Изучение клинических и иммуноморфологических особенностей аденоидных вегетаций и небных миндалин у часто болеющих детей [Электронный ресурс] Амирова Патимат Юнускадиевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 12

1.1. Определение термина "часто болеющие дети", структура заболеваемости группы часто болеющих детей 12

1.2. Особенности состояния иммунной системы у часто болеющих детей 17

1.3. Особенности состояния местного иммунитета у часто болеющих детей 20

1.4. Иммуноморфология лимфоидного глоточного кольца и значение иммуноморфологических исследований у часто болеющих детей 26

Глава 2. Материалы и методы исследований 33

2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 33

2.2. Морфологические исследования 34

2.3. Характеристика использованных для иммуногистохимических исследований моноклональных антител 35

2.4. Методы иммуногистохимических исследований 39

2.5. Морфометрия и статистическая обработка материала 41

Глава 3. Результаты собственных исследований 43

3.1. Морфологический анализ аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей 43

3.2. Изучение местного клеточного иммунитета аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей 47

3.3. Изучение местного гуморального иммунитета аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей 64

3.4. Изучение макрофагально-моноцитарного звена местного иммунитета аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей 76

3.5. Изучение зоны лимфоэпителиального симбиоза 81

Глава 4. Заключение 88

Выводы 100

Практические рекомендации 102

Литература

• Определение термина "часто болеющие дети", структура заболеваемости группы часто болеющих детей
• Особенности состояния местного иммунитета у часто болеющих детей
• Клиническая характеристика обследованных больных
• Морфологический анализ аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей

Введение к работе

Проблема часто и длительно болеющих детей (ЧБД) в настоящее время остается достаточно актуальной. В Российской Федерации каждый 4-5 ребенок может быть отнесен к группе ЧБД, на долю которой приходится более 60% от всех случаев заболеваний детского возраста [2, 3,10,50].

В структуре заболеваемости группы ЧБД патология ЛОР-органов занимает доминирующие позиции и выявляется от 25-30% до 50% случаев (аденоиды П-Ш степени, гипертрофия небных миндалин , хронические тонзиллиты, синуситы, тонзиллярная болезнь и др.) [24,38,47]. Болезни лимфоидного глоточного кольца Пирогова - Вальдейера являются наиболее частым видом хронической патологии у ЧБД. Именно эта часть лимфоэпителиальной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками дыхательных путей, подвергается интенсивной антигенной нагрузке и здесь же формируются все параметры местного иммунитета [ 13,14,15,18,113,128].

Эти дети являются типичным примером вторичного

иммунодефицитного состояния, коррекция которого является необходимым компонентом схем лечения и ведения этих больных [36,37,73,78]. Учитывая, что лимфаденоидное глоточное кольцо является важнейшим вторичным органом иммунной системы, ответственным за формирование факторов неспецифической резистентности и антиген-специфического иммунного ответа in situ, хронические инфекционно-зависимые процессы в этой ткани закономерно сказываются и на состоянии иммунной системы в целом.

В этом отношении морфофункциональный анализ этой ткани при
воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей у ЧБД с
применением современных иммуногистохимических методов является
высокоинформативным. Перспективность подобного подхода

подтверждается также данными о том, что изменения в системе местного иммунитета у ЧБД являются транзиторными и корригируемыми [25,26,29,66,]

При гиперплазии ткани лимфоидного глоточного кольца (в частности, аденоидных вегетации) и сопутствующего воспаления первичная вирусная инфекция, являющаяся доминирующей у ЧБД, находит благоприятные условия для персистенции и иммунодепрессивного воздействия на эффекторные механизмы местного иммунитета. Деструктивный эффект вирусной инфекции на функциональное состояние лимфоидной ткани служит, в свою очередь, "триггерным" механизмом запуска инфекционно-зависимых иммунопатологических состояний, а также аутоиммунных реакций (13,18,19,151,152,190]. При этом чаще всего встречаются поражения носоглоточной миндалины в виде аденоидных вегетации и аденоидитов. Эти поражения составляют более 50% всех случаев патологии ЛОР-органов у ЧБД [18,47,56,86].

Система местного иммунитета у ЧБД изучалась многими авторами [14,15,16,18,24,69,89,90]. Как правило, эти исследования касались количественной оценки тех или иных параметров иммунитета слюны ( slgA и других классов сывороточных иммуноглобулинов, уровень лизоцима, пропердина, бактерицидная активность слюны), а также клеточного состава смывов из ротовой и носоглоточной области, включая и иммунофенотипические характеристики.

Также достаточно полно изучена общая патоморфология
лимфоидного глоточного кольца. В литературе имеются данные и о
некоторых иммуногистохимических характеристиках, таких как

распределение CD45-RO, CD45-RA, CD20+, CD3+ клеток, а также изотип-специфических Ig-продуцирующих клеток [18,20,106,136,137]. Однако, систематизированных иммуногистохимических исследований клеточного воспалительного инфильтрата, патофизиологических последствий этих событий и взаимосвязи этих параметров с клинико-анамнестическими данными в доступной нам литературе мы не встретили.

Заслуживает особого внимания иммуногистохимическое изучение зоны т.н. лимфоэпителиального симбиоза, или ретикуляции эпителия аденоидных

7 вегетации, т.е. тех зон лимфаденоидной ткани, где имеется тесный контакт между лимфоидными клеточными элементами и эпителием. В настоящее время эта зона рассматривается как иммунорегуляторная, определяющая не только индукцию иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу in situ, но и как зону определяющую феномен т.н. «хоминга» лимфоцитов. Антигенпрезентирующие клетки, «запускающие» иммунный ответ, локализуются преимущественно именно в зоне лимфоэпителиального симбиоза [70,71,151,178,182,186].

Изучение взаимосвязей между иммуногистохимическими параметрами и клинико-анамнестическими данными является актуальным и с той точки зрения, что подобная информация позволяет целенаправленно разрабатывать лечебно-диагностические и прогностические критерии ведения ЧБД. Исследований подобного рода у нас в стране не проводилось.

Таким образом, комплексное клинико-иммуногистохимическое исследование особенностей местного иммунитета у ЧБД имеет большое научное и практическое значение в отношении уточнения конкретных механизмов патогенеза, диагностики и, следовательно, этиотропной и патогенетической терапии вторичного иммунодефицитного состояния, столь свойственного группе ЧБД.

Цель исследования:

Изучение особенностей местного иммунитета у ЧБД по иммуногистохимическим показателям в операционном материале аденоидных вегетации и небных миндалин, а также оценка клинической значимости полученных результатов.

Задачи исследования:

1. Отбор и клиническая характеристика группы ЧБД, подвергшихся операции аденотомии и тонзиллэктомии.

2. Морфологическое исследование полученного операционного материала.

8
З.Иммуногистохимические исследования состава клеточного

воспалительного инфильтрата лимфаденоидной ткани по маркерам:

клеток лимфоидного происхождения ( CD3+, CD4+, GD8+, CD20+),

IgA-, IgG-, IgM-продуцирующих клеток,

клеток, экспрессирующих эндотелиальный антиген- CD31+,

клеток макрофагального происхождения - CD68+, CD35+,

клеток, несущих пролиферативный антиген КІ67+ и онкопротеин - bcl-2+. 4.Иммуногистохимические исследования по вышеперечисленным параметрам зоны лимфоэпителиального симбиоза.

5.Изучение взаимосвязей между клинико-анамнестическими данными и иммуногистохимическим параметрами в группе ЧБД .

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые проведено комплексное изучение характера распределения клеток конкретного фенотипа в зоне продуктивного воспаления, особенностей гиперплазии лимфаденоидной ткани по иммуногистохимическим параметрам, особенностей иммуноморфологии зоны лимфоэпителиального симбиоза. Установлен характер распределения клеток иммунной системы гематогенного происхождения (CD3+, CD4+, CD8+, CD20+) и резидентных клеток макрофагально-моноцитарного генеза

( CD68+, CD35+) в ткани аденоидных вегетации и небных миндалин при хроническом воспалении у ЧБД. Также установлено, что важнейшие клетки местного иммунитета, а именно, IgG-, IgM- и IgA-продуцирующие плазматические клетки имеют характерные зоны локализации, обусловленные характером выполняемых ими функций in situ в условиях воспаления у ЧБД. Показано, что в формировании зоны лимфоэпителиального симбиоза активное участие принимают CD20+, CD3+, CD8+ и CD68+KneTKH. Выявлено, что КІ67+ клетки локализуются преимущественно в лимфоидных фолликулах, в то же время клетки

9 экспрессирующие маркер bcl-2 локализуются в межфолликулярных пространствах.

Установлены статистически достоверные взаимосвязи клинико-анамнестических данных с одной стороны и иммуногистохимическими параметрами лимфаденоидной ткани с другой стороны. Впервые показано, что достоверные взаимосвязи выявлялись прежде всего по отношению к Ig-продуцирующим клеткам лимфаденоидной ткани, полученной во время операций адено- и тонзиллэктомии у ЧБД.

В данной работе система местного иммунитета у ЧБД изучена с позиций современной иммунологии и иммуноморфологии с использованием высокотехнологичных и высокоспецифических реагентов — моноклональных антител (МАТ) и тест-систем для визуализации полученных результатов (Dako Corporation, США и Novocastra ЬаЬ.ІЛс1.,Великобритания).

Практическая значимость

На основании полученных данных охарактеризовано состояние лимфаденоидного глоточного кольца у ЧБД, ответственного за местный иммунитет полости рта и глотки. Эта характеристика основана на данных иммуногистохимических исследований, что является более информативным по сравнению с известными данными о состоянии местного иммунитета по гуморальным и клеточным факторам слюны или смывов из ротовой или носоглоточной области. Полученные данные крайне важны для разработки диагностических и дифференциально-диагностических критериев заболеваний ЛОР-органов у ЧБД. Полученные данные позволяют обоснованно рекомендовать включение имуногистохимических методов исследования операционного и биопсийного материала лимфоидного глоточного кольца в комплексную оценку иммунного статуса ЧБД.

Кроме того, на основании полученных данных открывается возможность обоснованных рекомендаций по проведению профилактических и лечебных иммунотропных воздействий у ЧБД с патологией ЛОР-органов.

Основные положения, выносимые на защиту

1 .Иммуногистохимические методы исследования операционного и биопсийного материала у ЧБД являются высокоинформативными в отношении оценки состояния местного иммунитета и должны быть включены в комплексную оценку иммунного статуса пациентов с иммунодефицитными состояниями.

2. Состояние клеточного звена местного иммунитета у ЧБД при хроническом воспалении лимфоидного глоточного кольца характеризуется активным участием клеток гематогенного происхождения ( CD3+, CD4+, CD8+, CD20+) и резидентных клеток макрофагально-моноцитарного генеза (CD68+, CD35+) в воспалительном процессе. Отличительной особенностью такого инфекционного процесса является сочетание признаков воспаления с гиперплазией лимфоидной ткани.

3. Состояние гуморального звена местного иммунитета у тех же больных при хроническом воспалении лимфоидного глоточного кольца характеризуется преимущественной локализацией IgG-продуцирующих клеток в лимфоидных фолликулах и межфолликулярных зонах, IgM-продуцирующих клеток - в лимфоидных фолликулах, а IgA-продуцирующих клеток в субэпителиальных пространствах. Подобное распределение этих клеток обусловлено характером выполняемых ими функций в условиях хронического воспаления различной длительности.

4. В формировании важной иммунорегуляторной зоны - зоны
лимфоэпителиального симбиоза у ЧБД активное участие принимают клетки
фенотипа CD3+, CD8+, CD68+, а также CD4+. Однако, несмотря на
указанные признаки функционирующего местного иммунитета, в группе
ЧБД формируется состояние транзиторного иммунодефицита.

5. Изучены взаимосвязи между клинико-анамнестическими данными, такими
как длительность заболевания, степень гипертрофии аденоидных вегетации,
распространенность воспалительного процесса - с одной стороны и

иммуногистохимическим параметрами - с другой. Показано, что статистически достоверные взаимосвязи с упомянутыми клинико-анамнестическими данными из всех иммуногистохимических параметров показали только IgG-, IgM- и IgA-продуцирующие клетки.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 5 - в рецензируемых журналах, входящих в бюллетень ВАК.

Основные положения диссертации доложены на 53 конференции молодых ученых оториноланингологов, г. Санкт-Петербург, 27-28 января 2006 г., на IV Международной консенсусной конференции по полипозному риносинуситу, г.Москва, 4-7 мая 2006г., на XVII съезде оториноларингологов России, г. Нижний Новгород, 8-10 июня 2006 г.,

Внедрение результатов исследования в практику

Иммуногистохимические методы исследования операционного материала аденоидных вегетации и небных миндалин внедрены в работу патологоанатомического отделения и бюро Республиканской клинической больницы и Детской республиканской клинической больницы МЗ РД. Результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий в Дагестанской государственной медицинской академии. Обьем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 58 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 206 работ, из них 91 отечественных и 115 иностранных авторов.

Определение термина "часто болеющие дети", структура заболеваемости группы часто болеющих детей

В соответствии с представлениями, принятыми в отечественной педиатрии (Самсыгина Г.А., 2004), часто болеющие дети (ЧБД) - это « обозначение группы детей, склонных к более частым , чем у их сверстников, заболеваниям респираторного тракта» [2,3,21,23,64,88]. В 1986 г. ведущие педиатры нашей страны предложили относить к группе ЧБД детей до 1 года, если они болели острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ) и заболеваниями ЛОР-органов 4 и более раз в год, детей от 1 до 3 лет, если они болели 6и более раз в год, детей от 3 до 5 лет в случае заболеваний 5 и более раз в год и детей старше 5 лет - при частоте заболеваний 4 и более в год [2,3,32,49,50,64]. И хотя многочисленными эпидемиологическими исследованиями установлено, что каждый ребенок в течение года в среднем переносит от 2 до 5 эпизодов этих заболеваний, выделение группы ЧБД вполне обоснованно с точки зрения изучения особенностей их иммунной, эндокринной и др. систем [39,49,50].

В Российской Федерации каждый 4-5 ребенок может быть отнесен к группе ЧБД и на эту группу приходится более 60% всех заболеваний детского возраста [ 23,38,47,52 ]. А по данным [ 2,3,50 ] на долю ЧБД приходится от 25 до 50 % всех случаев заболеваний детей, а среди детей дошкольного возраста ЧБД составляет 26 %, до 3-х лет - 42 %.

Следует отметить, что ЧБД - это не нозологическая форма и не клинический диагноз, поскольку широкая вариабельность этиологии и патогенеза заболеваний ЛОР-органов и дыхательной системы не позволяют клинически обоснованно применять этот термин. Выделение этой категории детей в практической педиатрии обусловлено необходимостью проведения профилактических мероприятий, имеющих достаточно обоснованные научные предпосылки.

Изучение периодической научной литературы по проблеме ЧБД показало однотипность базисных представлений по этиологической структуре и заболеваемости ЧБД, основных патогенетических звеньях, а также лечебно-профилактических мероприятий у этой группы больных детей. Показано, в частности, что основное патогенетическое звено в группе ЧБД - это измененная реактивность иммунной системы, обусловленная такими факторами, как возраст матери, токсикозы беременных, недоношенность, гнойно-септические заболевания, искусственное вскармливание, социальные факторы, а также интенсивная антигенная нагрузка на растущий организм и индивидуальная комбинаторика наследуемых генов иммунного ответа ( гены МНС-комплекса) [38,43,78,91]. Установлено, что в родословных у ЧБД в 14,5 раза чаще отмечаются хронические бронхо-легочные заболевания, в 20„7 раз чаще- хронический тонзиллит, аденоидные вегетации и аденоидит, в 4 раза чаще -злокачественные новообразования, в 7,6 раз чаще - аллергические заболевания и почти в 10 раз чаще - ОРЗ у родителей и ближайших родственников из группы ЧБД по сравнению с семьями контрольной группы редко болеющих детей [38,52,64].

В структуре заболеваемости у ЧБД до 80 % занимают болезни органов дыхания, среди которых превалируют острые респираторно-вирусные инфекции и грипп, затем, по частоте встречаемости, болезни ЛОР-органов и инфекционные заболевания [23,52]. Для часто болеющего ребенка характерны длительные, часто повторяющиеся в течение года ( независимо от сезона) заболевания с тенденцией к хронизации и рецидивам. Наиболее характерна описанная картина для детей до 3 лет.

По данным авторов [10,38,88] у ЧБД среди хронических заболеваний лидирует ЛОР-патология, выявляемая в 24 % случаев ( аденоиды П-Ш степени, гипертрофия миндалин, хронический тонзиллит, тонзиллярная болезнь), далее следуют аллергические заболевания, - у 11% детей ( бронхиальная астма, атопический дерматит, астматический бронхит, лекарственная аллергия ), на третьем месте - гастоэнтеропатология, выявляемая у 9 % детей ( дискинезия желчевыводящих путей, хронический гастродуоденит, реактивный панкреатит) и на четвертом месте другая хроническая патология, выявляемая у 3 % детей ( хронический пиелонефрит, тромбоцитопеническая пурпура др.).

Результаты исследований другой группы авторов выявили следующую структуру заболеваемости в группе ЧБД: острый ринофарингит - у 72 % детей, острый ларинготрахеит - у 10 %, острый тонзиллит - у 7 %, острый бронхит - у 4 %, острый синусит - у 3 %, острая пневмония и острый отит - у 2% [45]. Следует отметить, что в данной работе учитывалась заболеваемость в острый период. Что касается распространенности патологии ЛОР-органов у детей по обращаемости (группа ЧБД), то превалирующей является патология глотки ( 33-35%), болезней уха ( 26-33 %), болезней носа ( 20-33 %) [ 8 ].

Среди этиологических факторов ОРЗ у ЧБД ведущую роль играют вирусы, удельный вес которых составляет от 65 до 90 % случаев. Присоединение бактериальной инфекции приводит к нарастанию тяжести заболевания и повышению риска развития осложнений (отит, синусит, трахеобронхит, пневмония и др.) [2,24,37].

Как было сказано выше, повторные инфекции дыхательных путей -одна из наиболее частых причин для визитов к педиатрам и ЛОР-врачам, а также госпитализаций в стационар. Эти инфекции представлены, в основном, следующими видами: бактериями Haemophylus influencae (наиболее часто тип b), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, вирусами (преимущественно респираторно-синцитиальным, вирусами гриппа, парагриппа, аденовирусы), возбудителями семейства Chlamidia и Mycoplasma, особенно Chlamidia pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae [ 9,42, 55 ].

Особенности состояния местного иммунитета у часто болеющих детей

Местный иммунитет верхних дыхательных путей обусловлен функциональной активностью лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой и представлен лимфоэпителиальными образованиями т.н. лимфоидного глоточного кольца ( кольца Пирогова - Вальдейера ). Наиболее выраженные скопления этой лимфоэпителиальной ткани называются миндалинами. В глотке имеются четыре основные миндалины -это парные небные, или зевные, ( tonsillae palatinae), единичные глоточная, или носоглоточная, (tonsilla pharyngea), язычная ( tonsilla lingualis), а также менее крупные скопления лимфоэпителиальной ткани около устьевевстахиевых труб - парные тубарные миндалины ( tonsillae tubaria ). Между миндалинами встречается диффузная лимфоидная ткань, локализующаяся в слизистой оболочке глотки [ 62,70,71].

В контексте темы настоящей работы необходимо вкратце представить особенности гистологического и иммуноморфологического строения указанных образований, отраженных в ряде фундаметальных работ. Прежде всего отметим, что гистогенетически и иммуноморфологически вся эта ткань имеет единый принцип организации В соответствии с современными данными, типовое строение небных и глоточной миндалины предполагает наличие фолликулярной В-зависимой зоны, занимающей 1\3 всей поверхности лимфоидной ткани и межфолликулярной Т-зависимой зоны, составляющей остальные 2\3 площади. В-зависимая зона представлена лимфатическими узелками - первичными и вторичными лимфатическими фолликулами. В последних происходит интенсивная антиген (АГ)-специфическая пролиферация и дифференцировка В-лимфоцитов и плазматических клеток. Т-зависимая зона образована диффузной лимфоидной тканью, окружающей многочисленные вены с высоким эндотелием, через которые лимфоциты, посредством лиганд-рецепторных адгезионных взаимодействий, из гемоциркуляции поступают в ткань миндалины, двигаясь в направлении мантийной зоны фолликулов и покровного эпителия. По этой причине в этой зоне всегда присутствует некоторое количество В-лимфоцитов [7,18,19,13,14,58,66,70,71].

Некоторые авторы в структуре небных, а также глоточной миндалины выделяют особую морфофункциональную единицу - криполимфон [13,14,19,70,71]. Последний представляет собой просвет крипты миндалин с ее эпителиальной выстилкой, инфильтрированной лимфоцитами, а также первичные и вторичные лимфоидные узелки, связанные с просветом крипты. Но есть определенные отличия глоточной миндалины от небных. В частности, многорядный мерцательный эпителий глоточной миндалины образует неглубокие погружения - лакуны (некий аналог крипт в небных миндалинах), делящий орган на ряд вертикально идущих валиков лимфоидной ткани, которая разрастается при хроническом воспалении (аденоидиты) и называется аденоидными вегетациями, или аденоидами.

Именно эта ткань, наряду с тканью небных миндалин, явилась основным обьектом исследования в группе ЧБД в настоящей работе. По данным отдельных авторов, к моменту рождения небольшая часть поверхности этой миндалины выстлана многослойным плоским эпителием [58,66,70,71,89]. На долю эпителиального покрова приходится в среднем 2-4% площади препарата миндалины.

В отличие от лимфатических узлов небные и глоточная миндалины не имеют замкнутой капсулы с афферентными лимфатическими сосудами и сквозным током лимфы. Эта лимфоэпителиальная ткань стимулируется антигенами, поступающими непосредственно через покровный эпителий, обеспечивая лимфопоэтическую функцию и АГ-специфический иммунный ответ. Этот факт подтверждает теснейшую функциональную связь между эпителием, АГ-презентирующими клетками и лимфоцитами Вторичные фолликулы ткани являются структурой, где и происходит АГ-специфическая клональная пролиферация лимфоцитов [12,13].

Свободная (зевная) поверхность небных миндалин выстлана многослойным плоским эпителием, а слизистая оболочка в области глоточной миндалины, на поверхности складок и в глубине крипт покрыта мерцательным эпителием, который в отдельных местах сменяется плоским или кубическим. Замена мерцательного эпителия на плоский или кубический одни авторы рассматривают как физиологический процесс, другие трактуют как метаплазию мерцательного эпителия в результате воспалительного процесса [14,18,19,70,71].

Клиническая характеристика обследованных больных

В исследование включены 41 ребенок в возрасте от 3 до 14 лет, находившихся на стационарном обследовании и лечении в ЛОР-отделении Детской республиканской клинической больницы г. Махачкалы.

Обследование включало в себя сбор анамнестических данных, оценку объективного статуса, изучение особенностей течения заболевания, эффективности проведенного лечения, анализ заболеваемости у ближайших родственников, оценку материально-бытовых условий жизни.

Помимо клинического обследования, собирались данные лабораторно-инструментальных методов обследования, включавших в себя общий анализ крови, общий анализ мочи, анализ кала на я/г и простейшие, данные ЭКГ, рентгенологическое исследование ( снимки придаточных пазух носа), а также результаты ЛОР-обследования. Все анализы проводились по стандартным методикам, принятыми у нас в стране. Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1.

У всех обследованных пациентов давность заболевания составила более 1 года, частота эпизодов ОРВИ более 5-6 раз в год, частота обострений сопутствующих заболеваний за последние 6 месяцев 4 и более раза в год.

Таким образом, по клиническим признакам все обследованные пациенты были отнесены к группе ЧБД. Аденоидные вегетации диагносцировались по интенсивности гипертрофии лимфоидной ткани, мешающей носовому дыханию и распределялись по III степеням:

I степень - это случаи, когда гипертрофированная носовая миндалина, а также сопутствующий воспалительный отек, закрывали 1/3 пространства носовых хоан, II степень - это случаи, когда гипертрофированная носовая миндалина вместе с воспалительным отеком занимали 1/2 ( 50% ) пространства носовых хоан и III степень - когда процесс занимал 2/3 пространства носовых хоан.

Оперативному вмешательству подвергались дети со II и III степенью гипертрофии носоглоточной миндалины, а также дети с I степенью гипертрофии, но когда к основному заболеванию присоединялся хронический воспалительный процесс аденоидных вегетации - аденоидит. Последний сопровождался длительным субфебриллитетом, частым сухим кашлем, рецидивирующим средним отитом.

У более чем 50% детей аденоидные вегетации сочетались с компенсированными и декомпенсированными формами хронического тонзиллита.

Критериями диагноза компенсированного хронического тонзиллита были эпизоды воспалительного процесса в небных миндалинах 2 и более раз в год без сопутствующих осложнений со стороны других органов и систем. Диагноз декомпенсированного тонзиллита ставился в случаях, когда воспалительный процесс в небных миндалинах осложнятся паратонзиллярными абсцессами, а также метатонзиллярными заболеваниями - острым гломерулонефритом или клиническими признаками ревматизма.

У всех детей, подвергнутых адено-тонзиллэктомии, был взят операционный материал аденоидных вегетации и небных миндалин на общеморфологические и иммуногистохимические (ИГХ) исследования. На каждого из оперированных пациентов была заведена индивидуальная карточка, куда были внесены все данные из истории болезни, а также данные лабораторно-инструментальных исследований.

Морфологический анализ аденоидных вегетации и небных миндалин у часто болеющих детей

Ткань аденоидных вегетации и небных миндалин фиксировалась в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Затем подвергалась спиртовой дегидратации, парафинизации, заливке на блоки по обычным прописям, принятым в патоморфологических лабораториях.

Далее блоки использовались для ИГХ-исследований. Для этих целей на микротоме готовились гистологические срезы толщиной 4 мк. Срезы помещались на предметные стекла, покрытые силаном (Dako). После тщательного высушивания, стекла подвергались депарафинизации в трех объемах ксилола, по 5 мин. в каждом, с последующей регидратацией в батарее, состоящей из одного обьема абсолютного спирта и двух объемов 95 этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в буферном растворе (PBS, рН 7,4) приступали к иммуногистохимическому этапу.

Перед нанесением первичных МАТ, поверхность гистологического среза обрабатывалась либо 0,05% раствором фермента проназы в течение 5 мин., либо подвергалась термической обработке при 95 в течение 30 мин в буферном растворе (Target Retrieval Solution, Dako) с целью восстановления структуры антигенных детерминант на клеточной поверхности, изменившихся в процессе фиксации ткани. Вариант обработки выбирался в зависимости от вида МАТ, согласно инструкции фирмы-производителя. Затем, после отмывки в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS), препарат обрабатывался пероксидазным блоком в течение 5 мин. По окончании инкубации и отмывок в PBS, на препарат наносились МАТ в рабочих разведениях и инкубировались в течение 30 мин. при комнатной температуре. Для визуализации АГ-реактивных клеток использовалась тест-система EnVISION +SYSTEMS, PEROXIDASE (DAB), Dako, которая является более чувствительной по сравнению с тест-системами, основанными на пероксидазо-антипероксидазном или на авидин(стрептавидин)-биотиновом принципе.

После обработки первичными МАТ, препараты тщательно отмывались и на них наносились вышеуказанные вторичные антитела. По окончании 30-минутной инкубации при комнатной температуре и после тщательной отмывки, АГ-реактивные клетки визуализировались хромогенным субстратом (3,3-диаминобензидин в буферном растворе). Препараты докрашивались водным раствором гематоксилина в т-е 30 сек., обрабатывались в растворе 37 мМ аммония для подсинивающего эффекта. Затем препараты регидратировались в спиртах, осветлялись в двух обьемах ксилола и заключались в канадский бальзам. При просмотре препаратов АГ-позитивные клетки (DAB-позитивные) идентифицировались по их коричневому окрашиванию на светооптическом уровне. Ядра остальных клеток окрашивались в синий цвет гематоксилином.

Использование каждого вида МАТ сопровождалось постановкой негативного контроля на тех же самых срезах. С этой целью вместо МАТ на препарат наносился раствор негативного контроля, состоящий из иммуноглобулиновой фракции сыворотки неиммунных мышей в 0,05М трис-буфере, рН 7,6. Все остальные этапы анализа были аналогичными. В качестве позитивного контроля использовались препараты интактной небной миндалины, прилагаемой фирмой-производителем к набору МАТ. Этот контроль был использован с целью оценки морфологии и ИГХ-картины интактной ткани лимфоидного глоточного кольца без воспалительного процесса. Иммуноморфологическая оценка препарата начиналась с просмотра препарата негативного контроля. В случае отсутствия прокрашивания, в т.ч. и фонового, приступали к анализу исследуемых препаратов.

Иммуногистохимические исследования операционного материала на готовых парафинизированных блоках были проведены на базе патологоанатомического отдела РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина ( зав. профессор Н.Н.Петровичев).

Наиболее демонстративные препараты сканировались с помощью аппаратно-програмного комплекса «Мекос-Ц1» производства ЗАО «Медицинские компьютерные системы» («Мекос»), г. Москва. Комплекс «Мекос-Ц1» позволяет вводить изображение с иммуногистохимических препаратов в цифровом формате jpg или bmp на носитель (винчестер компьютера или компакт-диск), визуализировать результаты, осуществлять контроль качества препаратов, работать с базой полученных данных.

Морфометрические показатели определяли путем подсчета количества DAB-позитивных клеток в нескольких полях зрения при ув.400. с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типичные для данного препарата поля зрения.

Полученные в работе данные подвергались статистической обработке специальными методами. Для этого использовали электронные таблицы MS Excel 2000. Силу связи между клинико-анамнестическими данными и параметрами ИГХ-исследований оценивали при помощи коэффициента взаимной сопряженности Чупрова, достоверность - по критерию хz Для оценки достоверности различий между частотами ИГХ-параметров в различных клинических группах использовали критерий Стьюдента с предварительным арксинус-преобразованием показателей по Фишеру и учетом поправки Бонферрони при множественных сравнениях. При равенстве частот нулю использовали метод Ван-дер-Вардена (П.Ф.Рокитский, Минск, 1973, В.Ю.Урбах, М. 1963).

Похожие диссертации на Изучение клинических и иммуноморфологических особенностей аденоидных вегетаций и небных миндалин у часто болеющих детей [Электронный ресурс]

Патология глоточной миндалины у детей и органосохраняющие методы леченияСоколов Роман Олегович

Влияние гипертрофии глоточной миндалины и хронического аденоидита на течение бронхиальной астмы у детейМатвеева Алла Юрьевна

Изучение влияния постоянной слабомиопической дефокусировки изображения на динамику рефракции, бинокулярные функции и рост глаза у детейФилинова Оксана Борисовна

Соматометрические особенности у детей с гипертрофией глоточной миндалиныКирий, Галина Игоревна

Изучение клинических особенностей и разработка методов лечения детей с врожденными заболеваниями глаз в КазахстанеАубакирова, Айгуль Жумагалиевна

Сравнительное изучение анатомо-функциональных особенностей глаз с гиперметропией и миопией у детейКварацхелия Нино Гурамовна

Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика гипертрофии небных миндалин у детейИудина Татьяна Александровна

Дифтерийное бактерионосительство при хроническом тонзиллите и гипертрофии небных миндалин у детейАбдихаликов Жангара Абдихаликович

Диагностические критерии воспалительных и невоспалительных изменений глоточной миндалины у детейКузнецова, Елена Вадимовна

Иммунологические аспекты формирования патологии глоточной миндалины у детей и оптимизация ее консервативного леченияТолкачева Елена Валентиновна