Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о гемолитико-уремическом синдроме у детей .10
1.1.1.Введение 10
1.1.2.Классификация ГУС .12
1.1.3.Типичный ГУС 13
1.1.4.Атипичный ГУС 15
1.2. Определение и классификация тромбофилии 24
1.2.1. Наследственная и приобретенная тромбофилия .24
1.2.2. Механизмы реализации и клинические проявления тромбофилии29
1.2.3. Поражение почек при тромбофилии .33
1.2.4. Современные представления о значении полиморфных маркеров генов широко распространенных заболеваний .35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Общеклинические методы исследования 46
2.2. Специальные методы исследования 48
2.3. Статистический анализ 55
ГЛАВА 3. Клиническая характеристика пациентов, участвующих в исследовании57
2.1. Клиническая характеристика больных с гемолитико-уремическим синдромом 57
2.2. Клиническая характеристика больных с острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома69
ГЛАВА 4. Влияние генетически обусловленной тромбофилии на развитие и тяжесть клинических проявлений гемолитико-уремического синдрома у детей.
4.1. Исследование полиморфизмов генов свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом
4.1.1. Исследование гена фибриногена (FGB G(455)A)
4.1.2. Исследование гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR С677Т)
4.1.3. Исследование гена ингибитора активатора плазминогена (PAI-1 4G(675)5G)
4.1.4. Исследование гена тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P).
4.1.5. Исследование гена протромбина (PTG G 20210 A)
4.1.6 Исследование мутации Лейден (FV Leiden G1691A) .
4.2. Исследование влияния «протромбогенных» аллелей на тяжесть течения гемолитико-уремического синдрома
4.3. Влияние полиморфизмов генов свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом на показатели гемостаза
4.4. Оценка тяжести клинических проявлений гемолитико-уремического синдрома с использованием шкалы «протромбогенных аллелей»
ГЛАВА 5. Сравнительный анализ частоты встречаемости полиморфных маркеров генов системы свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом и острой кишечной инфекцией без почечного повреждения.
5.1.Сравнительный анализ частоты распределения полиморфизма генов системы свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом и острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома.
5.2. Сравнительный анализ частоты мутаций генов свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом и острой кишечной инфекции без гемолитико-уремического синдрома
5.3. Сравнительный анализ комбинаций полиморфизмов генов системы свертывания крови
Обсуждение результатов..
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Механизмы реализации и клинические проявления тромбофилии
- Клиническая характеристика больных с острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома
- Исследование полиморфизмов генов свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом
- Сравнительный анализ частоты распределения полиморфизма генов системы свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом и острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома
Введение к работе
Актуальность исследования. Гемолитико-уремический синдром (ГУС) - наиболее распространенная причина острой почечной недостаточности (ОПН) в детском возрасте с пиком заболеваемости до 6,1 на 100000/год у детей младше 5 лет. Летальность в остром периоде ГУС колеблется от 2,5 до 12%, достигая 60-90% без применения диализной терапии. В 4-20% случаев в исходе ГУС развивается тяжёлая артериальная гипертензия и хроническая почечная недостаточность.
Патоморфологической основой ГУС является тромботическая микроангиопатия (ТМА). Исследования последнего времени расширили представления о патофизиологических механизмах развития ГУС, что позволило дифференцировать различные варианты синдрома на основании их этиопатогенеза, определить долгосрочный прогноз и эффективность терапии.
Несмотря на то, что ГУС считают локально-почечной формой поражения почек у детей, он, как правило, сочетается с микрососудистым тромбообразованием в сосудах головного мозга, легких, кишечника, печени, сердца, приводя к развитию полиорганной недостаточности с нарушением витальных функций.
В последние годы установлена связь между развитием тромбозов различной локализации и генетически обусловленной тромбофилией в отсутствие традиционных факторов риска. Вероятность формирования гиперкоагуляционного состояния возрастает с числом выявленных прокоагулянтных генотипов. В ряде публикаций показано влияние тромбофилии на риск развития ТМА (Sucker C. et al, 2009), а также доказана её взаимосвязь с повышенным риском развития акушерской патологии, антифосфолипидного синдрома, ишемического инсульта (Макацария А.Д. с соавт., 2006; Козловская Н.Л., с соавт., 2009; Adamski M.G. et al., 2009; Rai R. et al., 2009). Goforth R.L. et al. (2006) опубликованы данные о роли генетически обусловленной тромбофилии в формировании нефросклероза у больных в отсутствие хронического гломерулонефрита, сахарного диабета и артериальной гипертонии. Исследование Бобровой Л.А. (2010) продемонстрировало, что сочетание «протромбогенных генотипов» генов MTHFR C677T, PAI-1 4G(-675)5G, FGB(-455)G/A, ITGB3 L33P способствует более быстрому прогрессированию гломерулонефритов.
Вклад генетической тромбофилии в формирование и прогрессирование ренальной ТМА при ГУС до настоящего времени не изучен. Между тем комплексное изучение генетических маркеров и клинических особенностей ГУС может расширить представление о прогностических факторах, отдельных патогенетических механизмах, особенностях течения и подходах к лечению данного синдрома.
Всё вышеизложенное послужило основанием для проведения данного исследования.
Цель исследования: изучить влияние генетически обусловленной тромбофилии на развитие и клинические проявления гемолитико-уремического синдрома у детей для оптимизации терапии и прогноза заболевания.
Задачи исследования:
-
У детей с ГУС и острой кишечной инфекцией (ОКИ), но без ГУС, определить частоту встречаемости полиморфных аллелей генов системы свертывания крови: FGB, MTHFR, PAI-1, ITGB3, PTG, FVL.
-
Провести сравнительный анализ полиморфизмов исследованных генов гемостаза у детей с ГУС (основная группа) и острой кишечной инфекцией без ГУС (контрольная группа).
-
Оценить диагностическое значение некоторых маркёров тромбофилии при ГУС у детей.
-
Выявить особенности клинических проявлений ГУС в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов системы свертывания крови (FGB, MTHFR, PAI-1, ITGB3, PTG, FVL).
Научная новизна исследования:
Впервые проведено комплексное изучение наиболее распространенных в популяции маркёров генетически обусловленной тромбофилии у детей с ГУС и ОКИ без почечного повреждения.
У всех детей с ГУС обнаружено носительство полиморфных маркеров генов гемостаза. Установлено, что при ГУС выявляется наибольшее количество комбинаций полиморфизмов генов и сочетание «протромбогенных аллелей» (гомозиготное носительство MTHFR С677Т, ITGB3 L33P, PAI-1 4G(675)5G; гетерозиготное носительство PTG G20210A, FVLeiden G1691A, FGB G(-455)A) по сравнению с детьми с ОКИ без ГУС.
Доказано, что тяжесть течения ГУС определяется не только количеством мутаций, но и «протромбогенным» потенциалом с преобладанием в структуре гомозиготных генотипов.
Впервые определена связь основных клинико-лабораторных проявлений ГУС с наличием полиморфных аллелей исследуемых генов. Установлено, что носительство генотипа А/А гена FGB G(-455)A, Т/Т гена MTHFR С677Т, 4G/5G и 4G/4G гена PAI-1 4G(675)5G, L/P и P/P гена ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P) определяет гетерогенность клинических проявлений, органную дисфункцию и тяжесть почечного повреждения при ГУС.
Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость проведения молекулярно-генетических исследований при ГУС у детей, что позволяет выявить факторы риска неблагоприятного почечного исхода.
Практическая значимость:
Результаты проведенного исследования позволяют выделить наследственную тромбофилию как фактор тяжести течения заболевания, риска прогрессирования нефропатии, что диктует необходимость проведения генетического исследования носительства полиморфных маркеров генов гемостаза у детей с ГУС. Полученные данные позволяют оптимизировать антитромботическую терапию у этих пациентов. Определение числа «протромбогенных аллелей» необходимо для выявления групп риска больных с неблагоприятным почечным и общим прогнозом. Результаты работы обосновывают целесообразность диспансерного наблюдения с повторным исследованием маркеров активации внутрисосудистого свертывания крови (Д-димер, РКФМ, фибриноген, Хагеман-зависимый лизис, антитромбин III) у пациентов с «протромбогенным» профилем в 4-7 баллов для определения объёма, длительности лечебных и профилактических мероприятий после перенесенного ГУС. Для снижения риска прогрессирующего поражения почек в катамнезе ГУС рекомендуется исследование полиморфизмов генов тромбофилической направленности и показателей активации внутрисосудистого свертывания крови у ранее не обследованных пациентов с целью обоснования и оптимизации последующей антитромботической терапии для улучшения почечной микроциркуляции и предотвращения развития почечной недостаточности.
Положения, выносимые на защиту:
-
У детей с ГУС чаще, чем в популяции, встречается гетерозиготный и гомозиготный генотипы генов системы свертывания крови.
-
Наследственная тромбофилия влияет на тяжесть клинических проявлений, степень почечного повреждения, исход и прогноз заболевания ГУС.
-
Гетерогенность клинических проявлений, органная дисфункция, тяжесть почечного повреждения при ГУС определяется количеством мутаций и числом «протромбогенных аллелей».
Личный вклад соискателя в получении научных результатов, изложенных в диссертации:
Автором лично был проведен сбор материалов для молекулярно-генетического исследования, обработаны истории болезней и заполнена база данных. В процессе работы автором был освоен статистический анализ информации с помощью статистической программы IBM SPSS 21.
Внедрение в практику. Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении больных в Центре гравитационной хирургии крови и гемодиализа ГБУЗ «ДГКБ св. Владимира ДЗМ», в отделе детского диализа и гемокоррекции МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, основные положения диссертации включены в лекционный курс на кафедрах педиатрии ГБОУ ВПО МГМСУ им.А.И.Евдокимова, нефрологии и гемодиализа ФППОВ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Апробация работы
Апробация работы проведена 27 февраля 2014 года на заседании кафедры педиатрии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова. Материалы работы доложены и обсуждены на Всероссийском конгрессе нефрологов (Санкт-Петербург, сентябрь 2009г.), VII съезде научного общества нефрологов России (Москва, октябрь 2010г.), Всемирном конгрессе нефрологов (Милан, май 2009г.), XLVII Европейском конгрессе нефрологов (ERA-EDTA Мюнхен, июнь 2010г.), IX Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, октябрь 2010г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации:
Механизмы реализации и клинические проявления тромбофилии
Сегодня считается общепризнанным, что в 1865г R.Virchow заложил основы гемостазиологии, выдвинув гипотезу, согласно которой для образования тромба в сосуде необходимы три условия, получившие название «триады Вирхова»: повреждение стенки сосуда, замедление кровотока и нарушение процесса свертывания крови. В дальнейшем были обнаружены различные факторы свертывающей системы крови и фибринолиза, что позволило выдвинуть предположение о существовании гемостатического баланса между образованием и растворением сгустка фибрина. Нарушение этого баланса приводит к кровотечению или развитию тромбозов.
Активация системы гемостаза сопровождается появлением в кровотоке специфических маркеров, демонстрирующих гемостатический потенциал крови [17]. Выделяют маркеры активации тромбоцитов (тромбоцитарный фактор 4,бетта-тромбоглобулин) и маркеры активации коагуляционного каскада, к которым относят фрагмент «1+2» (продукт протеолиза протромбина), тромбин-антитромбиновый комплекс, фибрин-мономер, фибринопептид А и D-димер. Однако на определение практически всех из них, за исключением D-димера, могут оказывать влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, что также является осложняющим фактором. Определение D-димеров - продуктов деградации поперечно-сшитого фибрина плазмином в этом отношении является исключением. На результаты их исследования практически не влияют вышеперечисленные условия, что и определило значимость оценки данного маркера в клинической практике для диагностики тромбоза. Кроме того, из всех перечисленных маркеров активации гемостаза D-димеры имеют наиболее длительный период жизни, около 6 часов, что позволяет проводить их определение с наибольшей степенью точности. Как известно, под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, образующий основной каркас сгустка крови и тромба. Процесс превращения фибриногена в фибрин проходит стадии [132]. В первую стадию под действием тромбина от фибриногена отщепляются два фибринопептида А от альфа и два фибринопептида В от бетта цепей, оставляя альфа и бетта -цепи, входящие в состав образующегося фибрин мономера. Последний состоит из 2-х доменов D и домена Е. В следующую стадию мономерные молекулы фибрина соединяются друг с другом бок в бок и конец в конец, и формируют сеть "растворимого" фибрина. Таким образом формируются водородные связи между D-доменами одной молекулы и Е-доменом другой молекулы. Далее фибриновая сеть стабилизируется под действием фактора свертывания ХIIIа, который катализирует образование связей "конец в конец" между у-цепями двух соседних мономерных молекул, что приводит к образованию нерастворимого фибрин-полимера, отличающегося от растворимого тем, что в нем D-домены соседних молекул фибрин-мономера ковалентно связаны между собой с образованием D-димерных комплексов. Конечным продуктом процесса свертывания крови является фибрин, служащий субстратом для плазмина - основного фермента фибринолиза. Плазмин вызывает последовательное асимметричное расщепление фибриногена и фибрина на все более и более мелкие фрагменты, обозначаемые как продукты деградации фибрина. Фибринолитическая система обеспечивает лизис фибрина и растворимых фибрин-мономерных комплексов, но при чрезмерной активации фибринолиза возможен и лизис фибриногена [43]. При расщеплении поперечно-сшитых фактором ХIIIа волокон фибрина образуются крупные фрагменты - D-димеры, тримеры D-ED, поскольку плазмин не способен разрезать ковалентную связь между D-доменами [45,60]. У здоровых людей концентрация D-димера не превышает 500нг FEU (фибриноген эквивалентных единиц)/мл. Избыток D-димера свидетельствует об активации фибринолиза, в ответ на усиление коагуляционного каскада с избыточным образованием нерастворимого фибрина. Неконтролируемая коагуляция ограничивается действием белков антикоагулянтов. Антитромбин III (АТШ) - плазменный протеин, ингибирующий активность сериновых протеаз внутреннего и общего путей свертывания. Протеин С инактивирует плазменные кофакторы свертывания VIII и V факторы [52,86]. Он активируется тромбином в присутствии тромбомодулина, значительно ускоряется протеином S [42,81]. Липопротеин-ассоциированный плазменный протеин - ингибитор внешнего пути свертывания. Плазмин - сериновая протеаза, образующаяся из плазминогена в результате энзиматических реакций - действует на сформировавшийся тромб. Состояние организма, при котором отмечаются клинические и лабораторные признаки гиперкоагуляции без образования тромбозов называют гипрекоагуляционным синдромом (ГС), при котором наблюдается быстрое формирование сгустка крови в пробирке, укорочены время свертывания и АЧТВ, повышена агрегация тромбоцитов в ответ на добавление ристоцетина, АДФ, коллагена, арахидоновой кислоты, тромбина и всегда истощен фибринолиз [14,15,82]. Впервые ГС был назван самостоятельной формой патологии свертывающей системы крови А.И.Воробьевым в 1997г [12-16]. ГС, а также артериальные, венозные и микроциркуляторные тромбозы являются основным клиническим проявлением тромбофилии. Венозные тромбозы (ВТ) являются наиболее частым клиническим проявлением тромбофилии. Тромбозы, возникающие в отсутствие каких либо факторов риска (иммобилизация, воспаление, беременность, использование оральных контрацептивов, ожирение, диабет, гормональная терапия, рак) считаются идиопатическими венозными тромбозами. Тромбофилия выявляется у 50% пациентов с первым эпизодом идиопатического венозного тромбоза [3,206]. По данным ряда авторов венозные тромбозы наиболее часто связаны с мутациями фактора V Leiden и протромбина G20210A. Гетерозиготная мутация фактора V Leiden является наиболее распространенной причиной ВТ [2,202,211]. У 7% пациентов с ВТ наблюдается мутация гена протромбина G20210A [184]. Весьма противоречивы данные о влиянии полиморфизма гена MTHFR C677T на риск развития венозных тромбозов [116,222]. По данным ряда исследований, сочетание нескольких мутаций (фактор V Leiden, протромбин G20210A, MTHFR C677T) с полиморфизмом гена PAI-1 4G/5G повышает риск развития венозных тромбозов [20,218].
Чаще всего, ВТ развиваются в глубоких венах нижних конечностей. Однако, нередко отмечается и необычная локализация: в печеночных венах, воротной, нижней полой, центральной вене сетчатки и других вен [51,124,154]. Примерно у половины больных развивается ТЭЛА из вен нижних конечностей, приводящая к развитию инфарктов легких и легочной гипертензии [20,105,250].
В последнее время изучается также влияние генетических нарушений на развитие артериальных тромбозов (АТ), особенно у молодых людей. Утверждается, что в развитии артериальных тромбозов особую роль играет повреждение стенки артериального сосуда и меньшую роль, чем при развитии венозных тромбозов, замедление кровотока [74,102]. Есть сообщения о большей эффективности сочетания аспирина с антикоагулянтами по сравнению с монотерапией антиагрегантами при вторичной профилактике у пациентов с острым коронарным синдромом, что косвенно подтверждает важную роль плазменных факторов в развитии артериальных тромбозов [126,240]. Влияние плазменных факторов на развитие артериальных тромбозов демонстрируется снижением риска развития коронарной смерти по сравнению с общей популяцией у больных с гемофилией А, которая сопровождается умеренной гипокоагуляцией, обусловленной снижением уровня VIII фактора, [9]. По данным Kim R.J. (2003), проанализировавшим около 17000 пациентов с тромбозами коронарных, церебральных или периферических артерий, полиморфизмы FV Leiden, протромбина G20210A и MTHFR C677T выявлялись чаще по сравнению с контрольной группой [135,246].
Клиническая характеристика больных с острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома
Признаки полиорганной недостаточности выявлялись среди пациентов, находившихся в очень и крайне тяжелом состоянии (n=17). У всех этих детей имелись признаки поражения ЦНС в виде комы и судорог. В респираторной поддержке нуждалась пятая часть всех детей с ГУС (19,1%; n=9). В 15 случаях имела место кровоточивость слизистых (31,9%).
Всем детям, поступившим в стационар, проводилась заместительная почечная терапия (ЗПТ), причем начало диализной терапии приходилось, в основном, на 2-3 сутки периода олигоанурии. Длительность периода между манифестацией ГУС и началом ЗПТ отражена в таблице 3.6. В анализируемой группе у 16 (34%) пациентов диализ был начат в первые 3-5 дней от начала кишечного синдрома, в 23 (49%) случаях через 6-9 дней, в 4 (8,5%) - через 10-13 дней от появления первых симптомов энтероколита. Таблица 3.6 Сроки начала заместительной почечной терапии у детей с гемолитико-уремическим синдромом День начала диализной терапии от начала ГУС Число больных абсолютное % В соответствии с возможностями отделения в каждый определенный период времени дети получали соответствующую заместительную почечную терапию (ЗПТ). Так, у пациентов ретроспективной подгруппы в качестве ЗПТ использовались перитонеальный диализ (ПД) и гемодиализ (ГД), так как в то время других возможностей не было. Пациенты проспективной подгруппы получали продленную вено-венозную гемодиафильтрацию (ПВВГДФ). Таким образом, у большинства детей (55,3% n=26) в качестве ЗПТ использовался ПД, 10,6% (n=5) пациентов получали ГД, 6 детей (12,8%) получали только ПВВГДФ, а у 16 пациентов (21,3%) использовались сочетания разных видов диализа (табл.3.7).
Длительность диализной терапии колебалась от 2 до 110 суток, в среднем составив 19,9±2,6 суток. Кроме заместительной почечной терапии пациенты получали и другие виды лечения: энтеросептики (энтерофурил), антибактериальную терапию (цефалоспорины, имипенемы), инфузионную терапию (глюкозо-солевые растворы), трансфузионную терапию (свежезамороженная плазма, эритроцитарная масса, альбумин), эубиотики. Таблица 3.7 Виды заместительной почечной терапии у детей с гемолитико-уремическим синдромом Вид диализа n % Число трансфузий СЗП и эритромассы отображены в рис.3.2 и 3.3, соответственно. В большинстве случаев (n=33; 70,2%) число введения СЗП колебалось от 4 до 10. Количество трансфузий СЗП равной от 1 до 3 и более 10 встречалось у одинакового количества пациентов (n=7; 14,9% и n=7; 14,9%, соответственно).
Трансфузии эритроцитарной массы проводились у пациентов с ГУС при снижении Нв ниже 70 г/л. При анализе частоты гемотрансфузий в преобладающем большинстве случаев – в 72,3% (n=34) - потребовалось лишь проведения 1-2 трансфузий эритроцитарной массы, в 25,5% (n=12) – 3-5 и только лишь в одном случае (2,1%) - более 5. Использование небольшого количества гемотрансфузий объясняется тем, что только лишь в 1/3 случаев использовались экстракорпоральные методы заместительной терапии (ГД, ПВВГДФ), когда возможны потери через контур и механическое воздействие на эритроциты, а также использованием эритропоэзстимулирующих агентов, что позволяло значительно реже проводить гемотрансфузии.
Все пациенты контрольной группы (больные с проявлениями кишечной инфекции без ГУС) поступали в отделение с клинической картиной кишечной инфекции. Приблизительно у половины заболевших не удалось выявить этиологический фактор (табл. 3.8). В случаях идентификации этиологического фактора кишечной инфекции бактериологическим методом, с равной частотой выделялись Shigella Zonne и Rotavirus (19,0% и 19,0%, соответственно). Вдвое реже – у 9,5% (n=2) пациентов обнаружена Salmonela. Диареей страдали 100% (n=21) детей, рвота и боли в животе зафиксированы у 71,4% (n=14) и 85,7% (n=18) пациентов, соответственно. У 8 больных (38%) имело место развитие гемоколита, симптомы общей интоксикации отмечались у 76,2% (n=16) пациентов (табл.3.9). Функция почек у всех пациентов контрольной группы не страдала. Показатели мочевины и креатинина находились в пределах референсных значений (4,26±0,28 vs 57,70±2,97 мкмоль/л, соответственно) (табл.3.10).
Метаболического ацидоза и электролитных расстройств, характерных для пациентов с ГУС, у детей в контрольной группе не отмечено. Все дети поступали в отделение с физиологическим уровнем гемоглобина и тромбоцитов, ни у одного из них не отмечено гиперлейкоцитоза. Уровень Д-димера не выходил за пределы референсных значений
Дети в контрольной группе получали инфузионную терапию (глюкозо-солевые растворы) с целью коррекции волемических расстройств, энтеросорбенты, энтеросептики, биопрепараты.
Таким образом, представленные в исследовании сравниваемые группы (пациенты с ГУС и пациенты с ОКИ без ГУС) были сопоставимы по тяжести проявлений кишечной инфекции.
В исследованиях последних лет указывается на связь развития тромбозов различной локализации с генетически обусловленнойтромбофилией.Пригемолитико-уремическом синдроме развитие микроциркуляторных тромбозов является основным клиническим проявлением. В связи с этим представляется целесообразным изучение роли генетической тромбофилии как возможного самостоятельного фактора развития поражения микроциркуляторного русла почекпри ГУС.
Контролируют все звенья системы свертывания крови. В связи с этимнами проведен анализ влияния полиморфизма изучаемых генов на развитие микроциркуляторных тромбозов у детей с ГУС. 4.1.1. Исследование гена фибриногена (FGBG(455)A)
Среди 47 наблюдаемых пациентов сГУС 18 имели преобладающий в популяции генотип (G/G) (так называемый «дикий») гена бета-цепи фибриногена (FGBG(455)A), 26 пациентов обладали гетерозиготным полиморфизмом (G/A) и лишь 3 детей являлись носителями гомозиготного («мутантного») полиморфизма (A/A) (табл.4.1).
Сравнительный анализ распределения генотипов гена FGBG(455)Aу больных исследуемой группы (n=47) и здоровых лиц выявил преобладаниеу детей сГУС«протромбогенных» генотипов.
Исследование полиморфизмов генов свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом
Исследование, проведенное нами, установило, что среди 47 пациентов сГУС – 44 (93,6%) имели преобладающий в популяции «дикий» генотип G/G, а 3(6,4%) пациента– гетерозиготный генотип, что в полтора раза превышало данную частоту среди здоровых лиц. Как в популяции, так и в изучаемой группе ни в одном случае не было выявлено носителей гомозиготного полиморфизма (табл.4.11).
Клинические характеристики пациентов с разными генотипами мы сравнивали с помощью параметрических методов с определением достоверности различий (р) (табл.4.12). При изучении длительности анурии было установлено, что у пациентов, обладающих генотипом G/G, средняя продолжительность анурии была недостоверно выше (11,7±1,7 суток) по сравнению с носительством генотипа G/A (7,7±3,9 суток), что объясняется малой выборкой и большим разбросом данных (р=0,558).
У детей с генотипом G/G и G/A среднее значение длительности «олигурии» было близким по значению (8,25±1,3 vs 7,3±2,3 суток, соответственно) и статистически достоверно не отличалось (р=0,873).
Средняя длительность гиперазотемии у пациентов с генотипом G/G была больше, чем у детей с гетерозиготным полиморфизмом (38,1±5,2 vs27,0±3,5 суток, соответственно). Эта разница в значениях не является достоверной (р=0,581), но, тем не менее, иллюстрирует вектор направленности показателей.
Аналогичная картина отмечалась при анализе длительности анемии. Так, средняя продолжительность анемии у детей с «диким» генотипом (39,3±4,2 суток) была в полтора раза больше, чем у пациентов с генотипом G/A (26,7±4,9 суток), хотя достоверно не различалась (р=0,445).
Мы проанализировали выраженность тромбоцитопении у детей с различными генотипами гена FVLeidenG1691A. Число тромбоцитов при носительстве генотипа G/G составило 90,5±10,6 х 10/л и оказалось наименьшим, что достоверно отличалось от такового у детей с генотипом G/A (177,3±28,8 х 10/л, соответственно; р=0,042).
При анализе выраженности протеинурии в остром периоде средние значения изучаемого показателя было несколько выше у пациентов с генотипом G/A (1,6±0,8 vs 1,3±0,2 г/л, соответственно; р=0,740).
Напротив, при восстановлении диуреза выраженность протеинурии была в 3,7 раз выше среди носителей генотипаG/G (0,6±0,2 vs 0,16±0,02 г/л, соответственно;р=0,644).
Среди детей с носительством генотипа G/G длительность диализной терапии составляла 20,38±2,81 суток и была недостоверно выше, чем у детей с генотипомG/A, у которых она составляла 13,3±2,0 суток (р=0,521).
Таким образом, гетерозиготныйгенотипгенаFVLeidenG1691A у детей сГУСне влияет на тяжесть клинических проявлений, что может объясняться малым количеством наблюдений.
В результате проведения генотипирования по локусам изучаемых генов среди 47 пациентов сГУС моногенная тромбофилия (замена в 1 гене) диагностировалась в 21,3% (n=10) случаев, а мультигенная – в 78,7% (n=37)наблюдений.
Клинические характеристики пациентов с разными видами полиморфизма генов, контролирующих синтез факторов свертывания крови, сравнивали с помощью параметрических методов с определением достоверности различий (р) (табл.4.13). Как видно из представленных данных, средняя продолжительность анурии среди пациентов с гомозиготным полиморфизмом более чем в 2 раза превышала таковую у пациентов с гетерозиготным носительством (18,7±9,5 vs 8,6±1,3 суток, соответственно; р=0,044). При сочетании «протромбогенных аллелей» длительность анурии у детей с ГУС была недостоверно ниже по сравнению с изолированным гомозиготным носительством (15,1±3,9 vs 18,7±9,5 суток, соответственно; р=0,681), и имела тенденцию к достоверности при сравнении с гетерозиготным генотипом (15,1±3,9 vs 8,6±1,35 суток, соответственно; р=0,058).
Сравнительный анализ частоты распределения полиморфизма генов системы свертывания крови у детей с гемолитико-уремическим синдромом и острой кишечной инфекцией без гемолитико-уремического синдрома
В результате проведения генотипирования по локусам генов MTHFR С677Т, FVLeiden G1691A, PTG G20210A, FGB G(455)A, ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P), PAI-1 4G(675)5G у всех детей с ГУС (n=47) было выявлено наличие полиморфизма генов системы свертывания крови и только в одном случае (4,8%) у ребенка из контрольной группы (n=21) не было получено данных о гетерозиготном/гомозиготном носительстве. Только при исследовании гена FVLeiden распределение генотипов было идентичным выявленным полиморфизмам в контрольной группе и популяции (табл. 5.1).
У пациентов с ГУС при сравнении с популяционными данными и контрольной группой генотипирование по локусам генов продемонстрировало преобладание «протромбогенных аллелей» в виде гомозиготного носительства по генам MTHFRС677Т, ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P), PAI-1 4G(675)5G, в виде гетерозиготного - по генам PTGG20210A, FVLeidenG1691A, FGBG(455)A.
Следует подчеркнуть, что полученные результаты исследования в группе детей с ОКИ без ГУС не совпадали с популяционными. Так, чаще встречались «протромбогенные аллели» в виде гетерозиготного полиморфизма по следующим генам: MTHFRС677Т, FVLeidenG1691A , PTGG20210A, ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P), а в виде гомозиготного носительства только по гену FGBG(455)A. При проведении сравнительного анализа результатов генотипирования в основной и контрольных группах выявлено, что практически в 4 раза чаще встречался гомозиготный полиморфизм гена MTHFRС677Т (19,1% vs 4,8%, соответственно), в 6,4 раз - гена ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P) (6,4% и 0%, соответственно) и в 1,45 раз по гену PAI-1 4G(675)5G (27,6% vs 19%, соответственно). Носительство «протромбогенных аллелей» в виде гетерозиготного полиморфизма также выявлялась чаще по ряду исследуемых генов: в 1,33 раза по MTHFRС677Т, 6,4 раз по FVLeidenG1691A и PTGG20210A, в 1,45 раз по FGBG(455)A, 1,11 раз по гену PAI-1 4G(675)5G. Далее нами проведен анализ частоты выявления мультигенной тромбофилии, когда имелась замена в двух и более генах. Так, среди всех обследованных больных (n=68) в 94,1% случаев выявлялась мультигенная тромбофилия (табл.5.2).
Причем, мультигенная тромбофилия в группе детей с ГУС (n=47) встречалась в 78,7%, а среди детей с ОКИ без ГУС несколько выше - в 80,9% случаев. Полученные данные свидетельствуют о практически равной частоте замен в двух и более генах среди пациентов обеих групп. Таблица 5.2
Отдельно проведен анализ по выявлению количества мутаций в каждой из обследованных групп (табл. 5.3). Так, только в одном наблюдении у пациента с ОКИ без ГУС не было выявлено ни одной замены в генах. Кроме того, среди пациентов с ГУС несколько чаще встречались 1 и 2 мутации, реже 3 и 4 по сравнению с группой детей без ГУС. При этом разница является недостоверной.
Среди пациентов с ГУС носителями только гомозиготной мутации были 4 (8,5%) детей, а гетерозиготной – 29 (61,7%) обследуемых (табл.5.4). (n=11) наблюдений. Тем не менее, сочетание «протромбогенных аллелей» в виде гомо- и гетерозиготного носительства встречалось чаще среди пациентов с ОКИ без ГУС по сравнению с детьми из основной группы – 38,1% vs 29,8%, соответственно. Таким образом, при проведении сравнительного анализа у детей с ГУС преобладают «протромбогенные аллели» в виде гомозиготного (MTHFRС677Т, ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P), PAI-1 4G(675)5G) и гетерозиготного носительства (PTGG20210A, FVLeidenG1691A, FGBG(455)A). В группе детей с ОКИ без ГУС при сравнении с популяционными данными преобладал гетерозиготный полиморфизм по ряду генов (MTHFR С677Т, FVLeidenG1691A, PTGG20210A, ITGB3 (гликопротеина IIIa) С176Т (L33P)) и гомозиготный только по гену фибриногена (FGBG(455)A).
Среди всех пациентов, участвующих в исследовании (n=68) преобладала комбинированная тромбофилия – 94,1%, лишь в 5,9% случаев выявлялась моногенная форма. Причем частота выявления мультигенной тромбофилии в обеих группах была практически равной (78,7% vs 80,9%, соответственно). Мультигенная тромбофилия не является одним из факторов, принимающих участие в развитии ГУС. Наибольшее количество комбинаций изучаемых генов у детей с ГУС (14 vs 8, соответственно) и более частое сочетание «протромбогенных аллелей» и преобладание как гетеро-, так и гомозиготного носительства генов, по-видимому, может влиять на тяжесть клинических проявлений.
