Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Диагностика, эпизоотология и эпидемиология дирофиляриоза 9
1.1 Диагностика дирофиляриоза 9
1.2 Эпизоотология и эпидемиология дирофиляриоза 16
Глава II. Материалы, методы и объем исследований 30
Глава III. Диагностика дирофиляриоза 38
3.1 Клиническая лабораторная диагностика дирофиляриоза 38
3.1.1 Общеклинические показатели крови собак, пораженных дирофиляриозом 39
3.1.2 Биохимические показатели крови собак, пораженных дирофиляриозом 43
3.2 Специфические методы диагностики ; 53
3.2.1 Микроскопические методы исследования 53
3.2.2 Диагностика дирофиляриоза с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) 56
3.2.3 Иммунологический метод диагностики дирофиляриоза.. 59
3.2.3.1 Принципы получения соматического очищенного антигена дирофилярий 59
3.2.3.2 Определение диагностической эффективности ИФА с очищенным соматическим антигеном D. repens у животных 62
3.2.3.3 Определение диагностической эффективности ИФА с очищенным соматическим антигеном D. repens у людей 66
Глава IV. Особенности распространения возбудителя дирофиляриоза на юге России 72
4.1 Пораженность собак 73
4.1.1 Сезонность дирофиляриоза у собак 77
4.2 Зараженность дирофиляриями кровососущих комаров 87
4.3 Распространение дирофиляриоза среди людей 95
Заключение 108
Выводы 121
Список литературы 123
- Эпизоотология и эпидемиология дирофиляриоза
- Общеклинические показатели крови собак, пораженных дирофиляриозом
- Диагностика дирофиляриоза с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР)
- Сезонность дирофиляриоза у собак
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дирофиляриоз относится к группе заболеваний, вызываемых нематодами сем. Filariidae, характеризующихся трансмиссивным путем передачи, медленным развитием и длительным течением. Около 200 видов филярий паразитируют у животных и человека, из них 7 паразитируют только у человека (Wuchereria bancrofti, Brugia malai, Onhocerca volvulus, Loa Loa, Mansonella streptocerca, M. perstans и M. ozzardi). Некоторые виды филярий рода Dirofilaria, паразитирующие у животных, могут инвазировать и человека (Бронштейн A.M. и др., 2003).
Дирофиляриоз - единственный в умеренном климате гельминтоз с трансмиссивным путем передачи (через комаров). На сегодняшний день считается, что дирофиляриоз человека редкая глистная инвазия. Однако в настоящее время наблюдается тенденция роста данной патологии. За последние годы по данным разных авторов, в различных регионах мира отмечен рост инфекций и инвазий, передающихся человеку через кровососущих комаров трансмиссивным путем, в том числе и дирофиляриоза. До середины прошлого века были диагностированы лишь несколько десятков случаев дирофиляриоза, а за последние 50 лет их число резко возросло (Raccurt СР., 1999). С 1995 по 2000 гг. выявлено 372 новых случая в 25 странах мира, а к 2003 году количество выявленных случаев инвазирования человека D. repens достигло 782 (Pampiglione S. et al., 2001). На сегодняшний день дирофиляриоз выявляется в Италии, Испании, Франции, всего на территории 37 государств (Simon F. et al., 2001; Pampiglione S. et al., 2001).
Наблюдения последних лет свидетельствуют о нарастании числа случаев дирофиляриоза человека в РФ (Авдюхина Т.И. и др., 2003; Бронштейн A.M. и др., 2003; Гуськов В.В. и др., 2001). На сегодняшний день случаи дирофиляриоза выявляются не только у жителей эндемичных территорий юга страны (Волгоградская, Астраханская, Ростовская области,
Краснодарский край, Республика Калмыкия), но и на севере России. В настоящее время северная граница ареала распространения этого заболевания достигла 53-57 с.ш. (Московская, Тульская области, Алтайский край, г. Новосибирск), а увеличение числа случаев заболеваний среди людей некоторые авторы склонны обосновывать снижением иммунного статуса населения (Авдюхина Т.И. и др., 1997; Яковлева Е.Г. и др., 1999; Исаев В.А. и др., 2004).
В 1999-2003 гг. на территории России выявлено 150 случаев инвазии у человека. Это не отражает истинной ситуации, так как дирофиляриоз не входит в число паразитозов, подлежащих официальной регистрации.
Тем не менее, в виду важности проблемы данный паразитоз как редко встречающийся, требующий повышенного внимания с 2003 г. впервые включен в официальные документы Минздрава РФ: СанПиН 3.2.1333-03 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации», МУ 3.2.1756-03 «Эпиднадзор за паразитарными болезнями» и МУ 3.2.1880-04 «Профилактика дирофиляриоза».
Юг России - благоприятная зона для распространения трансмиссивных инфекций и инвазий, в том числе и филяриатозов. Отсутствие мероприятий по их профилактике, рост численности бродячих животных обуславливает риск увеличения числа инвазированных людей и домашних животных. В связи с вышеизложенным, актуальным представляется изучение эколого-биологических особенностей паразита и распространенности вызываемого им заболевания. Это позволит усовершенствовать диагностику, обеспечить своевременность лечения и разработать действенные меры профилактики.
Цель работы: сравнительное изучение лабораторной диагностики дирофиляриоза и распространения этого заболевания среди населения и животных на юге России.
Задачи исследования:
Определить сравнительную чувствительность различных лабораторных методов диагностики дирофиляриоза.
Получить соматический антиген дирофилярий и исследовать его чувствительность и специфичность для выявления дирофиляриоза у собак и людей.
Определить степень пораженности дирофиляриозом собак на разных территориях юга России.
Определить экстенсивность зараженности микрофиляриями кровососущих комаров на различных территориях.
Провести ретроспективный анализ случаев обнаружения взрослых паразитов дирофилярий у человека.
Научная новизна исследований
Впервые разработан способ получения соматического антигена из неполовозрелых особей дирофилярий, который использован при разработке отечественной тест-системы для серодиагностики дирофиляриоза у животных и человека.
Установлены преимущества предложенного иммунологического метода лабораторной диагностики (ИФА) с использованием соматического антигена при обследовании больных животных над традиционными методами лабораторной диагностики дирофиляриоза (прямая микроскопия, метод обогащенного мазка крови). Это подтверждается высокой специфичностью (с сыворотками крови собак — 79,8%, с сыворотками крови людей - 88,5%) и чувствительностью метода (с сыворотками крови собак — 100%, с сыворотками крови людей - 80,5%), позволяющего выявить не только манифестные, но и атипичные, в том числе скрытые, формы инвазии у животных и человека.
Доказана эндемичность дирофиляриоза для юга России и дана оценка уровня заболеваемости дирофиляриозом животных и зараженности комаров на селитебных территориях и проведен ретроспективный анализ случаев дирофиляриоза у человека.
Впервые установлена зависимость экстенсивности инвазии животных от погодно-климатических условий сезона передачи.
Впервые на территории Ростовской области выявлены особенности динамики видового состава паразитов, которые сводятся к постепенному увеличению удельного веса D. immitis и микст — инвазии у собак.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований разработан и апробирован способ получения соматического очищенного антигена D. repens, на который получено решение о выдаче Патента РФ №2008100647/15(000709) от 25.11.08. Запатентованный способ позволил обосновать целесообразность разработки тест - системы для иммунологической лабораторной диагностики дирофиляриоза у животных и людей. Это открывает перспективы своевременного проведения лечения дирофиляриоза как у животных, так и у человека, а также осуществления дифференциальной диагностики и предотвращения риска распространения инвазии на эндемичных по дирофиляриозу территориях.
Антиген используется для серодиагностики дирофиляриоза в ветеринарных клиниках: «Айболит» г. Майкопа республики Адыгея; ООО «Визар» г. Ростов н/Д; апробирован в клинике паразитарных болезней ФГУН Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора (ФГУН РНИИМП) (справки о внедрении имеются в диссертационном совете).
Положения диссертации, выносимые на защиту
Наиболее эффективными методами лабораторной диагностики дирофиляриоза являются: метод концентрации дирофилярий в 3% уксусной кислоте, ПЦР и ИФА (на основе разработанного нами способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens, чувствительность ИФА с данным антигеном с сыворотками крови собак составила 100%, а специфичность - 79,8%, с сыворотками крови людей - 80,5 и 88,5% соответственно).
Установлено, что территория юга России эндемична по дирофиляриозу. Об этом свидетельствуют высокая степень пораженности собак этим паразитозом, значительная доля зараженных комаров и частые случаи инвазии у людей.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены на:
научно-практической конференции «Паразитарные заболевания в Республике Адыгея и меры по их профилактике» (г.Майкоп, 2007)
научно-практической конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г.Москва, 2008)
научно-практической конференции «Паразитарные заболевания в Республике Адыгея и меры по их профилактике» (г.Майкоп, 2008)
семинаре «Организация эпиданализа и профилактика паразитарных болезней» (г.Ростов н/Д, 2008)
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 9 печатных работ, 1 из них в рекомендованных ВАК изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя. Список использованной литературы включает 170 источников: 97 отечественных и 73 зарубежных. Текст иллюстрирован 15 таблицами и 27 рисунками.
Эпизоотология и эпидемиология дирофиляриоза
Анализ данных литературы свидетельствует о широком распространении дирофиляриоза в мире. Это заболевание регистрируют на всех континентах кроме Антарктиды. Многие страны эндемичны по дирофиляриозу, и эта инвазия продолжает распространяться на ранее свободные от нее территории. Одним из главных факторов распространения этого паразитоза является миграция больных собак, в крови которых присутствуют микрофилярии. Повсеместное распространение переносчиков (кровососущих комаров) делает передачу данной инвазии возможной везде, где присутствует резервуар возбудителя. Одним из необходимых условий в распространении дирофиляриоза является климат, обеспечивающий достаточно высокую температуру (23 С и выше) и влажность (60% и выше), необходимые для поддержания жизнеспособности комаров, а также позволяющие личинкам в организме переносчика перейти в инвазионную стадию. D. repens и D. immitis - зоонозы, и в зонах, эндемичных по болезни собак и кошек, существует риск развития легочных и подкожных инвазий дирофиляриоза у человека. Человек является «биологическим тупиком» при дирофиляриозе и не имеет эпидемиологического значения как источник инвазии. Источником инвазии для заражения комаров в синантропном очаге наиболее часто являются инвазированные дирофиляриями домашние собаки, реже кошки, в природном очаге - представители сем. Псовых и Кошачьих. Заражение человека и животных происходит в период активности различных видов комаров, таких родов как Aedes (виды A. fasciata, A. aegipti, A. caspius и др.), Culex (С. pipiens, С. quinquefasciatus, С. modestus и др.) и Anopheles (An. maculipenis An. atroparvus, An. claviger и др.).
Наличие дирофиляриоза среди диких плотоядных и переносчиков способствует поддержанию популяции паразита. По дирофиляриозу эндемична Северная Америка. Передача этой инвазии возможна во всех 50 штатах США (Lok J.B., 1988; Slocombe J. О. D., 1992; Walter L.L., 1995; Yabsley Michael J. et al., 2004). Новые очаги этой инвазии зарегистрированы в долине Оканаган Федеральный округ Колумбии, куда в прошлые годы охотники транспортировали собак из Техаса. Теперь эта территория также эндемична к D. immitis (Zimmtrman G. L. et al., 1992). Передача этой инвазии не была зарегистрирована лишь на территории Аляски, даже при ввозе собак с микрофиляриями в крови. Это связано, прежде всего, с климатом и низкими температурами, которые не позволяют личинкам развиться до инвазионной стадии в организме переносчика (Simon F. et al., 2001).
Переносчиками дирофиляриоза, по данным некоторых авторов, на территории США преимущественно являются комары Ае. ochlerotatus (Yen С, 1938; Kershaw W.E. et al., 1953; Arnott J.J. et al., 1978; Loftin K. et al., 1995). W.J. Bemrick et al. (1966) изучал восприимчивость различных видов комаров к заражению D.immitis. Самыми восприимчивыми оказались комары вида Ае. vexans. Переносчиками дирофиляриоза также могут быть комары вида An. walker (Архипов И.А. и др., 2004).
На территории США было описано более 270 случаев дирофиляриоза человека. Географическое распределение этого паразитоза у людей совпадает с таковым у собак (Cifferi F., 1982). Мужчины были поражены дирофиляриозом в большей степени, чем женщины (в соотношении 2:1). Чаще всего были инвазированы люди в возрасте 40-59 лет. Средний возраст большинства больных мужчин - 52 года, женщин - 49 лет. Причем, максимальное число больных было зарегистрировано в возрасте 28 (мужчины) и 77 лет (женщины). В большинстве случаев дирофиляриоз был вызван инвазией D. immitis и D. tenuis.
D. immitis выявлен в нескольких южноамериканских странах. Местные очаги были идентифицированы в Аргентине (Guerrero J. Ducos de la Hitte J. et al., 1992), Бразилии (Labarthe N. et al., 1997), Колумбии (Guerrero J. etal., 1992). W. J. Kozek et al. (1995) провел обзор заболеваемости дирофиляриозом нескольких стран Карибского бассейна и эпидемиологический обзор Пуэрто-Рико, где распространенность D. immitis у собак составляла от 3,1 до 20,4%, с самыми высокими показателями по южному побережью. На Кубе экстенсивность инвазии у собак достигала 19% (Bouza М. et al., 1985). На Багамских островах 54% животных поражены микрофиляриями D. immitis (Kozek W. J. et al., 1995). В большинстве регионов Австралии собаки поражены дирофиляриозом, вызванным D. immitis. (Lok J. В., 1988; Kendall К. et al., 1991; Bidgood A. et al., 1996). На территории Азии дирофиляриоз, вызванный D. immitis, у собак выявлялся в Иране (Jafari S. et al., 1995), в Малайзии (Lok, J. В., 1988). G.R.Ryan et al. (1995) исследовали пораженность собак на островах Японии. Сведений касающихся заболеваемости дирофиляриозом на территории других Тихоокеанских стран мало. По данным литературы экстенсивность инвазии дирофиляриозом собак в Тайване составила 53,8%) (Кио Т. F. et al., 1995). В Южной Кореи дирофиляриоз выявлен у 28,3% собак (Lee J. С. et al., 1996). C.H.Lai et al. (2001) считает в Тайване промежуточными хозяевами D. immitis комаров Cx.quinquefasciatus и Ae.albopictus (Архипов И.А. и др., 2004).
H.Yoshimura и N.Akao (1985) проанализировали 24 ранее описанных случая дирофиляриоза человека в Японии и выявили высокую пораженность среди людей в конкретной возрастной группе (50 - 60 лет). Позднее K.Makia et al. (1987) рассмотрел дополнительно еще 15 новых случаев. Среди инвазированных D. immitis мужчин больше, чем женщин в соотношении 2:1, возраст большинства больных находился в пределах между 50 и 69 годами. В Шри-Ланке высока пораженность собак D. repens и в некоторых областях экстенсивность инвазии достигала 60-70%. На данной территории дирофиляриоз чаще выявлен у детей в возрасте до 10 лет и даже у младенцев, возраст которых составлял несколько месяцев, что не отмечено нигде в мире (Simon F.etal., 2001). Широкий спектр филярий, паразитирующих у собак и кошек был описан на Африканском континенте: Dirofilaria immitis (собака, кошка), Dirofilaria repens (собака, кошка), Dipetalonema reconditum (собака), Dipetalonema dracunculoides (собака), Dipetalonema grassii (собака). D. immitis выявлялся у собак в различных областях Африки (Lok J.B., 1988; Matola Y.G., 1991). Паразитоз зарегистрирован в Марокко, Тунисе, Египте, Кении, Мозамбике, Малави, Сенегале, Сьерра-Леоне, Нигерии, Габоне и Анголе. В Южной Африке по морфологическим признакам микрофилярии, часто встречающиеся у собак, были идентифицированы как D. reconditum, D. dracunculoides и D. repens. Инвазия D. immitis является не эндемичной для стран Южной Африки, встречается редко и только в импортированных собаках (Nelson Y.S. et al., 1962; Simon F., et al., 2001).
Общеклинические показатели крови собак, пораженных дирофиляриозом
Неспецифические клинико-лабораторные методы могут отражать явления, возникающие при паразитировании гельминта в организме окончательного хозяина, такие как механическое, токсическое, аллергическое и иммунодепрессивное воздействия. Со стороны организма хозяина проявляются ответные реакции с целью подавления патогенных факторов и компенсации вызванных ими повреждений.
Нами было проведено 137 исследований по определению обще клинических показателей крови животных (117 спонтанно инвазированных дирофиляриозом и 20 свободных от инвазии). У собак с высокой степенью микрофиляриемии, независимо от вида паразита, отмечали развитие анемии, что сводилось к явному уменьшению количества эритроцитов (от 1,5x10 7л до 5,0x10 7л) в 89,0±3,7% случаев и снижению гемоглобина (от 108 г/л до 64 г/л) у 42,7±4,6% животных. По данным литературы, в период аллергической реакции идет активное образование тучных клеток, служащих источником гистамина. Гистамин вызывает спазм гладкой мускулатуры, расширение капилляров, увеличение их порозности, снижение артериального давления в связи с застоем крови в капиллярах и увеличением их проницаемости, происходит отек тканей и сгущение крови. Отмеченные явления аллергии наиболее выражены в период острого течения дирофиляриоза. СОЭ было повышенным и находилось в пределах от 7 до 86 мм/с у 67,5±4,4% больных дирофиляриозом животных. Общее число лейкоцитов у 51,9±4,4% инвазированных животных было повышенным и находилось в пределах от 9,5 х10 /л до 18,2x10 /л.
Выше нормы было количество сегментоядерных нейтрофилов (от 72 до 86%) у 68,4±4,4% инвазированных. Эти клетки крови играют важную роль в защите от патогенных организмов, главным образом от бактерий. Как известно велика роль в биологии дирофилярий внутриклеточного эндосимбионта - грамотрицательной бактерии рода Wolbachia, (Bazzocchi С. et al., 2003). Таким образом, увеличение количества дирофилярий в организме собак приводит к возрастанию числа этих бактерий и как следствие, увеличению количества сегментоядерных нейтрофилов.
Число эозинофилов у большинства животных с высокой степенью микрофиляриемии в пределах нормы (от 3 до 9%) было у 82,3±3,6% собак, несмотря на то, что именно увеличение количества этих клеток является главным показателем присутствия в тканях паразитов. Таким образом, полученные нами данные, характеризующие количество эозинофилов в крови, свидетельствуют о хроническом течении дирофиляриоза у большинства обследованных животных. Повышение количества эозинофилов у животных, по данным литературы, наблюдается в начале заболевания и в момент образования микрофилярий. При хроническом течении аллергия ослабевает, количество эозинофилов понижается до нормы или остается несколько повышенным (Desowitz R.S. et al. 1978; Mejia S.J. et al., 1994).
Количество палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов у большинства инвазированных собак также было в пределах нормы и составляло от 1 до 6% и от 1 до 5% соответственно у 82,9±3,5% и 94,0±2,2% животных. Количество лимфоцитов было ниже нормы у 70,3±4,1% животных и находилось в пределах от 1 до 20%. Снижение количества этих клеток свидетельствует об иммунодепрессивном действии дирофилярий на организм собак.
Полученные результаты по общеклиническому анализу крови (OAK) инвазированных животных свидетельствуют об их различии при паразитировании разными видами дирофилярий (табл. 3.1).
У собак, инвазированных D. repens (табл. 3.1) количество эритроцитов ниже нормы наблюдалось у 85,2±7,0% животных. У большинства собак, инвазированных данным видом гельминта, количество гемоглобина было в пределах или выше нормы, и лишь у 38,6±7,4% животных было пониженным. Высокие показатели СОЭ были 72,7±6,8% инвазированных собак. Количество лейкоцитов выше нормы наблюдалось у 44,9±7,2% собак. Число сегментоядерных нейтрофилов в крови выше нормы было у 65,1 ±7,4%, а количество лимфоцитов, наоборот, ниже нормы у 67,4±6,8% животных с этим гельминтом. Показатели количества эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов у большинства собак практически не отличались от таковых контрольной группы: 82,5±6,1%; 86,1±5,4% и 95,4±3,3% соответственно.
У животных, инвазированных D. immitis количество эритроцитов и гемоглобина ниже нормы отмечалось у 84,2±8,6% и 52,0±10,2% животных соответственно (табл. 3.1). СОЭ было повышенным у 64,0±9,8% собак. Количество лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов выше нормы наблюдалось у 51,9±9,8% и 69,6±9,8% инвазированных. Ниже нормы было количество лимфоцитов у 80,8±7,9% животных, больных этим видом дирофиляриоза. Общее число эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов также оставались в пределах нормы: 88,5±6,4%; 80,8±7,9%; 92,3±5,3% соответственно.
У собак, в крови которых были обнаружены микрофилярии двух видов, количество эритроцитов ниже нормы наблюдалось у 95,7±4,4% случаев (табл. 3.1). Содержание гемоглобина было пониженным у 40,0±7,8% животных. СОЭ было повышенным у 65,0±7,6% собак. Число лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов выше нормы было у 55,8±7,7% и 70,0±7,3% животных. У 82,5±6,1% собак было пониженным количество лимфоцитов в крови. Показатели количества эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов также были в пределах нормы: 82,5±6,1%; 82,5±6,1%; 92,5±4,2% соответственно.
Диагностика дирофиляриоза с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР)
Молекулярно-генетические исследования с каждым годом приобретают все большую значимость в различных областях биологической науки. Это связано с их высокой специфичностью и чувствительностью, что неоднократно подтверждено многими учеными, как за рубежом, так и в России. В отношении обнаружения микрофилярий молекулярно-генетические исследования могут быть полезны в случае низкой микрофиляриемии, а также в случае микст - инвазии D. repens и D. immitis.
С помощью ПЦР было обработано 40 образцов крови собак инвазированных дирофиляриями и 4 собаки свободные от данной инвазии. Предварительно все образцы были микроскопированы на присутствие микрофилярий методом концентрации в 3% уксусной кислоте. Исследования проводили методами ПЦР с видоспецифическими парами праймеров (синтезированных фирмой «Синтол», г. Москва) для D. immitis это праймеры II (5 GGCTCACAGATGCTCAAA 3) и 12 (5 CCGCTTA CGCCGTTCATTCATTGCCGC 3) для D. repens это Rl (5 GGTAAATCAAAT GCCCAAGAACCG 3) и R2 (5 CATCATTTCATGGTCTACCGG 3) (Simon F. et al., 2001). ПЦР проводили на базе лаборатории генетики и радиологии Азовского НИИ рыбного хозяйства, за что выражаем благодарность. ДНК D. immitis в ПЦР с парой праймеров II и 12 амплифицирует два фрагмента размером 348 и 747 пн; ДНК D. repens с праймерами R1 и R2 -фрагмент размером 325 пн и лестницу нуклеотидных фрагментов до 175 пн. В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из взрослых паразитов. Электрофореграмма результатов идентификации Dirofilaria spp: KR+ - контроль положительный Dirofilaria repens; КҐ - контроль положительный Dirofilaria immitis; дорожки 1-2, 4-5 - пробы крови исследованных собак; 3 - набор маркеров молекулярной массы ДНК (от 100 до 1000 пн, Fermentas).
Из рисунка 3.4 видно, что в образцах, используемых как положительные контроли присутствуют последовательности ДНК размером 175 и 325 пн (KR+) и 348 и 727 пн (К1+). В дорожках 1 и 2 обнаружены ПЦР продукты характерные для D. repens, в дорожках 4 и 5 - D. immitis. Набор маркеров молекулярной массы ДНК (дорожка 3) позволяет контролировать размер ПЦР-продуктов и, следовательно, адекватность интерпретации результатов ПЦР.
Данные ПЦР показали, что из 40 обследованных образцов крови собак в 16 (40,0%) обнаружены последовательности ДНК, характерные для D. repens, в 11 (27,5%) - D. immitis, а в 13 (32,5%) содержались последовательности ДНК двух видов паразита (D. repens и D. immitis).
Таким образом, молекулярные методы позволяют проводить экспресс диагностику дирофиляриоза у животных и могут внести вклад в объяснение некоторых диагностических и эпизоотологических вопросов этого паразитоза. Метод иммунологической диагностики дирофиляриоза до настоящего времени в России не используется в связи с отсутствием отечественных тест-систем. Нами проведена серия экспериментальных исследований по получению очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens и разработан соответствующий способ выявления Ig G антител в крови у собак и людей, больных дирофиляриозом, а также дана оценка его диагностической эффективности.
Известен способ получения полного соматического антигена дирофилярий, применяемый Е. Espinoza et al. (1993а). Данный способ включает помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор хлорида натрия (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц, в течение 30 сек. при температуре 0 С, с последующим центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин. при температуре 4 С, отбора надосадочной жидкости и использование ее как антигена.
Указанный способ не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена F. Simon et al. (1991) исследуемые сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus.
Нами был разработан способ получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Получение такого антигена достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (ультразвуковая и механическая гомогенизация из замороженного состояния), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток. Использование экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы увеличивает концентрацию белка в антигене. Проведение дополнительной очистки антигена дирофилярий от липидов с помощью холодного ацетона повышает его специфичность. Способ включает следующие этапы: подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации; получение полного соматического экстракта; очистка экстракта в ацетоне; анализ специфичности и чувствительности полного соматического очищенного антигена.
Соматический антиген дирофилярий получали следующим способом. Неполовозрелую самку D. repens, удаленную хирургическим путем, отмывали многократно физиологическим раствором и помещали в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживали при температуре -18 С. Далее проводили механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0 С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживали при температуре 4 С в течение 12 часов. После этого проводили ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0 С. Далее суспензию антигена медленно по каплям добавляли во флакон с охлажденным до -10 С ацетоном (в соотношении 1:20), непрерывно быстро перемешивая при 0 С.
Сезонность дирофиляриоза у собак
Экстенсивность инвазии собак породы бассет составила 61,5%, бультерьер и дратхаар — 50,0%, цверппнауцер и ротвейлер — 42,9 и 40,0% соответственно, московская сторожевая - 36,4%, немецкая овчарка - 35,3%, курцхаар и боксер - 33,3%, доберман-пинчер и сенбернар - 31,0 и 30,8%, болонка, ньюфаундленд и эрдель - 29,4, 27,3 и 25,0% соответственно. В равной степени инвазированны дирофиляриозом собаки пород кавказская овчарка, миттелыынауцер, пудель, питбультерьер и среднеазиатская овчарка (в среднем 21%). В меньшей степени были поражены этим гельминтозом собаки других пород. Инвазированные собаки пород английский бульдог, терьеры (фокстерьер, скотч терьер) и афганская борзая нами не выявлялись, возможно, из-за недостаточной выборки животных этих пород.
Таким образом, нами не установлено зависимости восприимчивости собак к дирофиляриозу от их породы, что подтверждает данные И.А.Архипова и Д.Р. Архиповой (2004). В г. Майкопе (республика Адыгея) за период с 2006 по 2007 гг. было обследовано на дирофиляриоз 46 собак различного пола, породы и возраста. Инвазированными оказались 11 животных (23,9±6,4%), из них 3 (27,3%) были поражены дирофиляриозом, вызванным D. immitis, 6 (54,5%) - D. repens и 2 (18,2%) - D. immitis и D. repens. Интенсивность инвазии составила от 0,1 до 10,0 lg личинок в 1 мл крови. Количество пораженных кобелей и сук было примерно одинаковым и составило 28,6±2,6% и 33,3±5,7% соответственно. Дирофиляриоз регистрировался у собак в возрасте от 6 месяцев до 14 лет.
В г. Туапсе (Краснодарского края) за период с 2006 по 2007 гг. нами было обследовано на дирофиляриоз 47 собак различного пола, породы и возраста. Инвазированными оказались 9 особей (17,0±5,4%). Из них у 3 (33,3%) животных выявлен дирофиляриоз вызванный D. immitis, у 5 (55,6%) - D. repens и у 1(11,1%) - микст - инвазия D. immitis и D. repens. Дирофиляриоз регистрировался у собак в возрасте от 2 до 12 лет. В Астраханской области за период с 2000 по 2004 гг. обследовано на дирофиляриоз 14069 собак. Экстенсивность инвазии составила 2,9±0,1% (Аракельян Р.С., 2007). В Волгоградской области методом случайной выборки исследована кровь 59 беспородных бродячих собак. Экстенсивность инвазии составила 23,7%. Во всех случаях дирофиляриоз был вызван D. immitis. В 2002 г. из 12 собак больных дирофиляриозом, 11 собак были инвазированны D. immitis и 1 - D. repens (Сафронов Е.Ю. и др., 2004). На территории Краснодарского края (Славянский, Абинский, Павловский районы и г. Краснодар) было обследовано на дирофиляриоз 223 собаки, из них 40 (17,9%) животных оказались инвазированны дирофиляриями (Медведев А.Ю. и др., 2004). Все животные были поражены D. immitis.
Пораженность собак на территории Республики Калмыкия, по данным И.А.Архипова и Д.Р.Архиповой (2004), составила 24,4%. Дирофиляриоз был вызван D. repens. В результате анализа собственных исследований и литературных данных установлено: наибольший процент инвазированных собак был зарегистрирован в Ростовской области (25,6±0,4), Республике Калмыкия (24,4%), Республике Адыгея (23,9%), наименьший - в Астраханской области (2,9%). В максимальной степени заражены дирофиляриями собаки крупных пород, в возрасте от 5 до 9 лет. В большей степени поражены дирофиляриозом самцы по сравнению с самками (в соотношении 2:1).
Нами изучено влияние сезонных факторов погодного характера на инвазированность собак дирофиляриями. Динамика пораженности собак по годам показывает, что в 2000 году инвазированными оказалось 27,9±5,7% особей; в 2001 году - 27,8±4,2%; в 2002 году - 26,6±3,8%; в 2004 - 16,4±2,5%; в 2005 - 28,4±4,4%; в 2006 году было выявлено 31,5±2,5% инвазированных животных, в 2007 г. экстенсивность инвазии составила 17,1±1,1% .
Приведенные данные свидетельствуют об относительно стабильном уровне экстенсивности инвазии с тенденцией к увеличению (2005-2006 гг.) и о возможности формирования очага дирофиляриоза, для существования которого, помимо животных восприимчивых к данному возбудителю (собак), необходимо наличие переносчика (комаров), погодных условий, благоприятных для жизнедеятельности переносчика и развития возбудителя в его организме. Все эти условия присутствуют на данной территории.
Уменьшение экстенсивности инвазии в 2004 и 2007 гг. связано, по нашему, мнению с такими погодными условиями, как температура и влажность, которые оказывают прямое влияние на организм переносчика.
