Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Болезни картофеля 8
1.2 Химический метод защиты растений 18
1.2.1 Химический состав 19
1.2.2 Классификация пестицидов по способности проникать в организм вредителя, характеру и механизму действия
1.2.3 Классификация пестицидов по бихимическому механизму действия 21
1.2.4 Классификация пестицидов по токсичности 33
1.3 Образование ооспор оомицетом Phytophthora infestans (Mont) de Bary 35
1.3.1 Образование ооспор в природных условиях 35
1.3.2 Образование ооспор в листьях картофеля в лабораторных условиях 36
1.4 Виды дикого паслена как альтернативные растения-хозяева для P. infestans 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Материалы 40
2.1.1. Выделение и культивирование изолятов 40
2.1.2. Места сбора пораженных образцов для выделения изолятов в чистую культуру
2.1.3 Сорта картофеля 43
2.1.4 Описание использованных в работе пестицидов 49
2.2. Методы 59
2.2.1. Приготовление питательных сред 59
2.2.2. Определение встречаемости ооспор в пораженных образцах 60
2.2.3. Определение устойчивости к фунгицидам 61
2.2.3.1. Устойчивость грибных патогенов картофеля к фунгицидам 61
2.2.3.2. Влияние пестицидов на образование ооспор P. infestans 61
2.2.4. Заражение листьев картофеля разного возраста изолятами P. infestans 62
2.2.5. Влияние фунгицида Скор на образование ооспор в листьях 62
2.2.6. Секвенирование участков генома 63
2.3 Статистическая обработка данных 66
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1 Влияние фунгицидов на рост и развитие патогенных грибов. 67
3.2 Образование ооспор в полевых условиях 75
3.3 Влияние некоторых пестицидов, не применяемых против фитофтороза, на рост мицелия P. infestans и образование ооспор в агаризованной овсяной среде
3.3.1 Влияние на рост мицелия 77
3.3.2 Влияние на образование ооспор 79
3.4 Влияние сорта и возраста листа картофеля на образование ооспор 83
3.4.1 Влияние возраста листьев 83
3.4.2 Влияние сорта 85
3.5 Влияние дифеноконазола на образование ооспор в листьях 86
3.6. Дикие пасленовые как растения-хозяева P. infestans 88
Заключение 95
Выводы 97
Практические рекомендации 99
Благодарности 100
Список литературы
- Классификация пестицидов по способности проникать в организм вредителя, характеру и механизму действия
- Образование ооспор в природных условиях
- Места сбора пораженных образцов для выделения изолятов в чистую культуру
- Влияние некоторых пестицидов, не применяемых против фитофтороза, на рост мицелия P. infestans и образование ооспор в агаризованной овсяной среде
Классификация пестицидов по способности проникать в организм вредителя, характеру и механизму действия
Вредоносность. Фитофтороз - самое вредоносное заболевание картофеля в большинстве стран мира. Главная опасность болезни - это высокая скорость её развития. При благоприятных погодных условиях численность популяций патогена растёт экспоненциально. В России ежегодные потери от этого заболевания в среднем составляют около 4 млн. т. В годы эпифитотий продуктивность восприимчивых к болезни сортов без применения специальных защитных средств может снижаться в 1,5-2 раза, а потери урожая достигать 50 -60 % (Иванюк и др., 2005).
Серьёзные изменения в биологии возбудителя заболевания, произошедшие в конце XX века, привели к повышению его экологической пластичности, адаптивности и агрессивных свойств. "Новая" популяция P.infestans включает оба типа половой совместимости: А1 и А2. До конца 80-х годов 20 века тип спаривания А2 обнаруживали только в Центральной Мексике, которая считается центром происхождения P.infestans (Fry et al., 1991). "Новые" популяции приобрели способность к половому размножению. В результате увеличилась частота рекомбинаций P.infestans и стало возможным образование половых покоящихся спор - ооспор, способных перезимовывать в почве на растительных остатках. Современная популяция отличается от "старой" более высоким генетическим разнообразием и представлена, в основном, сложными расами.
Симптомы и жизненный цикл возбудителя болезни. P. infestans поражает листья, стебли и клубни (Рис. 1.2). Патоген развивается внутри листьев картофеля и вызывает образование темных пятен. В условиях высокой влажности воздуха c нижней стороны листьев вокруг пятен на границе здоровой и пораженной ткани появляется белый налет, представляющий собой спороношение оомицета. Споры разносятся дождем и ветром, попадают на здоровые кусты картофеля и заражают их. На стеблях болезнь проявляется в виде темно-бурых продолговатых пятен, на которых во влажную погоду заметно спороношение.
Распространение болезни по полю, а также с одного поля на другое, происходит с помощью спор бесполого размножения, называемых зооспорами. В пасмурную, влажную погоду зооспорангии могут сохраняться в течение некоторого времени жизнеспособными, и переноситься на значительные расстояния. Зооспорангии, способные инфицировать растения, обнаруживали в приземном слое атмосферы на высоте 1 км (Рогожин, Филиппов, 1983).
Клубни инфицируются через чечевички и повреждения кожуры. На клубнях образуются слегка вдавленные, резко ограниченные бурые пятна, мякоть под которыми имеет ржаво-бурую окраску.
В зимнее время, а также при жарком сухом лете, P.infestans сохраняется в виде мицелия в инфицированных клубнях, стеблях картофеля и плодах томата. Другой инфекционной структурой, способной к выживанию при неблагоприятных условиях, являются ооспоры, образующиеся в результате полового размножения. Ризоктониоз
Возбудитель болезни - гриб-базидиомицет Thanatephorus cucumeris (A.B.Frank) Donk (более широко распространено название несовершенной стадии гриба - Rhizoctonia solani J.G. Kuhn). Базидиоспоры образуются при высокой влажности на мицелии, находящемся на стебле вблизи поверхности земли.
Вредоносность. Это заболевание особенно вредоносно в холодные, дождливые весны. Сильное поражение приводит к выпадам растений, их угнетению, ухудшению товарного вида клубней. Потери урожая от ризоктониоза доходят до 20-25%.
Симптомы и жизненный цикл возбудителя болезни. Гриб T. cucumeris способен поражать картофель на всех этапах онтогенеза. В настоящее время насчитывают несколько форм проявления ризоктониоза. Заболевание проявляется в виде черной парши, углубленной (ямчатой) пятнистости и сетчатого некроза клубней, загнивания глазков и ростков, отмирания столонов и корней, а также в виде сухой гнили подземной части стебля в виде коричневых язв различной величины "трухлявая древесина" и "белой ножки" стеблей (Рис. 1.3). Черные склероции на клубнях - самая заметная отличительна черта ризоктониоза. Они похожи на кусочки почвы, но не смываются и с трудом соскабливаются. Основной вред гриб причиняет в период развития всходов, так как может развиваться при низкой температуре (от +8 С), не испытывая конкуренции со стороны других микроорганизмов. На посаженных клубнях склероции прорастают мицелием, который проникает в ростки и приводит к образованию на них темных вдавленных пятен, часто сливающихся и охватывающих ростки кольцом. Больные ростки погибают иногда еще до выхода на поверхность. Особенно сильно болезнь развивается при ранней и глубокой посадке клубней в сырую и недостаточно прогретую почву. Всходы появляются неравномерно, а выпады растений от ризоктониоза могут достигать 30%. Другим хорошо заметным отличительным признаком ризоктониоза является образование зеленых воздушных клубней в пазухах побегов. Кусты, в сильной степени пораженные ризоктониозом, остаются низкорослыми. Летом в теплую и влажную погоду ризоктониоз может проявляться на взрослых растениях в виде "белой ножки". При этом нижняя часть стебля покрывается беловато-сероватой пленкой, образованной базидиальной стадией гриба.
В годы с пониженной температурой воздуха и переувлажненной почвой в фазу бутонизации-цветения растений можно наблюдать симптомы углубленной пятнистости на клубнях. Образующиеся на клубнях язвы бывают двух типов: открытые и закрытые эпидермисом. На некоторых сортах они проникают очень глубоко (до 20-25 мм), сливаются и образуются довольно крупные полости (Шалдяева, Пилиппова, 1990). Гриб может выживать в почве в виде мицелия или склероциев (на клубнях или в почве) в течение 3-4 лет. Кроме картофеля, T. cucumeris может поражать овощные культуры (томаты, тыквенные, свеклу) и многие дикорастущие сорные растения (осот, хвощ, лебеду и др.).
Образование ооспор в природных условиях
Манифест – вкусовые качества картофеля– хорошие, развариемость - тип АВ. Содержит крахмал - 11,0-15,1%, урожайность до 73,7 т/га. Клубни этого сорта картофеля от овальных до удлиненно-овальных, красные, с мелкими глазками, гладкой кожурой; мякоть светло-желтая. Цветки красно-фиолетовые. Сорт устойчив к картофельной нематоде и раку картофеля. Высокая устойчивость к вирусам, черной ножке, средняя к фитофторозу листьев и клубней, парше обыкновенной. Пригоден для выращивания на легких и средних по гранулометрическому составу почвах, хорошо отзывается на интенсивные условия выращивания, хорошая лежкость, физиологический период покоя клубней средний, сорт высокоустойчив к механическим повреждениям.
Романо – столовый сорт. Растение прямостоячее, высокое, окраска цветков красно-фиолетовая. Клубни коротко-овальной формы, кожура розовая, мякоть светло-кремовая, глазки средней глубины, масса товарного клубня 70-80 г. Урожайность в госиспытании 110-320 ц/га (максимальная-347 ц/га), товарность 90-94%, лежкость хорошая, содержание крахмала 10-13%, вкус хороший. Устойчив к раку, относительно устойчив к мозаичным вирусам, среднеустойчив к фитофторозу, ризоктониозу, вирусу скручивания листьев, восприимчив к парше обыкновенной. Ценность сорта: хорошая выравненность клубней, хороший вкус. Районы возделывания: Центральный (3), Волго-Вятский (4), Центрально-Черноземный (5), Дальневосточный (12).
Янка – столовый сорт картофеля. Урожайность до 57,7 т/га, содержание крахмала 12-17,6%. Хорошие и отличные вкусовые качества (тип В). Отличается низким содержанием редуцирующих сахаров и повышенным содержанием витамина С. Сорт устойчив к картофельной нематоде. Высокая устойчивость к вирусам. Клубни овальные, кожура желтая, слабо сетчатая, глазки мелкие, мякоть кремовая. Цветки белые. Лежкость хорошая.
Лад – столовый сорт. Клубни – крупные, выровненные; количество клубней 10-14 шт.; лежкость отличная; устойчив к механическим повреждениям. Урожайность картофеля – средняя – высокая. Содержание крахмала – 15,5-18,5 %. Потребительские качества – развариемость средняя (тип ВС), вкусовые качества отличные. Пригоден для переработки на сухое картофельное пюре. Развитие ботвы– равномерные всходы, интенсивный рост. Устойчивость к болезням - сорт устойчив к раку картофеля и картофельной нематоде (Rо1); высокоустойчив к вирусам X, L, Y; относительно высокоустойчив к поражению клубней черной ножкой; средневосприимчив к заселению склероциями ризоктониоза, фитофторозу ботвы, сухой фузариозной гнили, антракнозу, вирусам S, M.
Скарб – столовый сорт салатного типа, урожайность до 65 т/га, содержание крахмала 13-17%, клубни желтые, округло-овальные, овальные с поверхностным глазками, мякоть желтая, устойчив к раку картофеля, картофельной нематоде, бактериальным и вирусным болезням, пригоден для производства сушеного и хрустящего картофеля, характеризуется продолжительным периодом покоя клубней. Уникальный сорт, весьма ценный по качеству с рекордной урожайностью, товарностью и лежкостью.
Среднепоздний Вектар – столовый сорт. Клубни округло-овальные, красные, кожура слабосетчатая, глазки мелкие, клубни крупные, выровненные; устойчивы к механическим повреждениям; количество под кустом 12 – 14; период покоя средний, лёжкость хорошая. Урожайность – до 67,3 т/га. Засухоустойчив. Содержание крахмала – 13,8 – 19,2%. Потребительские качества – развариемость хорошая (тип С), мякоть не темнеет, вкус хороший. Устойчив к картофельной нематоде, высокоустойчив к вирусам Х, Y, M, сухой гнили, ризоктониозу, антракнозу; относительно устойчив к фитофторозу, альтернариозу, парше обыкновенной, дитиленхозу.
Волат – столовый сорт. Урожайность достигает до 62,4 т/га, содержание крахмала 11,2-19,0%. Вкусовые качества картофеля – хорошие, развариемость -тип В. Отличается высоким содержанием витамина C – до 29,9% - и повышенным содержанием белка, что определяет его высокую биологическую ценность.
Клубни картофеля овальные, жёлтые, глазки мелкие, красные, мякоть жёлтая. Цветки красно-фиолетовые. Сорт устойчив к картофельной нематоде и раку картофеля, высоко устойчив к вирусам Х, L, относительно высокоустойчив к S и M вирусам, чёрной ножке по клубням, сухой фузариозной гнили, антракнозу; среднеустойчив к вирусу Y, парше обыкновенной, фитофторозу по листьям, ризоктониозу по клубням, альтернариозу, низко устойчив к фитофторозу по клубням.
Особенности сорта пригоден для выращивания на легких и средних по гранулометрическому составу почвах, хорошо отзывается на интенсивные условия выращивания, устойчив к засухе, лежкость хорошая, физиологический период покоя клубней средний, устойчив к механическим повреждениям. Журавинка – универсальный сорт. Урожайность до 64 т/га. Содержание крахмала 14,0-19,0%. Клубни округло-овальные, средние, кожура красная, гладкая, глазки мелкие, мякоть светло-желтая. Цветки красно-фиолетовые. Хорошие вкусовые качества (тип ВС). Пригоден для производства чипсов на протяжении всего периода хранения. Сорт устойчив к картофельной нематоде. Высоко устойчив к парше обыкновенной, черной ножке, средне - к фитофторозу листьев и клубней, вирусам. Продолжительный период покоя клубней. Лежкость хорошая. Многоклубневый. При выращивании для продовольственных целей рекомендуется более разреженная посадка. Отрицательно реагирует на повышенные дозы азотных удобрений.
Рагнеда – столовый сорт. Урожайность до 75,7 т/га, содержание крахмала 13,7-19,0%, вкусовые качества отличные, развариемость слабая (тип В). Устойчив к золотистой цистообразующей картофельной нематоде (RО1), обычному патотипу рака. Цветки белые. Клубни округло-овальные, овальные, желтые; глазки мелкие; мякоть кремовая; устойчивы к механическим повреждениям, хорошо хранятся. Отличается высокой полевой устойчивостью к фитофторозу ботвы, вирусам Х, У, среднеустойчив к вирусам S, L, М, к фитофторозу клубней, дитиленхозу, черной ножке, антракнозу, сухой фузариозной гнили, парше обыкновенной. Продолжительность периода покоя клубней средняя. Сорт интенсивного типа, пригоден для выращивания на всех типах почв, отличается стабильно высокой урожайностью, повышенным содержанием витамина С, низким содержанием нитратов.
Места сбора пораженных образцов для выделения изолятов в чистую культуру
Как известно, оомицет P. infest ans имеет два типа спаривания - А1 и А2. В большинстве полевых популяций Европейской части России встречаются оба типа спаривания, во многих из них соотношение А1:А2 близко к 1:1. Такое соотношение способствует протеканию полового процесса. Результатом полового процесса является образование толстостенных покоящихся ооспор (Galindo, Gallegly, 1960). Ооспоры могут формироваться не только в половом процессе, но и при партеногенезе (Бордукова, 1940). Исследование ооспорогенеза крайне важно, т.к. ооспоры способны сохранять жизнеспособность в почве в течение нескольких лет, а гибридные ооспоры повышают генетическое разнообразие и приспосабливаемость штаммов P. infestans.
Настоящая работа является продолжением исследований Смирнова А.Н., Апрышко В.П., Кузнецова С.А., Еланского С.Н., посвященных изучению встречаемости ооспор в полевых условиях. В большинстве проведенных в России и за рубежом исследований пораженным листьям позволяли полностью сгнивать в чашках Петри в оптимальных для развития фитофтороза условиях. В наших исследованиях листья сразу после сбора закладывали в морозильную камеру на -20С, причем использовали только пораженные листья среднего яруса, не контактировавшие с поверхностью почвы.
В работе были изучены листья картофеля с одним или несколькими фитофторозными пятнами (таблица 3.7). Все растения были выращены из российского семенного материала, привезенного из Костромской области. На всех исследованных полях были обнаружены образцы с ооспорами. Больше всего их было найдено в посадках сорта Скарб (элита) - 5 образцов с единичными ооспорами. В сорте Рагнеда был найден один образец, но с обильным образованием ооспор (Рис. 3.1). В посадках других сортов также были обнаружены отдельные образцы с единичными ооспорами. Таблица 3.7 Встречаемость ооспор в растительном материале в полевых условиях.
Фунгициды, эффективные против возбудителя фитофтороза, в сублетальных дозах замедляют рост колонии и подавляют образование ооспор (Cohen et al., 1997; Flier et al., 2004; Turkensteen et al., 2000). В то же время на полях возделывания картофеля применяют инсектициды, гербициды и фунгициды против других грибов, слабо влияющие на рост оомицета. Влияние таких «неспециализированных» препаратов на рост мицелия или на образование ооспор не изучалось. Поэтому целью настоящей работы было изучить влияние на рост мицелия и образование ооспор некоторых широко применяемых, но не зарегистрированных против фитофтороза препаратов: фунгицидов Максим и Скор, инсектицидов Актара и Танрек и гербицида Зенкор. Также к списку исследуемых препаратов мы добавили новый препарат Зерокс, влияние которого на образование ооспор пока никем не исследовалось.
Дифеноконазол (препарат Скор), тиаметоксам (Актара) и имидаклоприд (Танрек) не оказывали статистически достоверного влияния на радиальный рост колоний P. infestans (Рис. 3.2). Метрибузин (Зенкор) вызывал небольшую задержку роста в начальный период (5-7 сутки роста), однако к 10 суткам диаметры колоний становились близкими. Флудиоксонил (Максим) статистически достоверно тормозил развитие мицелия P. infestans при концентрации в среде более 10 ppm. Зерокс оказался более эффективным: диаметр колоний P. infestans при концентрации коллоидного серебра в среде 1,0 ppm в данном варианте уступал таковому в Влияние пестицидов на радиальный рост колоний P. infestans. Флудиоксонил (Максим) ингибировал рост мицелия в концентрациях более 10 ppm. Разрешенная концентрация флудиоксонила в рабочей жидкости в 16-50 раз выше протестированных нами значений (таблица 3.8) и может ингибировать развитие возбудителя фитофтороза в инфицированных семенных клубнях и убивать находящиеся на их поверхности зооспоры и зооспорангии. По-видимому, именно этим объясняется задержка развития фитофтороза в посадках обработанных Максимом семенных клубней, обнаруженная сотрудниками ВНИИ фитопатологии (Анисимов и др., 2009).
Изучение влияния пестицидов на образование ооспор у P. infestans в питательной среде позволило установить, что статистически достоверное снижение количества этих структур в определенных концентрациях вызывали все исследованные препараты (рис. 3.3). При концентрации действующего вещества 1,0 ppm все пестициды, за исключением препаратов Актара и Скор, приводили к заметному снижению (на 12-24% по сравнению с контролем) количества образовавшихся ооспор.
Влияние некоторых пестицидов, не применяемых против фитофтороза, на рост мицелия P. infestans и образование ооспор в агаризованной овсяной среде
Для доказательства вирулентности выделенного штамма по отношению к S. dulcamara (что требуется в соответствии с Триадой Коха), нами было проведено заражении листьев S. dulcamara. Зараженные листья осматривали несколько раз в день. Первое появление некрозов было отмечено через 56 часов после заражения, а появление первого спороношения – через 64 часа. Морфология спороношения точно соответствовала исходному штамму. Выделенный из зараженного листа изолят по всем культурально-морфологическим признакам соответствовал виду P. infestans. Заражение листа на 5 сутки инкубации представлено на рис. 3.11,а.
Таким образом, выделенный из дикого S. dulcamara штамм P. infestans по форме и размеру зооспорангиев и зооспорангиеносцев, структуре колоний и данным секвенирования региона ITS полностью соответствовал типовым штаммам P. infestans. После успешного скрещивания с тестерами P. infestans разных типов спаривания он показал себя как тип спаривания А1. Полученные ооспоры были типичного размера и морфологии. Штамм был способен успешно заражать листья S. dulcamara.
Полученные нами результаты соответствовали данным других исследователей: изоляты выделенные с диких S. dulcamara в Нидерландах, Ирландии и в США также полностью соответствовали типичным картофельным изолятам по фенотипическим, морфологическим и генетическим параметрам (Flier et al., 2003; Cooke, 2002, Deahl et al., 2010).
Перекрестные заражения листьев S. dulcamara, S. nigrum, листьев и плодов томата, клубней картофеля изолятами P. infestans, выделенными с разных растений-хозяев
В лабораторных условиях были проведены перекрестные заражения листьев картофеля, томата, S. dulcamara и S. nigrum изолятами, выделенными с разных растений-хозяев (табл. 3.9, рис. 3.11).
В результате проведенной работы выяснилось, что изоляты, выделенные с паслена кисло-сладкого, как и изоляты, выделенные с листа томата, смогли успешно заразить клубни картофеля, плоды и листья томата, а также вызвать заражение и спороношение на листьях S. nigrum. Изоляты с картофеля не заразили листья паслена черного, но смогли заразить листья паслена кисло-сладкого.
Еще одним доводом в пользу возможности циркуляции P. infestans исключительно на диких пасленовых могло бы стать успешное образование ооспор в листьях S. dulcamara. В работе (Flier et al., 2003) авторами показана возможность образования ооспор в пораженых листьях S. dulcamara и S. nigrum. Мы попытались получить ооспоры на листьях наших, поражаемых фитофторозом, растений S. dulcamara. Однако в нашей работе ооспор получить не удалось на листьях обоих видов. Возможно, это связано с тем, что Flier et al, 2003 использовали для заражения листья тепличных растений и выделенные с диких пасленовых штаммы возбудителя фитофтороза. Нам удалось выделить из S. dulcamara только штаммы А1 типа спаривания, в качестве А2 мы брали вирулентный для S. dulcamara томатный штамм. В контрольных экспериментах на агаризованной среде и на листьях томата используемая в работе пара штаммов давала обильные ооспоры.
Другим авторам, заражавшим листья дикого S. dulcamara смесью изолятов разных типов спаривания, выделенных с культурных растений, получить ооспоры тоже не удалось (Dandurand et al., 2006). Phytophthora infestans изолят с S. dulcamara
Основным элементом защиты растений от болезней является применение химических пестицидов для предпосадочной обработки семян или семенных клубней и опрыскивания вегетирующих растений. Как показала проведенная работа, пестициды сильно отличаются по эффективности в отношении различных видов и даже штаммов возбудителей грибных заболеваний. Из этого следует, что при практическом использовании следует уделять особое внимание подбору препаратов, учитывая потенциальную возможность развития тех или иных заболеваний. С другой стороны, столь высокие различия в видовой и штаммовой восприимчивости показывают необходимость постоянного мониторинга популяций фитопатогенов и, особенно, их устойчивых форм в разных регионах России и в импортируемом семенном картофеле.
Традиционно пестициды используют для проведения истребительных мероприятий, т.е. для уничтожения фитопатогенных объектов. Однако нельзя не учитывать, что пестициды влияют на самые разные процессы, происходящие внутри клеток паразитических организмов. В нашей работе показано ингибирование ооспорообразования пестицидами, слабо влияющими на рост колоний P. infestans и не предназначенными для контроля этого фитопатогена. Таким образом, правильно подобранная система защиты поможет не только контролировать развитие грибов, сорняков и насекомых во время вегетации, но и уменьшить запас инокулюма P. infestans в почве.
Согласно европейскому опыту, источником заражения картофеля и томата фитофторозом могут служить и дикие пасленовые, хотя их эпидемиологическая роль до сих пор не ясна. Нам удалось выделить штаммы возбудителя фитофтороза из куста дикого Solanum dulcamara, расположенного на большом удалении от посадок картофеля и томата, что свидетельствует в пользу возможности циркулирования P. infestans на диких пасленовых без участия культурных растений. Возможность развития P. infestans на диких пасленовых обязательно следует учитывать при составлении плана защитных мероприятий,
