Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Значение культуры шиповника 9
1.2. Особенности размножения плодовых гибридов шиповника и представителей рода Rosa L 11
1.3. Биологические основы размножения шиповника in vitro 15
1.3.1. Особенности этапа введения представителей рода Rosa L 17
1.3.2. Особенности этапа размножения представителей рода Rosa L 29
1.3.3. Физиологические нарушения, возникающие у роз в культуре in vitro. 42
1.3.4. Особенности этапов укоренения и адаптации представителей рода Rosa L 44
2. Экспериментальная часть 53
2.1. Цели и задачи исследований 53
2.2. Объекты, методика и условия проведения экспериментов 54
Микроклональное размножение 56
Учёты и наблюдения 64
2.3. Результаты исследований и обсуждение 66
2.4. Заключение 160
Выводы 163
Рекомендации производству 164
Библиографический список 166
- Особенности размножения плодовых гибридов шиповника и представителей рода Rosa L
- Особенности этапа размножения представителей рода Rosa L
- Объекты, методика и условия проведения экспериментов
- Результаты исследований и обсуждение
Введение к работе
Представители рода Роза, глубоко вошли в жизнь человека, его культуру, быт и традиции. Разнообразие сортов, форм и гибридов роз поражает - на момент 2000 года в мире насчитывалось свыше 24000 сортов (Сурина, Сурина. 2002). При этом природных видов насчитывается всего около 150-200 (по ряду источников до 400) видов (Хржановский 1958, Тахтаджан и др. 1981). На сегодняшний день роза применяется в качестве эфиромасличной, лекарственной и пищевой культуры (Магомедов, Мирошникова, Абдулгалимова 2003). Несмотря на то, что большинство сортов используется в качестве декоративной культуры, ряд сортов имеет важное пищевое и фармацевтическое значение.
Термин шиповник применяется по отношению к формам, гибридам, сортам роз, имеющим плодовое назначение и видам. Этот же термин считается русским эквивалентом латинского названия рода Rosa L. для видов распространённых на территории России (Усенко 1969, Губанов и др. 1995, Хржановский 1958, Тахтаджан и др. 1981). Ряд сортов и сортообразцов, выращиваемых в культуре представляет собой формы, отобранные из популяций диких видов. К таким сортам относятся «Крупноплодный ВНИВИ», «Российский 2», «Юбилейный» (Стрелец, Агафонов 1994). Морфология и габитус растений сортов, имеющих плодовое назначение, близок к габитусу диких, предковых представителей рода таких, как Р. коричная (R. cinnamomea L.), Р. морщинистая (R. rugosa Thunb.), Р. яблочная (R. pomifera Herm.), P. Уэбба (R. webbiana Wall.).
В настоящее время культура шиповника имеет два основных направления использования. Первое - плодовое, при этом используются мягкие оболочки гипантия - ложного плода, как в свежем виде, так и в виде концентратов для витаминной и пищевой промышленности. Второе -использование плодов (простых плодиков - костянок) для получения масла. Культура шиповника является одним из важнейших источников каротина и
4 аскорбиновой кислоты для пищевой и фармакологической промышленности. Его плоды содержат рекордные количества витамина С свыше 3000 мг% и витамина Р около 1000 мг%. Содержание каротина у отдельных сортов достигает 30 мг% (Стрелец 2000). Из наиболее важных и распространённых продуктов шиповника можно отметить следующие: сироп из плодов шиповника, сушёные плоды шиповника, витаминные концентраты из мякоти плодов шиповника. Значительная часть каротина, используемого в качестве красителя для пищевой и кондитерской промышленности, получается из плодов шиповника. Употребление плодов в свежем виде не столь распространено, но небольшое их количество способно удовлетворить суточную потребность в витамине С.
Шиповник является перспективной культурой для нечернозёмной зоны плодоводства, поскольку он обладает рядом уникальных качеств. Во-первых, это рекордное содержание витаминов в плодах, ни одна культура умеренной зоны не содержит такие количества аскорбиновой кислоты и витамина Р. Во-вторых, шиповник обладает высокой морозоустойчивостью и зимостойкостью а зона промышленного выращивания может быть продвинута до широты Санкт-Петербурга и Архангельска (Пименов и сотр. 1987). В-третьих, культура шиповника нетребовательна к качеству почв и может произрастать на относительно бедных почвах. Большинство сортов и форм способно ежегодно давать устойчивые урожаи, вне зависимости от погодных условий. Урожай с куста достигает у ряда сортов 4 кг с куста при схеме посадки 3 х 3 м, что соответствует урожайности 4,4 т с гектара. Средняя урожайность ряда сортов в условиях Средне-Волжской Зональной Опытной Станции достигала 6 т. с гектара (Пименов и сотр. 1998), по многолетним данным Крымской Опытной Зональной Станции шиповник на каменистых почвах способен в возрасте 5 лет давать урожаи по 2,0-2,5 т/га (Турсин и сотр. 1990). Сравнительно молодая в историческом плане культура шиповника уже достигла урожайности такой традиционной ягодной культуры, как смородина. Современные сорта отличаются по размеру ягод и
5 урожайности от диких видов более чем в три раза, превосходя их по содержанию витаминов и питательности. Средняя масса ложного плода шиповника коричного (R. cinnamomea L.) имеет среднюю массу в момент созревания 0,5 г., масса ложного плода шиповника разных сортов колеблется от 1,5 до 10 г (Стрелец 2000). Высота кустов сортов шиповника иногда более чем в полтора раза превышает высоту родительских видов. Побеги большинства сортов более мощные и долговечные, чем у предковых форм. Многие сорта такие, как «Витаминный ВНИВИ», «Пальчик», «Каштановый» несут на побегах меньше колючек, чем предковые сорта. Процесс селекции в настоящее время находится на этапе завершения отбора выдающихся форм из природных популяций и продолжении проведения активных внутривидовых и межвидовых скрещиваний. На сегодняшний день известно свыше двух десятков сортов шиповника, рекомендованных для промышленного производства. Среди наиболее перспективных сортов можно назвать такие сорта, как: «Витаминный ВНИВИ», «Воронцовский 1», «Воронцовский 3», «Каштан», «Крупноплодный ВНИВИ», «Победа» «Российский 2», «Титан», «Юбилейный», «Яблочный».
Приоритетными направлениями селекции шиповника на сегодняшний день считаются следующие. Во-первых, проводится создание сортов, обладающих плодами с большей долей мякоти. Во-вторых, отбор новых сортов шиповника должен быть направлен на улучшение органолептических характеристик плодов шиповника таких, как уменьшение количества плодиков - орешков и трихом внутри ложного плода. В-третьих, проводится поиск форм шиповников устойчивых к ржавчине и создание на их основе иммунных сортов (Стрелец, Агафонов 1994, Пименов и сотр. 1998).
Одной из характеристик многих сортов шиповника является его низкая способность к вегетативному размножению. Большинство сортов шиповника характеризуется слабой способностью к наращиванию побегов и вегетативной массы куста. Многие из них слабо образуют побеги возобновления. Размножение ряда сортов черенкованием, как зелёными, так
и одревесневшими черенками затруднено. Особенности вегетативного размножения сильно варьируют в зависимости от сорта и предковых видов. Низким ростом кустов и слабым наращиванием массы побегов обладают сорта и формы, полученные с участием шиповника морщинистого (R. rugosa). Слабой способностью к образованию побегов возобновления отличаются сорта «Глобус», «Каштан», «Титан», но они имеют среднюю способность к размножению зелёными черенками.
Трудности вегетативного размножения шиповников связаны, прежде всего, с особенностями их физиологии, биохимии и морфологии. Один из авторов установил закономерность, что сорта, происходящие из тёплых и влажных мест более способны к укоренению, чем сорта из сухих и холодных регионов (Сушков 1967). К трудно укореняемым сортам этим автором отнесены сорта Р. столепестной (R. centifolia), Р. дамасской (R. damascena L.), Р. альба (R. alba), Р. лютеа (R. lutea), Р. морщинистой (R. rugosa Thunb). Для каждого сорта шиповника способность к укоренению различна, в целом способность к размножению шиповников, как одревесневшими, так и зелёными черенками низкая по сравнению с большинством сортов декоративных роз.
В современном питомниководстве приняты и традиционно используются следующие виды размножения сортов и видов роз.
1. Прививка глазков или побегов на семенные или вегетативно
размножаемые подвои.
Размножение одревесневшими черенками.
Размножение зелёными, облиственными черенками.
Такие методы, как размножение отводками, размножение корневыми черенками и делением куста не получили широкого распространения в промышленном производстве, поскольку они имеют низкий коэффициент размножения и применимы не для всех сортов.
В настоящее время отмечается тенденция к переходу с привитой культуры роз и шиповника на корнесобственную (Баев, Джабаев 1998,
7 Турсин и сотр. 1990). Причиной тому служит ряд трудностей при
производстве привитых роз и некоторые отрицательные качества, которыми
обладают привитые розы. Для создания саженца привитой розы требуется не
менее 3-4 лет. При использовании в качестве подвоев сеянцев Р. собачей (R.
canina L.), Р. коричной (R. cinnamomea L.) и других видов существует
проблема низкой всхожести их семян. Основными недостатками привитых
роз, сильно осложняющими их культуру, являются, сильное образование
поросли и плохая совместимость ряда сортов, что делает привитую культуру
недолговечной.
Большинство сортов рода роза обладает достаточно устойчивой корневой системой и слабо повреждается неблагоприятными факторами окружающей среды в зимний период. По этой причине в большинстве регионов выращивания розы предпочтителен переход к корнесобственной культуре. Корнесобственные розы лишены недостатков привитых роз. Получить полноценный саженец можно за 1,5-2 года. Они не образуют поросли, а значит, они не требуют проведения ежегодной операции удаления побегов подвоя. Большинство корнесобственных роз более устойчивы благодаря тому, что они способны возобновлять побеги от подземной части куста, привитые розы такой возможности лишены.
Недостатком всех перечисленных методов размножения является так же о то, что все они являются одним из возможных путей передачи вирусных инфекций и карантинных заболеваний. Опасность вирусных и микоплазменных заболеваний состоит в том, они могут долгое время не проявлять себя в виде заметных симптомов и распространяться при вегетативном размножении. Вопрос чистоты посадочного материала от инфекции важен при возделывании культуры по интенсивной технологии, когда требуется частая смена насаждений и в питомниководстве, когда вегетативное размножение растений происходит особенно интенсивно. Вирусные и микоплазменные инфекции, отмеченные на розе и шиповниках способны сильно снизить продуктивность растений, качество продукции, их
8 иммунитет и способность к размножению. На розах отмечено распространение таких вирусных инфекций, как вирус кольцевой пятнистости сливы (Primus Necrotic Ringspot Virus), вирус кольцевой пятнистости томатов (Tomato Necrotic Ringspot Virus), вирус линейной и жилковой пятнистости розы (Rose Yellow Mosaic Virus) и многие другие вирусы (Сурина, Сурина. 2002, Bjarnason et al. 1985).
Одним из эффективных способов получения корнесобственных саженцев является метод микроклонального размножения. Культура in vitro роз на данный момент не является достаточно изученной, для того чтобы посредством её можно было успешно размножать все без исключения сорта и формы. Многие сорта роз способны успешно и активно размножаться посредством микроклонального размножения.
К моменту начала проведения работы в научных источниках не было обнаружено работ, посвященных микроклональному размножению сортов шиповника, имеющих плодовое назначение. Поэтому, культура микроклонального размножения роз и в особенности сортов шиповника требует более детального и глубокого изучения.
Настоящая работа посвящена изучению условий культивирования in vitro и состава искусственной питательной среды на микроклональное размножение гибридов шиповника.
Особенности размножения плодовых гибридов шиповника и представителей рода Rosa L
Генеративное размножение шиповника применяется только в ряде случаев, например в селекционном процессе. Плантации, заложенные сеянцами шиповника, показали неустойчивость проявления товарных признаков и большую гетерозиготность популяции. Сорта и формы шиповника и роз при размножении семенами теряют свои свойства и урожайность (Ильин, Ильина 1994; Турсин и сотр. 1990; Баев, Джабаев 1998). По этим причинам для шиповника, как и для других плодовых культур важна способность к вегетативному размножению.
Существует множество способов вегетативного размножения роз, но как показала практика и научные изыскания в области их размножения, наиболее выгодными, технологичными и продуктивными являются три способа. В промышленном производстве саженцев роз применяют размножение прививкой, черенкование полуодревесневшими черенками и размножение зелёными черенками (Баев, Джабаев 1998; Тарасенко, Новиков, Прохорова 1977). Несмотря на то, что до недавнего времени промышленное размножение проводилось при помощи прививки, большое количество исследователей признают преимущество корнесобственной культуры (Баев, Джабаев 1998). В ГБС АН им Цицина показано, что корнесобственные розы в климатических условиях Московского региона не отличаются по развитию и продуктивности от привитых роз (Юдинцева 1977). В условиях более благоприятных климатических условий южного берега Крыма и Дагестана показано преимущество корнесобственной культуры роз (Бабаев 1983; Бабаев, Джамбулатова 1980; Тарасенко, Новиков, Прохорова 1977). Корнесобственная культура является и экономически выгодной, поскольку время выращивания стандартных привитых саженцев составляет минимально 3 года, в то время как получить стандартный саженец корнесобственной розы можно за 1-2 года (Тарасенко 1991). Сложности создания привитых растений связаны и с получением подвоев. В качестве подвоев в промышленной технологии используются сеянцы шиповника, в то время как семена шиповника имеют всхожесть около 30-50 % (Курбонмамадова, Мамадризохонов 1999; Хржановский 1958). Привитая культура так же более трудоёмка в агротехнике, поскольку требует регулярного удаления поросли (Тарасенко 1991). Преимущество корнесобственной культуры показано и для шиповника (Турсин и сотр. 1990, Жидёхина 2003).
Альтернативой прививки в промышленном питомниководстве является размножение черенками. При этом для роз и многих шиповников (диких видов рода Rosa L.) считается более продуктивным и выгодным получение корнесобственных растений методом зелёного черенкования (Баев, Джабаев 1998; Тарасенко 1991). Укоренение одревесневших и полу одревесневших черенков у многих видов и сортов роз затрудненно. Например, при укоренении эфиромасличных роз одревесневшими черенками процент укоренения достигал 30-35%), в то время когда для черенкования использовались зелёные черенки укоренение ряда сортов 87-97% (Тарасенко 1991).
Различные формы и сорта шиповника имеют различное происхождение, что отражается на многих его признаках, в том числе и на способности к вегетативному размножению. Изучение ряда сортов и форм шиповника плодового назначения показали, что большинство из них обладает низкой способностью к укоренению, которая к тому же сильно зависит от погодных условий. В опытах, поведённых на одной из перспективных форм шиповника, показано, что укоренение его составляет от 33 до 49% (Мамадризохонов 2000). По данным, полученным в течение 3-х лет на Крымской ЗОС ВИЛР, средняя способность к укоренению легко укореняющегося сорта «Воронцовский 1» составила 82,7%), а для сорта «Витаминный ВНИВИ» со слабой способностью к размножению черенкованием она составила 32,7% (Турсин и сотр. 1990). Данные, полученные для сорта «Бесшипый», который, по мнению автора, считается легко укореняющимся, показали, что он достигает укоренения от 66,9 до 72,4%) (Жидёхина 2003). По мнению некоторых исследователей, занимающихся сортоизучением шиповника, способность к укоренению зелёных черенков считается оптимальной, если она не ниже 80% (Стрелец, Агафонов 1994). Это значит, что способность к укоренению многих сортов шиповника неудовлетворительная.
Согласно ботаническому описанию представители рода роза сходны по строению вегетативных органов. Несмотря на относительно большое число видов, по разным данным их количество колеблется от 200 до 400, все представители рода роза имеют единственную форму роста - многолетний кустарник, имеющий множество побегов и почки возобновления под поверхностью почвы или в непосредственной близости к ней (Сурина, Сурина. 2002; Хржановский 1958). Ветви роз состоят из полициклических побегов различного порядка ветвления. Побеги нулевого порядка могут быть вегетативными и смешанными, побеги последующих порядков в основном смешанного типа. Время жизни ветвей колеблется от 2 до 5 лет. Формирование почек возобновления проходит как в пазухах листьев оснований побегов, так и эндогенно в корнях, расположенных близко к поверхности почвы. Со временем в основании куста розы и шиповника формируется особый орган - ксилоподий, состоящий из тканей оснований корней и побегов, являющийся основным местом возникновения новых почек возобновления и новых побегов. Побеги роз и шиповников на поверхности несут большое количество шипов - выростов энациального происхождения.
При сходстве формы роста и морфологии растений роз и шиповников, розы имеют высокую способность к укоренению (Орлов 1973; Пухирь 1974), в то время как черенки шиповника укореняются слабо (Жидёхина 2003; Мамадризохонов 2000; Турсин и сотр. 1990).
Вместе с рядом сходных признаков с признаками розы для шиповника характерны особенности, отличающие его от большинства представителей декоративных сортов роз и их предковых видов. Такими особенностями являются, прежде всего: строгая цикличность развития ветвей и побегов, наличие выраженного периода покоя, способность образовывать придаточные почки на корнях и относительная недолговечность ветвей. Возможно, что эти особенности и определяют слабую способность черенков шиповника к укоренению.
Сравнительно низкая способность черенков шиповника к укоренению не является непреодолимым препятствием к получению корнесобственных саженцев, поскольку показано несомненное преимущество черенкования по сравнению с размножением прививкой (Турсин и сотр. 1990; Жидёхина 2003). Метод зелёного черенкования обладает рядом недостатков, общих для культуры роз и шиповника. Во-первых, черенкование роз и шиповника всегда связано с образованием ран с большой площадью поверхности и массой каллусной ткани, которые часто служат воротами для инфекций (Мамадризохонов; Коровин 1999). Во-вторых, все три перечисленных метода, принятых в промышленном производстве, служат способом передачи опасных вирусных и микоплазменных заболеваний. По ряду источников, роза и шиповник могут быть хозяевами около десятка различных вирусов (Синадский и сотр. 1990; Сурина, Сурина. 2002; Bjarnason et al. 1985). Вирусы могут инфицировать и ряд других плодовых культур, что делает их более опасными (Метлицкая 2001; Приходько 2001; Упадышев 2003). Решить перечисленные проблемы, связанные с методами традиционного вегетативного размножения возможно путём освоения метода микроклонального размножения розы и шиповника.
Особенности этапа размножения представителей рода Rosa L
Ряд авторов, применявших различные составы питательных сред, признавали в качестве оптимальной среды для размножения роз среду МС (Глежери 1990; Пилунская Бугара 2000). Другие исследователи признавали преимущество для стерильной культуры роз сред WPM (Kyte, Kleyn 1999) и Девиса-Хасегавы (Lozoya 1992).
Исследования состава среды для стерильной культуры роз не ограничивались исследованием различных составов известных сред. Ряд исследователей применяли различные модификации среды МС. Наиболее часто исследователи использовали снижение концентрации аммония в составе среды (Avramis et al. 1982b; Curir et al. 1986; Hyndman et al. 1982b; Valles and Boxus 1987). В качестве основного положительного эффекта от снижения концентрации аммонийного азота было обнаружено увеличение длины микропобегов в конгломерате, увеличение количества узлов у микропобегов и уменьшение количества недоразвитых побегов.
Один из видов модификации среды для размножения роз - снижение общей концентрации макроэлементов в прописи МС (Abdulnour et al. 1994; Bressan et al. 1982; Davies 1980). Тем не менее часть исследователей не отмечали положительного эффекта от снижения общей концентрации макроэлементов (Davies 1980), другие же указывали на отрицательный эффект снижения концентрации макроэлементов (Bressan et al. 1982).
Установлено положительное влияние на рост и размножение роз увеличение концентрации таких элементов, как магний кальций и железо (Красильникова 2000; Podwyszynska, Goszczynska 1998; Podwyszynska, Olszewski 1995). Исследователи, изучавшие влияние концентраций кальция на рост и развитие растений роз in vitro, отмечали снижение количества хлоротичных листьев и отмирания верхушек. Увеличение в 1,5 раза кальция и магния и двукратное увеличение железа и марганца для размножения декоративных, эфиромасличных и ряда диких видов роз - Р. многоцветковой (R. multiflora), Р. иглистой (R. acicularis) и Р. дивина (R. divina) (Красильникова 2000; Красильникова 2001). Другие исследователи применяли только двукратное увеличение кальция и магния, без изменения концентрации других элементов (Podwyszynska, Goszczynska 1998; Podwyszynska, Olszewski 1995).
Прочих модификаций среды МС или модификаций других сред в культуре роз на момент проведения анализа научных источников не было обнаружено. У микропобегов роз на среде МС исследователи отмечали небольшую высоту. Согласно разным источникам высота микропобегов колебалась от 0,5 до 2,5 см (Красильникова 2000; Ghashghaie et al. 1991; Horn 1992; Marcelis-van Acker and Scholten 1995; Podwyszynska, Olszewski 1995). Кроме небольшой высоты микропобегов роз исследователи обнаруживали появление верифицированных побегов, и отмирание их верхушек при культивировании витрорастений на среде МС (Ghashghaie et al. 1991; Horn 1992). Образование некрозов верхушек микропобегов на среде МС отмечалось и другими исследователями (Podwyszynska, Goszczynska 1998; Podwyszynska, Olszewski 1995).
Противоречивые данные относительно потребности роз в элементах питания при их культивировании in vitro требуют дополнительных исследований этого вопроса. Отмеченные разными исследователями особенности развития роз в стерильной культуре на среде МС свидетельствуют о необходимости проведении глубоких исследований влияния элементов питания на рост роз и шиповника in vitro. Исследования, описанные в различных работах, предполагают необходимость проведения дальнейших исследований.
Во-первых, обнаруженное положительное влияние снижения концентрации аммонийного азота в среде для микроразмножения роз указывает на важную роль азотистых соединений в обеспечении нормального развития роз in vitro. Известно, что различные концентрации иона аммония способны оказывать морфогенетический эффект на микропобеги роз (Hyndman et al. 1982b). Возможные пути дальнейшей оптимизации среды для роз, могут быть определены на основании данных о физиологических основах транспорта и поглощения веществ. Ион аммония не обнаруживается в цитоплазме и пасоке, хотя крайне активно впитывается клетками растения, а его поступление в клетки облегчено отрицательным потенциалом, существующим на мембране клетки. Практически весь меченный радиоактивный азот, поступивший в растения в виде аммония, обнаруживался в составе органических кислот (Ivanko, Inguerson 1971; Курсанов 1957, 1962; Кулаева 1957 и др.). Основные вещества, которые при этом служат переносчиками азота при реакциях переаминирования, являются глутамин, глутаминовая кислота, аспарагин и аспарагиновая кислота. Центральной реакцией является амнирование а-кетоглутаровой кислоты с образованием глутаминовой кислоты (Кулаева 1957; Дубинина 1965). Аммонийный азот не способен депонироваться и очень быстро должен включаться в метаболизм.
Нитрат анион, напротив способен быстро передвигаться по сосудистой системе растения и является практически единственной транспортной неорганической формой азота. Половина всего азота, обнаруживаемого в пасоке представлена нитрат анионом (Ivanko, Inguerson 1971). Нитрат в пасоке содержится в более высокой концентрации, чем в питательном растворе, в который погружены корни растения (Кларксон 1978). Поглощение нитрата происходит против электрохимического градиента с использованием энергозависимого транспорта (Hoagland, Davis 1929). При этом усвоение нитратного азота и включение его в метаболизм происходит постепенно и в разных частях растения. Нитрат анион достаточно долго может депонироваться в вакуолях первичной коры корня и долго выделяться (до 22 ч, с момента прекращения поглощения корнем) в просветы проводящих элементов ксилемы. Включение нитратного азота в органические вещества в растении может происходить, как в корнях, так и надземных органах. Поглощение анионов происходит аналогично поглощению нитрат аниона. Скорости поглощения фосфата и хлорид анионов зависят от интенсивности метаболизма клетки (Smith 1966; Кларксон 1978). Перечисленные особенности поглощения и транспорта разных форм азотистых соединений могут быть использованы при изучении их влияния на рост растений in vitro и объяснения результатов исследований. Токсичность аммония и его интенсивное включение в метаболизм подтверждает необходимость снижения его концентрации в среде для размножения роз. Различия в скорости поглощения и транспорта нитратного и аммонийного азота могут быть использованы для управления метаболизмом растений, изменение которого способно сильно повлиять на морфогенез витрорастений роз. Способность аммонийных соединений азота активно включаться в органические кислоты показанная множеством исследований, возможно, определяет концентрацию воды в тканях растений, а, следовательно, и вероятность возникновения витрификации. Эта особенность соединений азота указывает так же на необходимость не только уменьшения концентрации аммония в среде, но и на необходимость снижения общей концентрации азота.
Объекты, методика и условия проведения экспериментов
Все опыты по изучению микроклонального размножения гибридов Шиповника и декоративных сортов Роз проводились в лаборатории плодоводства МСХА им. К.А. Тимирязева в лаборатории микроклонального размножения.
Опыты по адаптации в период с 2002-2003 г. растений к нестерильным условиям проводились в теплицах 2-го отделения ГУП Калининградского СДС, по адресу г. Москва ул. Академика Скрябина вл. № 17. Часть опытов по адаптации не укоренённых микрочеренков роз и укоренённых черенков шиповника проводилось в комнате для адаптации лаборатории микроклонального размножения лаборатории плодоводства МСХА им К.А. Тимирязева.
Лаборатория микроклонального размножения лаборатории плодоводства МСХА им. К.А. Тимирязева занимает площадь приблизительно равную 230 м2 на втором этаже лабораторного здания опытной станции.
Стерильная операционная (10 м2), в которой производились введение эксплантов в культуру и пересадка стерильных культур оборудована двумя стационарными люстрами ультрафиолетового света бактерицидного диапазона. Для пересадки стерильных культур в операционной установлены два ламинар-бокса КПГ. Две операционных объединены через комнату -тамбур, которая несёт функцию дополнительной защиты от внешнего загрязнения.
В комнате для мытья посуды и стерилизации сред (20 м ) установлены два автоклава вертикальной загрузки на 20 и 40 л, и оборудование для мытья, термической обработки посуды и дистилляторы воды, стеллажи, предназначенные для хранения химической посуды.
Комната для приготовления среды и работы с реактивами (30 м ) оборудована вытяжным шкафом, столами для приготовления среды с электроплитками и столами с техническими и аналитическими весами, холодильниками для хранения органических компонентов сред. Часть этой комнаты отделена пластиковой перегородкой и оборудована широкими столами для проведения опытов по адаптации растений в стерилизованном субстрате (30 м ).
Световая комната со стеллажами для размещения растений, культивируемых в стерильной культуре (60 м) представляет собой изолированное помещение, сообщающееся с центральным коридором через специально оборудованный тамбур со стеклянной перегородкой. Световая комната занята столами и стеллажами для размещения сосудов с растениями. В ходе экспериментов использовалось стандартное оборудование, применяемое в технологии микроклонального размножения растений. Для приготовления среды использованы следующие приборы. Весы технические, лабораторные с точностью измерения 10 мг. (точность - минимальная цена деления). Весы аналитические с точностью измерения 0,05 мг. (точность - половина минимальной цены деления подвижной шкалы). Плитка электрическая для разогрева среды и расплавления агара. Дистиллятор электрический проточного типа. Автоклав вертикальный ... с ёмкостью стерилизационной камеры 30 л. Шкаф сухожаровой с конвекционным распределением воздуха, шкаф сухожаровой с принудительной вентиляцией.
Камеры тонкой очистки воздуха от пылевых примесей с ламинарным горизонтальным потоком воздуха (ламинар-боксы) КПГ-5 Предназначены для работы со стерильными средами в асептических условиях. Данная марка ламинар-бокса оснащена НЕРА фильтром. Стеллажи размещались в специально отведённом помещении - световой комнате. Каждый стеллаж имеет 3 полки шириной 1 м., с нижней стороны каждой полки крепятся двухламповые светильники, обеспечивающие освещённость на поверхности полок 4 000 лк. Светильники исполнены с вынесенными дросселями во избежание избыточного нагрева полок.
Освещение в световой комнате контролируется автоматическим реле времени 2-РВМ. В световой комнате во время проведения опытов была установлена продолжительность искусственного светового дня 12 ч. При этом включение освещения производилось в ночное время в 3 —, а отключение происходило соответственно в 15 —. Адаптация растений производилась в теплицах на территории 2-го отделения Калининградского Совхоза Декоративного Садоводства, по адресу г. Москва ул. Академика Скрябина вл. № 17. Конструкции теплиц были возведены по стандартному проекту в 1973 г. Укоренение происходило в технических пластиковых сосудах диаметром 25 см «Poppelman», установленных на бетонных стеллажах теплицы. Микроклональное размножение. В качестве основной среды для предварительного изучения изолированной культуры роз и шиповника была использована среда с минеральной основой по прописи МС. Среда была дополнена сахарозой - 30 г/л, пиридоксина гидрохлоридом, никотиновой кислотой, тиамина гидрохлоридом по 0,5 мг/л, аскорбиновой кислотой - 1 мг/л и мезоинозитом - 100 мг/л. Концентрация агара - 6 г/л. Концентрация 6-БАП 1-1,5 мг/л.
Методика приготовления сред производилась по стандартной, общепринятой схеме. Данная схема описана во многих источниках и может применяться с различными модификациями (Г.П. Болвел, Дж.В. Чалман, Р.А. Диксон и др. 1989, Бутенко Р.Г. 1964, Murashige Т., Skoog F. 1962, Kyte L., Klein J. 1999) . В случае приготовления модифицированных сред, необходимых в небольших количествах и сред для опытных вариантов методика приготовления среды модифицировалась. Изменялись только первые три пункта методики приготовления среды.
При этом производилось приготовление маточных растворов хелата железа и маточных растворов органических компонентов, которые хранились при низких положительных температурах. Далее производилось последовательное растворение маточных растворов в объёме дистиллированной воды необходимом для приготовления одной партии среды. А минеральные соли добавлялись индивидуально в виде отдельных навесок сухих форм, согласно рассчитанным прописям и схемам опытов. После разлива среды сосуды со средой закрывались сверху светопроницаемой плёнкой из целлофана, которые фиксировались резиновыми лентами. Пробирки перед стерилизацией предварительно упаковывались в целлофановую плёнку.
Результаты исследований и обсуждение
Анализ научных источников позволил установить, что сорта, происходящие от Шиповника коричного и Шиповника Уэбба, характеризуются невысокой способностью к вегетативному размножению, сорта, происходящие от Шиповника морщинистого, напротив, легко размножаются черенкованием. Собственные исследования показали, что способность к размножению зелёными черенками такого представителя шиповников, как «Витаминный ВНИВИ», крайне низка. Укоренение было проведено совместно с аспирантом Акимовой СВ. на базе отделения зелёного черенкования плодовых и декоративных культур лаборатории плодоводства МСХА им К.А. Тимирязева. В качестве маточников были взяты растения шиповника «Витаминный ВНИВИ». Для черенкования использованы четырёхузловые сегменты побегов первого порядка. Перед высадкой основания черенков обрабатывали в течение 3 часов в водном растворе индолил-3-масляной кислоты в концентрации 35 мг/л. Посадка была произведена в гряды теплиц для укоренения зелёных черенков оборудованные системой искусственного тумана. Грунт в грядах состоял из смеси торфа и перлита в объёмном соотношении 1/1. После прохождения периода укоренения происходил осмотр и описание растений. Процент укоренения составил 3,1 процента. Доля укоренившихся растений такого сорта шиповника, как «Яблочный» составила 36,6 %, укоренение проводилось по той же методике, что и укоренение сорта «Витаминный ВНИВИ» (Аладина, Акимова неопубликованные данные 2004). Применение препарата «Циркон» в концентрации 0,25 мл раствора концентрата/л вызывало укоренение только у 33,3 %, повышение концентрации «Циркона» до 0,5 мл/л увеличивало укоренение черенков до 90,0 % (Аладина, Акимова неопубликованные данные 2004). Микроклональное размножение сортов Шиповника может потенциально отличаться от размножения большинства представителей рода Роза. Эти отличия основаны, прежде всего, на особенностях физиологии и биохимии растений Шиповника. Были определены основные проблемы, с которыми, потенциально, пришлось бы столкнуться в ходе исследований изолированной культуры сортов шиповника. 1. Избыточные концентрации аскорбиновой кислоты в вегетативных тканях шиповника в связи с высоким её содержанием в плодах. 2. Недостаточно благоприятная среда для регенерации и размножения эксплантов и микропобегов шиповника. 3. Зависимость гормонального статуса растений шиповника от фенофаз, в связи с чётко выраженным годичным циклом развития его побегов. 4. Высокая концентрация эндогенных фенольных ингибиторов и танинов, оказывающих отрицательное влияние на приживаемость эксплантов.
В ходе исследований было установлено содержание аскорбиновой кислоты в вегетативных тканях шиповника. Предположение о содержании высоких концентраций аскорбиновой кислоты основано на наличии корреляции между концентрациями различных веществ в разных органах одного и того же растения.
Проведённые анализы установили наличие высокой концентрации аскорбиновой кислоты в вегетативных тканях шиповника. В качестве опытного образца были взяты различные органы шиповника в разное время года. Её высокая концентрация была установлена в зимнее время (февраль), когда в тканях шиповника ожидалось обнаружить минимальные количества аскорбиновой кислоты. Максимальная концентрация была в активно фотосинтезирующих листьях - 312 мг процентов. Зимние побеги, в ряде случаев, могут содержать несколько большую концентрацию аскорбиновой кислоты по сравнению с летними вегетирующими побегами (таблица 1).
Анализы аскорбиновой кислоты, приведённые в двух таблицах, показали существенную разницу между концентрациями этого вещества в декоративных сортах розы и шиповнике in vivo. Концентрация аскорбиновой кислоты в узлах вегетирующих побегов шиповника оказалась в 3,2 раза чем в узлах побегов декоративного гибрида розы «Red Асе». Даже зимующие побеги шиповника сорта «Витаминный ВНИВИ» содержали в 3,2 раза больше витамина С, чем вегетирующие побеги розы сорта «Red Асе». Концентрация витамина С в листьях шиповника превосходила его концентрацию в листьях розы сорта «Red Асе» в 5,4 раза. На основании анализов была установлена особенность шиповника, при введении в изолированную культуру концентрация эндогенной аскорбиновой кислоты у него сильно понижается до 25,1 мг %. Столь же низкая концентрация отмечена и у одного из сортов плетистой розы «Pink Sunblase».
Такие отрицательные признаки как витрификация, недоразвитие листового аппарата, слабое развитие побегов, нефункциональный устьичньш аппарат имеют, как привило, общую физиологическую основу - нарушенный водный обмен растения, вызванный соответствующими условиями культивирования. Это подтверждается большинством исследователей, исследовавших проблему водного обмена растений in vitro (Horn, Schlegel, John 1988, Ghashghaie, Brenckmann, Saugier 1991).
Результаты опытов по введению роз и шиповника на среду МС установили, что эта среда не является благоприятной для развития их эксплантов. Она вызывает активный рост каллуса и недостаточное количество эксплантов, начинающих пролиферацию. В связи с чем, было принято решение о проведении опытов по изучению влияния количественного и качественного состава среды на различных этапах культуры in vitro.
На основании результатов опыта было выявлено, что экспланты роз на этапе введения требуют относительно невысокой концентрации калия и пониженной концентрации азотистых веществ, по сравнению с уровнем их в среде МС. Установлены различия в потребности к концентрации азота в зависимости от генотипа. Результаты опыта подтвердили то, что и калий и азот существенно влияют на наличие верифицированных побегов и нарушения органогенеза. На основании данных опыта была подобрана среда наиболее оптимальная для введения растений в культуру in vitro. Было отмечено, что среда наиболее близкая по составу к среде МС с соотношением K/N - 20/60 ммоль оказалась наименее благоприятной для развития эксплантов (таблицы 7,8 и 9). Наиболее полно удовлетворяла потребности всех сортов роз среда с соотношением K/N - 10/30 ммоль. На данной среде наблюдалась максимальная средняя по сортам приживаемость - 96%, минимальный процент растений, образовавших каллус - 27%, и относительно высокая тенденция эксплантов образовывать конгломерат уже на этапе введения - 38% в среднем по сортам.
