодно черви перемешивают около 3-5 т подстилки/га с минеральными горизонтами, образуя так называемый гумус типа мулль. Такие же масштабы отмечены для перемешивания навоза на пастбищах. Эпигейные (обитающие в почверхностных слоях почвы и в подстилке) черви откладывают экскременты на поверхности почвы, а обитающие в почве - в ходах или других макропорах.
Годовая продукция копролитов в почвах умеренной зоны составляет 75-250 т/га год (в среднем - 40-50 т/га год), а в тропических почвах - до 400 т/га (Barois et al., 1993). Рассчитано, что в регионах с умеренным климатом за 50-100 лет верхние горизонты пахотных почв должны быть пропущены через пищеварительный тракт дождевых червей (Lamparski, Kobel-Lamparski, 1988, цит. по Makeschin, 1997). Значение перемещения органического вещества вглубь почвы червями для экосистем демонстрируют полевые эксперименты, проведенные в Новой Зеландии. Для утилизации навоза овец в почву интродуцировали дождевых червей. Опыты проводили с мечеными ,4С-растительными остатками. Установлено, что при интродукции червей углерод аккумулировался на 10 см глубже, чем без них. Содержание углерода в почве в присутствии червей было на 30% выше. Увеличивалась продукция корней растений, общая продукция возрастала на 70% (Makeschin, 1997).
В отличие от дождевых червей термиты перемещают почву из более глубоких горизонтов на поверхность для постройки гнезд. Этот материал имеет более тонкий механический состав, чем тот, из которого сложены верхние горизонты почвы. В результате деятельности термитов часть органического вещества на время изымается из оборота и консервируется в термитниках. Когда гнезда термитов разрушаются ветром или водой, этот материал разносится по поверхности. В Северной Австралии за 12000 лет за счет этих процессов нарастает слой почвы в 15 см. В Кении за счет деятельности термитов масштабы эрозии достигают 1000-10000 кг/га в год. В Африканских саваннах термиты привносят в почву до 4 т/га год мертвой древесины. За счет перемещения органического материала и почвы термиты сокращают поверхностный сток, т.к. их гнезда обладают повышенной агрегатной стабильностью (Lee, Wood, 1971). Экскременты или копролиты дождевых червей состоят из почвы, смешанной с органическими остатками. Они откладываются как внутри ходов червей, так и на поверхности почвы. В обоих случаях копролиты играют существенную роль в почвообразовании. Они содержат больше глинистых и илистых частиц, больше органического материала и меньше песка, чем окружающая почва, поскольку дождевые черви избирательно поглощают более мелкие частицы и органические остатки. Размер минеральных частиц, обнаруживаемых в пищеварительном тракте дождевых червей в среднем меньше, чем в почве и составляет 100-500 мкм. Считается, что черви не способны измельчать минеральные частицы (кроме сильно выветрелых), но они перетирают растительные остатки и частицы, содержащие органоминеральные комплексы. Это - один из важнейших факторов воздействия червей на процесс разложения органического вещества (Lee, 1985). Копролиты червей - это почвенные агрегаты. Форма и физическая прочность агрегатов оказывает влияние на аэрацию, инфильтрацию воды, водоудерживающую способность, удельную поверхность почвы. Агрегатное состояние определяет также возможность проникновения корней растений, количество микрозон с доступными для растений питательными элементами, микробную активность, соотношение аэробных и анаэробных зон, движение микро- и мезофауны и, как следствие, плодородие почвы. Проверка стабильности копролитов дождевых червей (устойчивость к размыванию в капле воды или при просеивании в воде) показывает, что они могут быть и более, и менее стабильны, чем другие почвенные агрегаты.
В значительной степени это зависит от состава и концентрации органического вещества, содержащегося в копролитах (Dobrovol skii, Titkova, 1960, цит. по Lee, 1985), но также и от микробиологической активности в них (Lee, 1985). Предполагали, что почвенные частицы цементируются гуматами кальция, которые образуются в пищеварительном тракте при взаимодействии органических соединений с карбонатом кальция, выделяемым кальциевыми железами червей (Meyer, 1943, цит. по Lee, 1985) или смешиваются с измельченными растительными остатками (Ponomoreva, 1953, цит. по Lee, 1985). Выдвигались также гипотезы о том, что стабильность копролитов связана с грибными гифами, переплетающими их по поверхности или со слизистыми полисахаридными выделениями, образуемыми в процессе микробного разложения (Waksman, Martin, 1939; Emerson, 1954, цит. по Lee, 1985; Parle, 1963, Marinissen, Dexter, 1990). Уже через несколько дней после отладки в почву копролиты колонизируются и связываются друг с другом грибными гифами, прорастающими из почвы (Lee, Pankhurst, 1992). Стабильность возрастает с возрастанием длины грибных гиф в копролитах (Emerson, 1954, цит. по Lee, 1985). Многие бактерии образуют полисахариды (леваны, декстраны), которые способны склеивать частицы кварца и глин. Таким образом, адгезия почвенных частиц благодаря микробной активности - одно из наиболее популярных объяснений стабилизации копролитов. Однако копролиты сохраняют стабильность даже после обработки перекисью водорода, которая должна окислять полисахариды и гуматы кальция (Parle, 1963). Манаенков с соавт. (1997) изучали влияние различных клеящих веществ на механическую прочность трех типов почвенных агрегатов: зернистых, комковатых и копролитовых (последние, по сути, являются старыми копролитами дождевых червей), отобранных из нативной почвы. Реагенты выбирали так, чтобы избирательно разрушить и удалить различные клеящие вещества (метод "анатомирования" агрегатов, разработанный А.Ф. Тюлиным, цит. по Зубкова, Карпачевский, 2001).
Агрегаты обрабатывали спирто-бензольной смесью (удаляет липидную фракцию из агрегатов), 3% уксусной кислотой (разрушает карбонатные связки, частично гумусовые), 1% NaOH (удаляет гумусовые вещества - свободные и частично связанные полуторными окислами), 3% раствором сока виноградной улитки Helix pomatia (содержит комплекс ферментов, разрушающих полисахариды: маннаны, глюканы; белки, пектиновые вещества и белково-полисахаридные комплексы; используется в микробиологии и биохимии для разрушения клеточных стенок грибов), спирто-бензольной смесью с 1% NaOH и спирто-бензольной смесью с 1% NaOH и К2Р2О7. Вероятность появления прочных агрегатов (сопротивление к сдавливанию более 1,0 кг/агрегат) в естественных образцах была почти в 2 раза выше у копролитовых агрегатов, чем у комковатых. Все обработки не выявили существенной разницы между агрегатами с точки зрения вероятности появления прочных агрегатов. Но вероятность появления непрочных агрегатов (сопротивление к сдавливанию менее 0,3 кг/агрегат) была выше для комковатых агрегатов, чем для копролитовых и зернистых, не только в нативных образцах, но и после их обработки спирто-бензольной смесью, спирто-бензольной смесью с водой и спирто-бензольной смесью с 3% уксусной кислотой. Важно заметить, что обработка улиточными ферментами сравняла вероятность появления непрочных агрегатов для всех трех типов агрегатов. Аналогично действовала и спиртобензольная смесь с 1% NaOH.
Результаты этой работы свидетельствуют о том, что по составу клеящих веществ копролитовые агрегаты существенно отличаются от комковатых. Известно, что в копролитах дождевых червей содержится больше органического вещества, и они имеют более тонкий механический состав, чем почва, в которой черви живут. За счет чего же так возрастает их механическая прочность? Вероятно, копролиты содержат больше веществ микробного происхождения и микробных клеток, для разрушения которых необходимы ферменты (хотя авторы и не делают такого вывода). Это согласуется с гипотезами о том, что стабильность копролитов связана с развитием на них грибных гиф (и) или с полисахаридами микробного происхождения (Waksman, Martin, 1939; Emerson, 1954, цит. по Lee, 1985; Parle, 1963; Marinissen, Dexter, 1990). Таким
Пищевые предпочтения у животных по отношению к микроорганизмам
Микробные клетки и, в частности, дрожжи являются главным источником питания амеб. Вопрос о взаимоотношении между дрожжами и амебами возник впервые в связи с изучением круговорота винных дрожжей в природе (Надсон, 1927). Из почв под виноградником часто не выделялись винные дрожжи рода Saccharomyces, хотя в период созревания винограда они в большом количестве появлялись на ягодах винограда (Надсон, 1927; Саенко, 1932; Parle, Menna, 1966). Более того, дрожжи, внесенные в почву искусственно в большом количестве весной, исчезали бесследно в июле-августе (Саенко, 1932). Что же происходит с дрожжами в почве? Было сделано предположение, что попавшие в почву вместе с ягодами винограда дрожжи поедаются почвенными амебами (Надсон, 1927). Конокотина (1925) в лабораторных условиях получила смешанные культуры Amoeba spinosa с различными видами дрожжей: Saccharomyces cerevisiae, S. apiculatus, Debaryomyces tyrocola и другие. В смешанных культурах амебы разви вались в таком большом количестве, что от дрожжей оставались только части оболочек и капельки жира (Конокотина, 1925). Amoeba spinosa питалась всеми видами дрожжей в эксперименте, тогда как Amoeba zymophila проявила избирательность в отношении тех же видов дрожжей. Она быстро инцистировалась, питаясь S. cerevisiae и S.lellipsoideus, а на остальных дрожжах оставалась подвижной 1-2 месяца (Конокотина, 1925). Heal (1963) исследовал отношение 4-х видов амеб к различным дрожжам путем инокуляции амеб на штрихи дрожжей. Опыты подтвердили факт селективного поедания дрожжей амебами. Интересно, что некоторые дрожжи в присутствии амеб меняют свою морфологию. Конокотина (1936) отмечала, что виноградные дрожжи в присутствии амеб собираются в крупные группы тесно связанных между собой клеток: дочерние клетки, не отпадая от материнских, дают новое поколение. Еще более интересное превращение происходило у Torula (Candida) pulcherrima. В присутствии амеб на обычно круглых клетках дрожжей появлялись длинные выросты либо по всей окружности, либо вытянутые в одном направлении (Конокотина, 1936). Конокотина рассматривала это явление как защитное приспособление от выедания амебами. Она упоминает также еще об одном интересном виде отношений между амебами и дрожжами. Оказывается, амебы могут переносить дрожжи на некоторое расстояние, то есть распространять последние. В ее опытах амеба увлекала дрожжи на своем теле, но, возможно, что и внутри, и затем их выбрасывала еще живыми.
Позже Гельцер и др. (1976) проводили исследование по поеданию амебами дрожжей, выделенных из природных местообитаний вместе с ними (из дерново-подзолистых и болотных почв). Было показано, что амебы Hartmanella rysodes, Valckamphia Umax потребляют клетки дрожжей Cryptococcus albidus, Cr. diffluens, Cr.terricolus. Дрожжи Lipomyces starkeyi и L. tetrasporus, напротив, не поедались амебами. На видах Cr. aerius, Cr. terreus, Hansenula beijerinkii, Pichia toletana амебы размножались, но инцистировались еще до того, как выедали дрожжевой штрих полностью. Также удалось обнаружить морфологическое изменение культур Candida podzolica и Sporobolomyces pararoseus при совместном культивировании их с амебами. Авторы экспериментально показали, что эти изменения вызывают метаболиты смешанных культур, и они имеют временный характер. Было показано, что в зависимости от степени усвояемости дрожжей амебы могут по-разному транспортировать дрожжи. Клетки О. albidus, являющиеся хорошим кормом для амеб, не могут транспортироваться амебами, в то же время амебы могут распространять дрожжи родов Pichia и Hansenula на достаточно большое рас стояние (до 1-2 см). Авторы связывают последнее явление со способностью к образованию аскоспор этими дрожжами.
Таким образом, трофические взаимоотношения между амебами и дрожжами очень сложны. Механизм избирательности в выборе дрожжей в качестве пищи и сам процесс переваривания дрожжевых клеток.
Коллемболы, в основном, потребители грибов и питаются их гифами и спорами. Но отмечается также и питание бактериями и растительными остатками, заселенными микроорганизмами. Возможно, они также питаются простейшими. Иногда коллемболы живут в больших количествах в ходах червей, питаясь грибами, растущими на копролитах (Tiunov et al., 2001). Клещи имеют очень разнообразные источники пищи. Гамазовые клещи - хищники и ловят мелких микро-артропод и нематод. Орибатиды питаются разлагающимися растительных остатками, заселенными микроорганизмами.
Клещи и коллемболы проявляют избирательность по отношению к некоторым видам микроскопических грибов и даже к элементам их структуры (Anderson, Healy, 1972; Booth, Anderson, 1979; Hanlon, Anderson, 1979). Для кол-лембол показана видовая специализация в предпочитаемости грибов в качестве пищи (Leonard, 1984). Многие коллемболы предпочитают определенные виды почвенных грибов, а другие - микоризных. В экспериментах in vitro показано, что коллембола Proisotoma minuta предпочитает фитопатогенный гриб Rhizoctonia solani эктомикоризным грибам Laccaria laccata, Pisolithus tinctorius, Suillus luteus, Thelephora terrestris. Эктомикоризные грибы также поедались, но по-разному. В присутствии R. solani P. tinctorius поедался значительно хуже, чем L. laccata, S. luteus или Т. terrestris. Когда сеянцы сосны Pinus taeda L. высаживали в почву с этой коллемболой, колонизация корней микоризными грибами происходила значительно слабее. Сделан вывод, что грибоядные коллемболы участвуют в распространении и контроле эктомикоризных грибов в ризосфере (Hiol et al., 1994). Коллемболы могут распространять и грибы на поверхности своего тела, причем тем больше, чем больше размер тела животных (Dromph, 2003).
Близкие виды коллембол по-разному используют в пищу грибы. Это показано на примере пищевых предпочтений четырех коллембол онихиурид по отношению к шести почвенным микромицетам и одному актиномицету, предложенным в качестве пищи животным в разных комбинациях. Protophorura armatus и Tullbergia granulata оказались селективными потребителями с очень строгим предпочтением. Tullbergia yosiii и Т. iowensis, напротив, не проявляли выбора в большинстве тестов. От того, проявляют ли коллемболы предпочтение к микробной пище, зависит их жизненный цикл. У неселективных потребителей Tullbergia iowensis и Tullbergiayosii не было обнаружено влияние пищи на жизненный цикл. Напротив пища достоверно влияла на жизненный цикл P. armatus - селективного потребителя. Пища повышала объем кладок и выживаемость коллембол (Chen et al., 1995). В аналогичном исследовании показано, что кормление мицелием разных видов грибов неодинаково влияет на популяции коллембол. Наилучшее их развитие проходило на смеси темноокрашенных грибов, где наблюдали наиболее быстрое появление первых кладок и максимальный их размер. Численность коллембол через месяц была в 2 раза выше, чем на других грибах. Худшие показатели отмечены при питании коллембол мицелием Aspergillus ustus: наблюдали более позднее появление кладок и их меньшие размеры. При питании культурой Mucor plumbeus регистрировали промежуточные показатели. Число особей и число отложенных яиц коллемболами, питающимися М. plumbeus было выше, чем на A. ustus (Пономарёва и др, 1995).
Klironomos et all. (1999) показали предпочтительный выбор коллемболами немикоризных сапротрофных грибов по сравнению с микоризными. Плодовитость двух поколений Folsomia Candida была выше при питании наиболее пред-почтитаемым грибом Alternaria alternata. При переносе на арбускулярно-микоризный гриб животное теряло способность откладывать яйца. В то же время грибоядные животные все-таки потребляли тонкий мицелий микоризных грибов, растущий вдали от ризопланы (поэтому считается, что поедание микоризы не оказывает значительного влияния на эффективность ее работы, как «поставщика» питательных элементов растениям) (Mcgonigle, 1995). Различные микоризные грибы также поедаются по-разному (Larink, 1997).
Микроартроподы из разных групп иногда похожи в своем выборе грибов в пищу. Коллембола Onychiurus subtenuis и орибатидный клещ Oppiela nova предпочитали одникаковые грибы (из 9-ти предложенных), выделенные с хвойной подстилки. Не обнаружено достоверной разницы между смертностью животных, содержащихся на разных чистых культурах этих грибов (Kaneko et al., 1995).
К наиболее значимым факторам, определяющим структуру сообщества гри-боядных микроартропод (коллембол и клещей) (наряду с температурой, влажностью, рН и общей длиной грибного мицелия) относят разнообразие темноокрашенных грибов (Klironomos, Kendrick, 1995). Темноокрашенные грибы со стерильным мицелием предпочитаются светлоокрашенным. Причины этого не ясны.
Возможно, темноокрашенныи мицелий имеет лучшие пищевые свойства или жи-овтные предпочитают питаться темноокрашенным мицелием, поскольку грибы сем. Dematiaceae образуют более эффективные экзоферменты (Maraun et al, 1998). Некоторые микроартроподы способны различать пищевую ценность грибного мицелия. Коллембола О. subtenius проявляла разное предпочтение по отношению к грибам, выращенным на питательном агаре и хвойной подстилке. Однако клещ О. nova не различал эти грибы по пищевым свойствам (Kaneko et al., 1995). Похожие результаты были получены Lavy и Verhoef (1996) по отношению к кол-лемболе Orchesella cincta. При ее выращивании на Cladosporium herbarum с разным содержанием азота в мицелии (2,2%; 2,7%; 4,0%; 6,2%) коллемболы росли быстрее и достигали большей массы на грибном мицелии, содержащем 4,0% и 6,2% N. Содержание белка в телах животных положительно, а липидов - отрицательно коррелировала с содержанием азота в мицелии. Содержание гликогена не коррелировало с видом пищи. Предполагается, что коллемболы компенсируют потребности в азоте и поддерживают постоянный уровень белков за счет более интенсивного потребления мицелия, содержащего недостаточно азота. В результате такие коллемболы накапливают в телах больше жира, чем те, которые питаются мицелием богатым азотом (Lavy, Verhoef, 1996).
Выбор пригодных в пищу грибов у микроартропод основан на механизмахулавливания и распознавания грибных запахов. Коллемболы различают микроскопические грибы, употребляемые в пищу, по запаху. Orchesella cincta предпочитала микроскопический гриб, a Tomocerus flavescens - Mortierella isabelina. Запахи грибов поглощали угольным фильтром, экстрагировали диэтиловым эфиром и подвергали анализу на газовом хроматомасспектрометре. В составе газов, выделяемых грибами, обнаруженБ различия. Однако, запах С. herbarum не отличался от запаха С. cladosporioides по составу, хотя последний гриб был менее предпочитаем коллемболой О. cincta. Анализ электроантеннограмм коллембол (специфической реакции антен животных) на 9 различных газообразных веществ из состава запахов этих грибов обнаружил различие между антенными ответами на 4 запаха: 2-метил-1-пропан, дипептан, 1-октан и камфора. При этом не удалось обнаружить идентичности веществ, ответственных за привлечение О. cincta к С. herbarum, а Т. flavescens - к М. isabelina. О. cincta оказалась менее "разборчива" к запахам, чем Т. flavescens. Результаты указывают на физиологическую природу пищевых предпочтений у коллембол (Hedlund et al., 1995).
Выделения (в том числе газообразные) жертвы (гриба) могут служить информационным сигналом не только для их непосредственного потребителя (кол лемболы), но и хищника 2-го порядка, питающегося коллемболами. В экспериментах in vitro показано, что обитающий в почве хищный клещ Hypoaspis aculeifer привлекается к грибу, а не к следам коллемболы Folsomiaymetaria, питающейся этим грибом. Таким образом, стратегия хищника состоит в поиске области, где пасется его жертва по "стимулам", исходящим от корма самой жертвы (Hall, Hedlund, 1999).
В подстилке грибоядные микроартроподы лимитированы доступной грибной пищей. Это утверждение следует из полевого эксперимента, в котором на поверхность подстилки помещали дольки шляпочных грибов или сухую среду для выращивания дрозофил. Плотность популяций клещей и коллембол при этом возрастала в 1,5 и 3-4 раза, соответственно. Грибы могут активно защищаться от потребления хищниками благодаря выделению репелентных веществ или токсинов (Chen, Wise, 1997).
Пищевые предпочтения микроартропод объясняют и разным строением ротового аппарата животных. У коллемболы Isotoma notabilis в кишечнике преобладали грибные гифы и коллоидный материал, у Orchesella hexfasciata встречались грибные гифы, споры, пыльца и остатки растений и животных, коллоидный материал, бактерии и минеральные частицы, а у Sminthurimus henshawi - только грибные споры (Chen et al., 1996).Специализированная бактериофагия встречается сравнительно редко. Она описана для некоторых видов клещей-орибатид (Luxton, 1972) и нематод (Стриганова, 1980).Данных о пищевых предпочтениях у крупных беспозвоночных животных сравнительно немного.
В пищеварительном тракте пустынной многоножки Orthoporus ornatus обнаружены грибы, которые не встречались в почве, но росли на разлагающихся ветках, которыми пи тается многоножка: Actinomucor sp., Piptocephalis sp., Doratomyces spp. и др. В экспериментах по предпочтению грибов в пищу показано, что лучше потребляются Bisporus spicifera, Gunningamella hertolothea, G. echinulata и Aspergillus fumigatus (последний обычно бывает токсичным для животных). Сделано предположение, что предпочитаются грибы, обладающие более высокой пищевой ценностью. Они, вероятно, обеспечивают животное гидролитическими ферментами, витаминами или стеринами (Taylor, 1982). Наиболее исследованным с точки зрения пищевых предпочтений в отношении микроорганизмов является компостный червь Eisenia fetida. Есть косвенные свидетельства важной роли микроорганизмов в питании червей. В промытом водой компосте Е. fetida рос медленнее, чем в непромытом; в термически обработанном компосте медленнее, чем в нативном. Стерильно выведенную молодь Е. fetida стерилизовали с поверхности карбенциллином и содержали в целлюлозной среде, обогащенной одной из 18 культур бактерий, грибов и актиномицетов. Через 6 недель во многих вариантах черви погибли. Исключение составили варианты с культурами бактерий Citrobacter freundi и Pseudomonas sp. Черви, питающиеся грибами Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Fusarium sp. и Penicillum sp., погибли через 10-40 дней; при питании Ascobolus sp. и Trichoderma sp. - отмечалась потеря в весе червей, но не гибель. Только на грибах Arthrobotrys sp. и Cladosporium herbarum отмечали прибавку в весе: в течение 14 недель черви росли соответственно со скоростью 0,5 и 0,8 мг сырой массы/сут. (Morgan, 1980).
В аналогичном эксперименте стерильно выведенную молодь Е. fetida кормили стерилизованными субстратами, инокулированными чистыми культурами бактерий, актиномицетов и грибов. Из бактерий наиболее "питательными" оказались Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes faecalis, Nocardia salmonicolor. Снижение веса червей и дґже смертность наблюдали при кормлении культурами Arthrobacter simplex, Arthrobacter tumescens, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium sp. Грибы также отличались по пищевой ценности. Привес червей был отмечен при кормлении Trichoderma harzianum (заметим, что другой вид триходермы был не столь питателен - см. выше) и Mucor plumbeus. Fusarium oxysporum был токсичен. Интересно, что термическая стерилизация не снижала питательной ценности бактерий и грибов. Авторы заключают, что Е. fetida питается непосредственно микробной плазмой, а не продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Попутно было сделано предположение, что Е. fetida не обладает специфической кишечной микробиотой с определенными пищевыми функциями, поскольку стерильные черви (гнотобионты) питались также эффективно (Hand, Hayes, 1988).
В серии работ (Dash et al., 1979, 1986) показана строгая предпочитаемость дождевыми червями определенных видов микромицетов. Грибы условно разделили на "переваривающиеся" {Actinomucor spp., Helmintosporium spp., Nigrospora sphaeria, Rhizopus nigricans, Trichoderma spp., Curvularia spp., Fusarium spp., Chaetomium spp., Cladosporium spp.) и на "не переваривающиеся" (Aspergillus
Эктосимбиозы
В кишечнике беспозвоночных создаются совершенно специфические условия, отличные от таковых в почве или опаде. Пищевой субстрат в кишечнике, как правило, подщелачивается и увлажняется до относительно постоянного уровня. Пищеварительные ферменты животных осуществляют гидролиз органических веществ опада, делая его более доступным для микроорганизмов (Стригано-ва,1980). Однако этот вопрос остается дискуссионным, существует мнение, что беспозвоночные животные не осуществляют гидролиза полимеров (Паников и др., 1985). По-видимому, животные могут регулировать и температурный режим своего тела, мигрируя по почвенному профилю в направлении более благоприятных гидротермических условий (Стриганова, 1980).
Ключевые факторы, которые определяют пригодность пищеварительного тракта для колонизации микроорганизмами, включают стабильность и относительную прочность кутикулярного слоя и разнообразие стимулов, возникающих в физиологических процессах животных. Последнее включает секрецию метаболи-зированных питательных и экскреторных продуктов, смягчение твердых кутику-лярных слоев жидким течением, амортизацию кислотно-основных и окислительно-восстановительных условий и перемешивание содержимого полости контактами со стенкой кишечника (Bignell, 1984).
Передний отдел кишечника многоножек слабо колонизирован микроорганизмами. Средний отдел представляет собой абсорбционную поверхность, поверх которойпостоянно секрутируется полупроницаемая перитрофическая мембрана. Она образуется на границе переднего и среднего отдела кишечника. Мембрана обволакивает пищевой субстрат, не давая ему контактировать с эпителием среднего отдела кишечника. В мембране есть отверстия размером около 0,1-0,2 мкм. Теоретически такая мембрана должна препятствовать проникновению подавляющему числу почвенных микроорганизмов к поверхности эпителия, хотя прямых доказательств этому нет. Перитрофическая мембрана состоит из хитина, белка и муко-полисахаридов. Чаще всего она разрушается в заднем отделе. В этом месте микроорганизмы, поглощенные с пищей, могут колонизировать поверхность кутикулы, а также попадать в средний отдел, продвигаясь в обратном направлении. Функции перитрофической мембраны до конца не ясны. Очевидно только, что она защищает эпителий среднего отдела кишечника от механического повреждения. Полупроницаемость мембраны также способствует радиальному перевариванию. Макромолекулы частично гидролизуются в эндоперитрофическом пространстве (внутри пищевого комка), ди- и олигомеры - в эктоперитрофическом пространстве (около эпителия), а конечные стадии переваривания происходят либо внутри клеток эпителия, либо на поверхности мембраны апикальных клеток эпителия, на которой находятся ферменты (Bignell, 1984; Hopkin, Read, 1992).
Кутикула заднего отдела кишечника имеет выросты и шипы разной формы, которые представляют местообитания для микроорганизмов (Crawford et al 1983). В просвет кишечника на границе среднего и заднего отделов впадают мальпигие-вы сосуды (орган выделительной системы). Их функция поставлять в кишечник жидкость, содержащую многие вещества гемолимфы в пропорциональных концентрациях. Эти секреты представляют собой не только питательный бульон со сбалансированным составом веществ, но и эффективный буферный раствор. Это создает благоприятные условия для микробной колонизации (Bignell 1984).Мальпигиевы сосуды участвуют также в экскреции продуктов азотного обмена. У многоножек это - аммоний (должен экскретироваться быстро) и мочевая кислота (может накапливаться в заднем отделе в твердом виде). Мочевина обнаруживается редко. Соотношение аммония и мочевой кислоты варьирует у разных видов, ighian tubules are also involved in excretion of nitrogenous wastes. Например, у Cylindroiulus londinensis 20% принебелкового азота в конечных продуктах приходится еа аммоний и 70% - на мочевую кислотуй. У Glomeris marginata 40% - аммоний и 33% - мочевая кислота (Hopkin and Read 1992). В экскрементах много-гножек (Glomeris marginata) мочевая кислота не обнаруживается. Это, возможно,свидетельствует о том, что мочевая кислота реутилизируется когда в пище недостаточно азота (Anderson, Ineson, 1983).
В среднем отделе кишечника многоножек аэробные условия. У Glomeris marginata ОВ-потенциал варьирует в пределах +267 - +307 mV. В заднем отделе условия умеренно восстановительные: ОВ-потенциал +167 - +277 mV (Bignell 1984). Значение рН в просвете кишечника близко к нейтральному: 6-8 (Bignell 1984).Наиболее хорошо изучена ферментативная активность в пищеварительном тракте макроартропод, моллюсков и дождевых червей.Многоножки. У многих многоножек обнаружены ферменты, гидролизющие
Микроорганизмы
Исследовали естественные сообщества сапротрофных микроорганизмов подстилки, почвы и вермикомпоста, естественные сообщества микроорганизмов кишечника и экскрементов многоножек (диплопод), мокриц и дождевых червей. В экспериментах использовали культуры аэробных органотрофных грамотрица-тельных и грамположительных протеобактерий, актиномицетов, дрожжей и мик-ромицетов, выделенные из почв, подстилок, пищеварительного тракта и экскрементов животных, либо полученные из коллекций. Культуры дрожжей любезно предоставлены И.П. Бабьевой, бактерий - Т.Г. Добровольской, Л.В. Лысак и Г.М. Зеновой, микромицетов - А.В. Кураковым. Штамм Pseudomonas stutzeri JM302 (pLV1013) - ауксотроф по гистидину, обладает хромосомной устойчивостью (R) к рифомпицину и налидиксовой кислоте, содержит рекомбинантную мобилизуемую плазмиду pLV1013 размером 9.6 мДа, кодирующую устойчивость к канамицину и стрептомицину и образование фермента катехол-2,3-диоксигеназы. Штамм P. putida PaW340 (pLV1017) - ауксотроф по триптофану, обладает хромосомной устойчивостью к стрептомицину, содержит рекомбинантную конь-югативную плазмиду pLV1017 размером около 45 мДа, кодирующую устойчивость к ампицилину, канамицину и тетрациклину и образование катехол-2,3-диоксигеназы. Штамм P. putida PaW340 - ауксотроф по триптофану, обладает хромосомной устойчивостью к стрептомицину. Штаммы Pseudomonas aeruginosa РА05 (RP4) и Enterobacter cloacae MF10 (RP4) - ауксотрофы по триптофану, обладают хромосомной устойчивостью к ри-фампицину, содержат природную плазмиду RP4 размером 46.6 мДА, кодирующую устойчивость к ампицилину, канамицину и тетрациклину (табл. 4). Все штаммы любезно предоставлены X. Клаусом (Германия). Бактерии выращивали в 50 мл жидкой среды LB в колбах на 250 мл. В среду добавляли растворы антибиотиков, простерилизованные фильтрацией через мембранный фильтр 0,2 мкм (MILIPORE).
Использовали следующие антибиотики (мг/мл). Для выращивания P. stutzeri JM302 (pLV1013): рифампицин - 20; нали-диксовая кислота - 50; стрептомицин - 15 и канамицин - 15; для P. putida PaW340 (pLVl017)\ ампицилин - 50, канамицин - 50 и тетрациклин - 50; для P. putida PaW340: стрептомицин - 2500; для P. aeruginosa РА05 (RP4) и Е. cloacae MF10 (RP4) - рифампицин - 100, ампицилин - 100, канамицин - 100 и тетрациклин -100. Во все среды добавляли 500 мг/ мл циклогексимида или 1000 мг/мл нистатина для подавления роста грибов. Бактерии выращивали при 30 С в течение 2-3 суток на круговой качалке при 150 об./мин. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 10 мин и отмывали дважды в 60 мМ фосфатном буфере, рН 7.6. Осадок ресуспендировали в том же буфере. Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли на агари-зованной среде LB, содержащей соответствующие антибиотики. Для идентификации колоний штаммов P. stutzeri (pLV1013) и P. putida (pLV1017), несущих плазмиды, по поверхности колоний распыляли раствор 1% катехола, приготовленный на фосфатном буфере. Колонии, обладающие активностью катехол 2,3-диоксигеназы, окрашивались в интенсивный желтый цвет за счет образования 2-hydroxymuconic semialdehyde. Для повышенной экспрессии активности катехол 2,3-диоксигеназы у штамма P. stutzeri (pLV1013) проводили предварительную индукцию генов плазмиды pLVl013 путем инкубирования при 37 С в течение 18 часов (Winstanley et al. 1990). Штамм Bacillus thuringiensis var. sotto 632 обладает хромосомной устойчивостью к рифампицину, образует 8-эндотоксин, активный против личинок Lepidopera (жесткокрылых насекомых). Использовали энтомопатогенные В. thuringiensis и В. sphaericus, отличающиеся устойчивостью к антибиотикам, связанной как с хромосомными мутациями, так и с наличием естественных коньюгативных плаз-мид рАМ@! \apBC16, а также способностью к синтезу различных токсинов (табл. 4). Выделение штаммов и их частичная характеристика по признакам строения, специфической активности кристаллов белковых 5-эндотоксинов, биохимическим тестам были проведены в лаборатории биоконтроля фитопатогенов Центра «Биоинженерия» РАН (Степанова и др., 1996). Первичный скрининг штаммов В. thuringiensis, синтезирующих термостабильные нематоцидные факторы (предположительно экзотоксины), был произведен на лабораторной культуре нематоды Caenorhabditis elegans (Степанова, Рябченко, персональное сообщение). У штаммов, изначально не обладавших устойчивостью к антибиотикам (В. thuringiensis var. galleria К7, В. thuringiensis var. israelensis 1-5 и В. thuringiensis var. sotto 632), были выделены мутанты с хромосомной локализацией устойчивости к рифампицину, методом последовательного культивирования на средах с возрастающими концентрациями антибиотика. Для этого 18-тичасовые культуры этих бацилл высевали на агаризованную среду LB (Merck, Darmstadt) с рифампи-цином, содержащую (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, ри-фампицин - 5 или 10 мг, агар - 15, рН 7,5. Колонии, выросшие на этих чашках затем пересевали на среду с рифампицином, 20 мкг/мл. Штамм В. thuringiensis var. galleria T4 (рАМр рВСІб) получен от Н.Ф. Ряб-ченко (Рябченко и др., 1988). Штамм В. thuringiensis var. israelensis 1-5 (pAMfij) был получен в данной работе из штамма В. thuringiensis var. israelensis 1-5 в результате конъюгативного переноса плазмиды pAMpi (17 мДа) от Enterococcus faecalis JH2-2 (рАМРЇ). Эта плазмида кодирует устойчивость к эритромицину.
Помимо энтомопатогенных бацилл в работе были использованы грамполо-жительные бактерии, принадлежащие к другим группам: бациллы, не являющиеся энтомопатогенами, и энтерококки (табл. 2). Генетически модифицированные штаммы рода Enterococcus spp. получены и любезно предоставлены Л. М. Руме-ром (Рябченко и др., 1988). Бациллы выделены в лаборатории биоконтроля фито-патогенов Центра «Биоинженерия» РАН. Энтерококки выращивали в жидкой среде М21 в течение 20 часов. Бациллы выращивали в жидкой среде LB в течение 12 часов. Затем небольшое количество культуры (около 100 мкл) переносили в свежую среду и выращивали еще 4-6 часов (Ryabchenko et al., 1988). Хищный нематофаговый гриб Arthrobotrys oligospora Fres.A18 был выделен из дерново-подзолистой почвы на среду Гетчинсона с целлюлозным фильтром В.Д. Мигуновой. В дальнейшем гриб выращивали на среде Чапека следующего состава (г/л): сахароза - 30, NaNC»3 - 2, К2НРО4 - 1, MgSC 4 х 7Н2 Э - 5, КС1 -0,5, FeSC 4 х 7Н2О -0,1, дрожжевой экстракт - 30, агар - 20, вода - 1 л. Культивирование проводили 2 недели до интенсивного образования конидий. Затем гриб счищали с поверхности агара, готовили водную суспензию, которую сначала фильтровали через тройной слой марли, а затем с помощью водоструйного насоса через мембранный фильтр с диаметром пор 2,5 мкм (SYNPOR). Сконцентрированную на фильтре биомассу смывали в 10 мл стерильной водопроводной воды. В результате была получена суспензия конидий A. oligospora с концентрацией 3,6 х 105/мл. Бактерии в эксперименте служили пищей для нематод в культуре и в почве. Для модельного эксперимента была выбрана грамположительная аэробная бактерия Micrococcus sp., выделенная из городской почвы. Перед инокуляцией бактерию выращивали в жидкой среде LB при 13 С в течение 2-х суток до поздней экспоненциальной фазы. Контроль скорости роста осуществляли, определяя оп
