Содержание к диссертации
Введение
1. Введение. 5
2. Получение гликозилдоноров на основе дисахарида p-D-Gal-(l-»3)-p-D-GalNR и их применение в синтезах олигосахаридных цепей природных гликоконъюгатов 8
2.1 Галактозилирование галакталя с последующим введением аминной функции. 10
2.2 Галактозилирование производных галактозамина по положению СЗ . 14
2.3 Обращение конфигурации при С4' в производных изолактозамина. 24
2.4 Синтез TF-антигенов. 27
2.5 Синтез олигосахаридных цепей ганглио- и глобо-гликолипидов. 32
3. Результаты и их обсуждение. 48
3.1 Целевые структуры. 48
3.2 Ретросинтетический анализ целевых структур. 50
3.3 Получение спейсерированных лактозных гликозилакцепторов. 56
3.4 Получение а- и |3- гликозилдоноров на основе дисахарида P-D-Gal-(l->3)-D-GalN. 59
3.4.1 Галактозилирование галакталя 59
3.4.2 Галактозилированиепроизводных 2-азидо-2-дезокси-1-тио-р-Б--галактозы. 60
3.4.3 Получение JV-трихлорацетильных производных (З-D-GalN и P-D-Gal-(l->3)-P-D-GalN. 68
3.5 Синтез целевых производных углеводных цепей гликолипидов асиало-GMb GMi и Gb5. 74
3.6 Получение аминоэтилгликозидов углеводных цепей гликолипидов GM2 и Gb4. 80
3.7 Получение аминоэтилгликозида гексасахариднои цепи гликолипида Fuc-GMj. 82
3.8 Получение неогликоконъюгата углеводной цепи GM( с поли акрил амидом. 87
Выводы. 97
- Галактозилирование производных галактозамина по положению СЗ
- Ретросинтетический анализ целевых структур.
- Синтез целевых производных углеводных цепей гликолипидов асиало-GMb GMi и Gb5.
- Получение неогликоконъюгата углеводной цепи GM( с поли акрил амидом.
Введение к работе
Актуальность работы: Природные гликолипиды глобо- и ганглію- серий играют важную роль в процессах межклеточного узнавания, адгезии и пролиферации. Основную функцию при этом несут именно углеводные цепи данных гликолшшдов, которые влияют на развитие целого ряда опасных заболеваний. В частности, олигосахаридные цепи глобо- и гакгяыо-гликолипидов являются лигандами микробных токсинов и адгезинов, а также известны как онкоассоциированные антигены. Кроме того, развитие некоторых опасных невропатий, протекающее по аутоимунному механизму, сопровождается выработкой антител против олигосахаридных цепей гликолипидов, в особенности ганглиозидов.
Весьма ограниченная доступность соединений рассматриваемых типов из природных источников ставит задачу разработки методов их реіио- и стереонанравленного химического синтеза. Нужно отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных синтезу гапглиозидов и глобозидов, разработка эффективных методов их получения остается одной из самых сложных задач современной химии углеводов. Поскольку для проведения биохимических исследований in vitro наиболее удобны олигосахаридные цепи, связанные с разнообразными носителями и метками, то особенно актуальным представляется получение целевых соединений в форме гликозидов, содержащих необходимую для конъюгации спейсерную группу.
Цель работы: Настоящая диссертация посвящена разработке синтеза олигосахаридных цепей глнглио-гликолипидов асиало-GMi (GAi), GM2, GMi и Fuc-GMi, а также глобо-гликолипидов Gb» и Gbs, содержащих спейсерный 2-аминоэтильный агликон, позволяющий проводить конъюгацию с носителями и метками.
Научная новизна и практическая ценность работы: В настоящем исследовании разработан синтез олигосахаридных цепей глобо- и ганглио-гликолшгадов при использовании в качестве гликозилдоноров тиогликозидов на основе галактозамина и дисахарида p-D-Gal-(l-*3)-D-GalN. Изучен процесс переноса агликона с гликозилакцептора на гликозилдонор, побочно протекающий при гликозилировании тиогликозидов галактозамина. Показано, что при гликозилировании и-нитрофенилтиогликозидов галактозамина побочный перенос агликона не происходит. На основе предложенных рациональных конвергентных синтетических схем, использующих унифицированные синтетические блоки, получены спейсерированные производные ганглиозидов Fuc-GM], GMi, GM2 и асиало-GMi, а также глобозидов Gbs и Gb.). Синтезированные соединения использованы в качестве молекулярных зондов для изучения углеводной специфичности лектинов.
Публикации: По теме настоящей диссертации опубликовано 4 статьи. Отдельные
материалы работы были представлены в виде тезисов на 4-й летней школе по зеленой химии
(Венеция, Италия, 2001 г.) и на XVH Менделеевском съезде по общей и прикладной химии
(Казань, 2003 г.), а также доложены на Knmrvpra мппппщ ученых ИОХ РАН в 2003 г.
ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I
БИБЛИОТЕКА |
Cflctta
-ІІ.
м. « УЗЙ
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного получению гликозилдоноров на основе дисахарида p-D-Gal-(l->3)-D-GalN, предназначенных для проведения а- и р-гликозилирования, и их применению в синтезах олигосахаридных цепей природных гликоконъюгатов, а также обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Общий объем диссертации 129 страниц, библиография содержит 92 ссылки.
Галактозилирование производных галактозамина по положению СЗ
Основной проблемой данного подхода является создание р-гликозидной связи между остатками Gal и GaiN с приемлемым выходом. Зачастую, З-Огалактозилирование некоторых N-ацильных производных галактозамина, например, широко используемых в олигосахаридном синтезе ЛГ-фталошшрованных производных, приводит к целевым дисахаридам с очень низкими выходами. Так, галактозилирование 8-этоксикарбонилоктилгликозида 29 имидатом 28 в присутствии AgOTf требовало нагревания и при этом целевой дисахарид 30 был получен с выходом только 5% [17], а при использовании метилгликозидного аналога гликозилакцептора 29 дисахарид не был получен вообще (схема 7). В этих случаях наблюдали образование комплексов гликозилакцепторов с AgOTf в виде нерастворимого осадка, которые, лишь частично разрушались при достаточно высокой температуре (40 С). Однако, при замене 29 на iV-ацетильный аналог 31, гликозилирование успешно протекала в тех же условиях, приводя к дисахариду 32 с достаточно высоким выходом (77%), В данном случае комплекс соли серебра с 31 медленно разлагался при 40 С, высвобождая гликозилакцептор [17]. Как отмечалось в работах [18] и [19], в сравнительно неполярных растворителях (таких как дихлорметан) моногидроксильные производные iV-ацетилгликозаминов образуют меж- и внутримолекулярные водородные связи с участием N-H протона ацетамидной группы и атома кислорода свободной гидроксильнои группы. Было показано, что такие водородные связи могут очень существенно снижать нуклеофильность JV-ацетилглюкозаминовых гликозилакцепторов [20]. Тем не менее, Р-галактозилирование гликозилакцепторов на основе Л ацетилгалактозамина удается осуществить с выходами от умеренных до хороших. Вместе с тем, этот метод накладывает существенные ограничения на дальнейшее использование получающихся производных Л -ацетилгалактозил--галактозамина как гликозилдоноров в синтезах высших олигосахаридных структур. Наличие ЛҐ-ацетильной группы приводит, в условиях активации, к образованию из гликозилдонора устойчивого оксазолина, гликозилирование которым возможно только в случае высоко реакционноспособных гликозилакцепторов и требует жестких условий реакции.
В том случае, если такой дисахаридный гликозилдонор используется для синтеза простых структур, например О-гликозилированных производных серина и треонина, так называемых TF-антигенов, то данный подход оказывается оправданным, несмотря на умеренные выходы целевых продуктов, поскольку аминогруппа в гликозилдоноре уже находится в природном ацетилированном виде. Так, в синтезе TF-антигена Коганти с сотр. конденсировали аллилгликозид 33 и ацетобромгалактозу 23 в смеси бензола и нитрометана в присутствии Hg(CN)2 при 50 С и получали дисахаридный предшественник 34 с выходом 65%, который далее переводили в трихлорацетимидатный Gal-(1—»3)-GalN-P гликозилдонор 35 с выходом 41% [21] (схема 8, а-в). В работе [22] моногидроксильное производное GalNAc 37 галактозилировали тиогликозидом 36, что приводило к дисахаридному продукту 38 с выходом 75%, который затем переводили в трихлорацетимидат 39 с выходом 63% (схема 8, г-е). В связи со стерической компактностью и инертностью азидной группы в различных условиях гликозилирования, а также возможностью получать из одного предшественника гликозилдоноры для присоединения блока Gal-(l- 3)-GalN как а-, так и -связью, наибольшее распространение в синтезах замещенных (1— 3)-связанных галактозилгалактозаминов получили производные 2-азидо-2-дезоксигалактозы (GalN3), получаемые по реакции азидотирования галакгаля. Результаты галактозилирования производных GalNj зависят от типа используемого галактозилдонора и условий его активации, выходы при этом могут колебаться от низких до практически количественных. Например, конденсация бензил иденового производного 40 с ацетобромгалактозой 23 по Гельфериху [16] приводит к смеси аномерных дисахаридов 41 с общим выходом 30% (схема 9, а) [23]. Отмечалось что 3-ОН группа в 40 недостаточно реакционноспособна для успешного проведения такого гликозилирования. В той же работе было предложено использовать вместо бензил иденового производного 40 дибензоат 43, который получали из азидонитрата 42 (схема 9, б-в). Для галактозилирования 43 применяли пентаацетат галактозы 44 в присутствии TMSOTf, что приводило с высоким выходом к дисахариду 45 (схема 9, г), который затем переводили в бромид 47 (схема 9, г-е), предназначавшийся для дальнейшего использования в качестве сс-гликозилдонора. В работе [24] бромидом 23 гликозилировали сходный с акцептором 40 аллилгликозид 48 (схема 10). Проведение этой реакции при промотировании цианидом ртути (И) приводило, как и в случае 41, к смеси а- и Р-изомеров но с более высоким общим выходом 80%. Низкая стереоселективность реакции в случае конденсации по Гельфериху 23 как с 40, так и с 48, по-видимому связана с применением в качестве растворителя толуола, поскольку известно, что его использование способствует образованию а-гликозидов.
Однако в присутствии трифлата серебра и сшш-коллидина конденсация 23 и 48 протекала существенно более эффективно по сравнению с сочетанием 23 и 40 и приводила избирательно к образованию целевого дисахарида 49 с выходом 70% (схема 10). В дисахариде 49 азидогруппу переводили в соучаствующую фталимидную и получали готовый р-гликозилдонор - бромид 50 с общим выходом 32%. Еще более высокие результаты в 3-0-галактозилировании моногидроксильных производных GaIN3 были достигнуты при использовании в качестве гликозилдоноров тиогликозидов (схема 11). Так, в работе [25] моногидроксильное производное 52 конденсировали с тиогликозидом 51 [26] в присутствии MeOTf, что приводило к дисахариду 43 с выходом 91% (схема 11, а). После превращения в последнем азидной группы в соучаствующую фталимидную, аллилгликозид 54 переводили в смесь аномерных фторидов 55 с общим выходом 42% (схема 11, б-в). При конденсации фенилтиогликозида 56 и бензилиденового производного 57 в присутствии NIS и ТЮН целевой дисахарид 58 был получен с количественным выходом [27] (схема 11, г). Во избежание образования ортоэфира, изомерного гликозиду 58, в реакции использовали промытые кислотой молекулярные сита AW300 и сравнительно большое (0.4 - 0.7 экв.) количество ТЮН. Полученный дисахарид 58 переводили как в тиогликозидный донор 59 с соучаствующей ІУ-фталоильной группой, так и в бромид 27, который несет несоучаствующую азидо-группу при С-2 и может быть использован как а-донор (схема 11, д-е). В работах лабораторий Шмидта [28-30] и Паульсена [31] для галактозилирования производных ОаПЧ) применялись трихлорацетимидаты. Так, группой Шмидта была проведена серия гликозилирований моно- и дигидроксильных производных GalN3 известным галактоз ил-трихлорацетимид атом 60 [32] при промотировании эфиратом трехфтористого бора (схема 12, а). Было показано, что в случае диольного акцептора 61 и при использовании небольших избытков гликозилдонора удается избежать образования 3,4-ди-О-гликозилированного продукта [29]. Во всех случаях выходы целевых дисахаридов оказывались близки и были умеренными (60-69%). Использование 4,б-0-бензилиденового аналога акцептора 60 как гликозилдонора не привело к увеличению выхода целевого продукта [28]. Дисахарид 71 был получен с наиболее высоким выходом при конденсации донора 60 и метилгликозида 70 в присутствии TMSOTf (схема 12, в) [31]. Полученный метилгликозид 71 далее переводился в два типа ot-гликозилдоноров: бромид 27 и хлорид 72. Во всех перечисленных выше примерах гликозилдоноры на основе дисахарида p-D-Gal-(l-»3)-D-GalNAc получают галактозилированием О-гликозидных производных D-галактозамина. При этом агликон играет роль временной защитной группы, которую впоследствии удаляют, а полуацеталь переводят собственно в гликозилдонор. Такой подход характеризуется многостадийностью, что отражается на выходе целевого дисахаридного гликозилдонора.
Ретросинтетический анализ целевых структур.
При проведении ретросинтетического анализа целевых соединений 1-6 во внимание принимались их следующие ключевые особенности: последовательность моносахар идных остатков и конфигурация межсахаридных связей в углеводном скелете, присутствие Р-связанного N-ацетилгалактозаминового фрагмента, наличие аминогруппы в агликоне, а также а-связанного терминального остатка TV-ацетилнейраминовой кислоты (для соединений 1, 3, 4) и фу козы (4). Поскольку наиболее крупные углеводные цепи старших структур ганглио- и глобо- рядов содержат в своем составе моносахаридные остатки цепей меньшего размера, то при выборе общей стратегии получения целевых соединений 1-6 мы опирались в первую очередь на ретросинтетический анализ гекса- и пентасахаридных производных 3, 4 (ганглио-ряд, схемы 1-3) и 6 (глобо-ряд, схема 4). Наличие разветвления в углеводных цепях ганглио-гликолипидов подразумевает различные варианты их сборки из моносахаридных остатков. Так, в литературе описаны три наиболее рациональные синтетические схемы получения пентасахаридной цепи GM}. Первая, включающая в себя сборку [1+4] и получившая название GAj-подхода, основана на сиалилировании соответствующего производного тетрасахарида асиало-GMi [28]. Во второй, основанной на сборке [2+3] и названной GM3-подходом, используется присоединение дисахаридного фрагмента P-D-Gal-(1— 3)-P-D-GalNAc к избирательно защищенному сиалиллактозному блоку [25, 41], В третьей схеме со сборкой [1+1+3] (GM2 - подход) используется первоначальное галактозаминилирование сиалиллактозного блока с последующим галактозилированием терминального остатка GalNAc [61]. Последняя схема характеризуется сравнительно низкой конвергентностью и нами не исследовалась. На схеме 1 приведен ретросинтетический анализ аминоэтилгликозида 3 проведенный согласно разбиению [1+4] с использованием набора унифицированных моно- и дисахаридных интермедиатов 7, 9 и 10, позволяющего свести к минимуму разнообразие синтетических блоков, применявшихся нами в синтезе производных как ганглио- так и глобо- структур. Ключевым моментом синтеза целевых соединений, в особенности сиалилированных производных 3 и 4, являлась разработка эффективного метода получения и р-присоединения дисахаридного фрагмента p-D-Gal-(l—»3)-D-GalN. Соответствующие N-фталоильные производные, традиционно используемые для р-галактозаминилирования, плохо применимы для синтеза сиалилированных структур из-за жестких условий удаления N-фталоильной защиты, несовместимых с присутствием сложноэфирной группы в остатке неираминовои кислоты. Использование другой распространенной группы доноров на основе 2-азидо-2-дезокси-аналогов [J3-D-Gal-(l- 3)-D-GalN3] было ограничено из-за невысокой 3-стереоизбирательности гликозилирования ими.
Поэтому, в данной работе были исследованы Л -трихлорацетильные производные типа 9, в которых защитная группа при азоте не только обеспечивает необходимую Р-стереоизбирательность гликозилирования, но и может быть удалена или переведена в iV-ацетильную в мягких условиях. Впервые использование в качестве р-галактозаминил-доноров производных Л -трихлорацетилгалактозамина было сравнительно недавно предложено Жакинэ в синтезе глюкозаминогликанов [62]. Использование в дисахаридном блоке 9 тиогликозидной донорной функции обусловлено устойчивостью тиогликозидов к большинству условий снятия/постановки различных О- и N-защитных групп в сочетании с высокой реакционной способностью и широким набором условий активации. При этом, ЛЛтрихлорацетильный р-гликозилдонор 9 планировалось получать из соответствующего 2-азидо-2-дезокси-предшественника, который, в свою очередь, мог бы служить как а-гликозилдонор. Синтезы сиалилированных структур 1, 3 и 4 в настоящей работе проводили с использованием сиалилдонора 7 [63]. Выбор бензилированного производного лактозы 10 объясняется его более высокой реакционной способностью по сравнению с бензоилированным или ацетилированным аналогами. В данном случае, первоначальное 4 -0-гликозилирование лактозида 10 тиогликозидом 9 требует предварительной временной защиты в первом более реакционноспособной гидроксильной группы при С-31. Использование для этой цели метоксибензильной группы объясняется достаточной устойчивостью в условиях гликозилирования, а также ортогональностью условий удаления по отношению к остальным присутствующим О-защитным группам. В схеме [2+3] синтеза 3 используется обратная по отношению к [1+4] последовательность присоединения синтетических блоков 7 и 9. Применение в данном случае диола 12 обусловено тем, что в случае 3 ,4 -диольных производных лактозы возможно проведение селективного У-О-сиалилирования [64]. Таким образом, образующийся в результате реакции соединений 7 и 12 спирт 11 может быть прогликозилирован тиогликозидом 9 без проведения дополнительных превращений. Для получения аминоэтилгликозида 4 оптимальной представлялась высоко конвергентная схема [3+3] сборки. Эффективность такой схемы следовала из проведенного нами ретросинтетического анализа структуры гексасахарида 4 (схема 3) и была недавно продемонстрирована в работе группы Данишевского [65] на примере синтеза н-пентенил гликозида олигосахаридной цепи Fuc-GMi с использованием разработанного ими метода сульфонамидного гликозилирования [11].
Ключевым моментом сборки 4 является конденсация описанного выше гликозил акцептора Не трисахаридным донором 13. Получение последнего требовало стерео- и региоселективного введения остатка а-фукозы, для чего были выбраны избирательно защищенный дисахаридный акцептор 14 со свободной гидроксильнои группой при С-2 остатка Gal и ранее полученный в нашей лаборатории избирательно защищенный фукозид 15, гликозилирование которым проходит с высокой а-стереоселективностью [66]. Кроме того, использование донора 15 продиктовано стабильностью тиогликозида 14 в условиях активации гликозилимидатов. Ретросинтетический анализ спейсерированного производного Gb5 (6), проведенный с учетом использования описанного выше унифицированного P-D-Gal-(1 3)-P D-GalN OHopa 9, выявил целесообразность сборки целевой пентасахаридной цепи по схеме [2+3], путем конденсации 9 с несущим свободную гидроксильную группу при С-3" производным глоботриозы 16, ранее полученным в нашей лаборатории [67] (схема 4). Синтез всех лактозных гликозилакцепторов 10, 12 и 23 проведен из доступной ацетобромлактозы 17 [68] (схема 5). Азидоэтильный вводили гликозилированием хлорэтанола с последующей заменой атома хлора на азидную группу. Так, конденсацией бромида 17 с хлорэтанолом в присутствии смеси цианида и бромида ртути (II), с выходом 74% был получен хлорэтилгликозид 18, обработка которого азидом натрия приводила к азидоэтилгликозиду 19 с выходом 97%. Соединение 19 полностью дезацетилировали, а образующийся гептаол избирательным 3 ,4 -0-изопропилиденированием по методу [69] переводили в ацетонид 20 с выходом 82%. Последний исчерпывающе бензилировали, удаляли изопропилиденовую группу и получали диол 12 с выходом 98%. Дисахарид 12 обрабатывали Bu2SnO и образующийся станнилиденовый интермедиат избирательно З -О-апкилировали действием МРМС1 [70] с образованием 4 -гидрокси-производного 10 с выходом 93%. Наличие метоксибензильной группы при О-З в соединении 10 подтверждалось слабопольным химическим сдвигом сигнала атома углерода С-3 (80.8 м.д.) в его спектре 13С-ЯМР по сравнению с сигналом этого атома в спектре диола 12 (73.5 м.д.). Присутствие свободной ОН-группы при С-4 в соединении 10 подтверждалось расщеплением сигнала Н-4 на протоне гидроксильной группы в спектре Н-ЯМР. О р-конфигурации аномерного центра остатка глюкозы в 10 свидетельствовала характеристическая величина КССВ J и 8.4 Гц, а присутствие азидной группы при С-2 агликона подтверждалось слабопольным положением сигнала атома углерода метиленовой группы CH2N3 (51.0 м.д.). Для проведения модельной реакции конденсации лактозного и P-D-Gal-(l- 3)-p-D-GalN блоков как части [1+4] схемы, а также для отработки синтеза производных асиало-GMi, нами был получен моногидроксильный гликозилакцептор 23 (схема 5).
Синтез целевых производных углеводных цепей гликолипидов асиало-GMb GMi и Gb5.
Далее мы перешли к синтезу моногидроксильного производного со скелетом асиало-GM] (8, схема 1) необходимого для сборки пентасахарида GMi по схеме [1+4]. Гликозилированием акцептора 20 гликозилдонором 47 в дихорметане в присутствии NIS и ТЮН был получен тетрасахарид 49 с выходом 63% (схема 12, а). р-Конфигу рация остатка галактозамина в соединении 49 подтверждалась характеристической величиной КССВ J}«t2n 8-4 Гц в спектре Н-ЯМР, а положение гликозилирования - слабопольным положением в спектре С- ЯМР сигнала С-4 (72.8 м.д.). В соединении 49 удаляли метоксибензильную защитную группу при обработке CAN в водном ацетонитриле с образованием моногидроксильного производного 50 с выходом 90% (схема 12, б). Попытки сиалилирования тетрасахарида 50 тиогликозидом 7 (схема 12, ж) в условиях, предложенных Хасегавой [50] (абсолютный ацетонитрил, NIS, каталитическое количество ТГОН, молекулярные сита MS-3A, -30 - 40 С), не привели к образованию сколь-либо заметных количеств требуемого продукта. Донор 7 претерпевал элиминирование этантиола с образованием гликаля 51, в то время как гликози л акцептор оставался непрореагировавшим. Эта синтетическая проблема уже наблюдалась ранее в синтезах GMj по схеме [1+4] [28, 53] и подробно обсуждается в литературном обзоре. В синтезе аминоэтилгликозида GMj 3 согласно схеме [2+3] (схема 2), исследованном нами далее, мы исходили из диольного лактозного гликозилакцептора 12. Гликозилирование последнего тиогликозидом 7 проводили в абсолютном ацетонитриле при промотировании NIS и ТЮН (схема 13, а). В данных условиях реакция протекала стерео- и региоизбирательно, целевой трисахарид 11 был получен с выходом 79% практически без образования нежелательного р-изомера. Надо отметить, что данный результат превосходит известные для реакций сиалилирования различных производных лактозы сиалил-донорами без соучаствующей группы при С-3, выходы в которых не превышали 70% и, при этом, Строение продукта 11 подтверждалось данными спектров ЯМР (табл. 4 и 5).
Направление гликозилирования подтверждалось более Т 1 слабопольным положением в спектре С-ЯМР трисахарида 11 сигнала С-3 (76.1 м.д.) по сравнению с его положением (73.5 м.д.) в спектре диола 12. а-Конфигурация остатка нейраминовой кислоты подтверждалась положением сигнала Н-4" при 4.83 м.д., величиной Jr, 8й 7.6 Гц, а также расстоянием между сигналами протонов Н-9"а и Н-9"ь (0.36 м.д.). Эти величины находились в полном соответствии с известными эмпирическим правилом [88], согласно которому в спектрах Н-ЛМР тетраацетилированный а-связанный остаток Neu5Ac имеет: 6 Н-4 4.80 -4.93 м.д., J7j 8 6.2 - 8.5 Гц, а Д5 (Н-9а - Н-9Ь) меньше, чем 0.5 м.д. Далее нами проводилась конденсация полученного трисахарида Не дисахаридным гликозилдонором 47 с образованием требуемого производного GMi 52 (схема 13, б) с выходом 85% (считая на прореагировавший акцептор). Р -Конфигурация созданной гликозидной связи подтверждалась характеристической величиной КССВ J г,г 8.6 Гц в спектре 1Н-ЯМР, а положение гликозилирования — слабопольным положением сигнала С-4 (76.3 м.д.) в спектре 13С-ЯМР. Удаление защитных групп в пентасахариде 52 проводили по методике, аналогичной использовавшейся для получения тетрасахарида 1 (схема 13, в-е). Целевое производное GMi 3 выделили колоночной хроматографией с общим выходом 85%, считая на защищенный 52. Строение 3, а именно конфигурации аномерных центров, направления межзвеньевых связей и наличие аминоэтильного агликона (8 CH2NH2 38.4 м.д.), подтверждено данными спектров Н- (табл. 4) и С-ЯМР (табл. 5), а-Конфигурация остатка нейраминовой кислоты в продукте 3 подтверждена величиной химического сдвига протонов H-3eq (2.70 м.д.) и Н-4 (3.70 м.д.), что находится в полном соответствии с упомянутым выше эмпирическим правилом, согласно которым, для незащищенного а-связанного остатка нейраминовой кислоты сигнал H-3eq лежит в диапазоне 2.67 - 2.72 м.д., а сигнал Н-4 - в диапазоне 3.6 - 3.8 м.д. Избирательно защищенное производное пентасахаридной цепи гликолипида Gb5 53 получали конденсацией донора 47 и известного моногидроксильного производного глоботриозы (Gb3) 16 [67] в дихлорметане в присутствии iV-иодсукцинимида и трифторметансульфокислоты как показано на схеме 14. Пентасахарид 53 был получен с выходом 73%. Р-Конфигурация галактозаминового остатка в последнем подтверждалась характерной величиной КССВ J!2 (8.5 Гц), а наличие связи GalN-(l—»3)-Gal -слабопольным положением в спектре 13С-ЯМР сигнала С-3 остатка Gala при 79.9 м.д.
Как сообщалось в литературном обзоре, ранее уже описано получение олигосахаридной цепи Gb5 [36, 43] конденсацией производных глоботриозы с гликозил-донорами трихлорацетимидатного типа на основе ТУ-фталоильных производных дисахарида p-D-Gal-(l-»3)-D-GalN. Однако, данные реакции протекали значительно менее эффективно, чем в проведенном нами синтезе пентасахарида 53, что было связано с низкой региоселективностью реакции [36], а также побочной перегруппировкой гликозилимидата в соответствующий гликозиламид [41]. Омыление сложноэфирных групп в пентасахариде 53 и последующее іУ-ацетилирование, гидрогенолиз и выделение конечного продукта с помощью гель-фильтрации проводили в условиях, аналогичных использовании для синтеза олигосахаридов 1 и 3. В результате свободный аминоэтилгликозид 6 был получен с общим выходом 86%, считая на 53. Строение продукта 6 подтверждалось данными спектров Н- и 13С-ЯМР (табл. 4 и 5), как описано выше для соединений 1 и 3. 3.6 Получение аминоэтилгликозидов углеводных цепей гликолипидов GM2 и Gb4. С использованием моносахаридного гликозилдонора 46 нами были получены тетрасахариды GM2 и Gb4. Так, конденсацией тиогликозида 46 и трисахарида 11 в дихлорметане в условиях использовавшихся в синтезе 52 было получено защищенное производное GM2 54 (схема 15, а) с выходом 67%. Р-Конфигурация созданной гликозидной связи подтверждалась характеристической величиной КССВ Ji«t2« 8.3 Гц в спектре Н-ЯМР, а положение гликозилирования - слабопольным положением сигнала С-4 (77.2 м.д.) в спектре С-ЯМР. Защитные группы в продукте 54 удаляли по методике аналогичной использовавшейся для получения 1, 3 и 6. Целевой аминоэтилгликозид GM2 2 выделяли гель-хроматографией с общим выходом 68%, считая на исходный 54. Конденсацией трисахарида 16 и тиогликозида 46 в дихлорметане в условиях аналогичных использованным для синтеза тетрасахарида 53, получали тетрасахарид 55 с выходом 88% (схема 16, б-д). р-Кон фигурация галактозаминового остатка в последнем подтверждалась характерной величиной соответствующей КССВ Ji 2 (8-5 Гц) в спектре Н-ЯМР (Табл. 1), а наличие связи GalN-(l— 3)-Gal - слабопольным положением в спектре 13С-ЯМР сигнала С-3"(80.8 м.д.).
Получение неогликоконъюгата углеводной цепи GM( с поли акрил амидом.
Из пентасахаридного производного GM1 3 был получен неогликоконъюгат с полиакриламидом 63 для использования в качестве поливалентного антигена в экспериментах по исследованию углеводной специфичности лектинов. Конденсацию аминоэтилгликозида 3 с и-нитрофениловым эфиром полиакриловой кислоты 62 в присутствии триэтиламина проводили по известной методике [91] (схема 19). Соотношение 3 и 62 выбиралось таким образом, чтобы одна молекула углеводного ли ганда приходилась в среднем на пять звеньев полимерной цепи, поскольку такое распределение является оптимальным для проведения гликобиологических экспериментов [91]. Полноту включения гексасахарида в конъюгат контролировали с помощью ТСХ по исчезновению проявляемого нингидрином пятна аминоэтилгликозида 3. Оставшиеся непрореагировавшие карбоксильные группы в поливалентном носителе 62 переводили в 7У-(2-гидрокси)этиламидные обработкой избытком этаноламина. Конъюгат 63 был получен с количественным выходом в виде триэтиламмониевой соли по карбоксильным группам остатков нейраминовой кислоты, что подтверждалось появлением в спектре !Н-ЯМР триплета и квадруплета с характерными значениями химических сдвигов (5 1.25 и 3.15 м.д., соответственно для метильной и метиленовой групп) а в спектре С-ЯМР - соответствующих сигналов 6 4.2 и 42.6 м.д. Сигналы углеводной части гликополимера в спектрах Н-ЯМР и ,3 С-ЯМР совпадают с таковыми для исходного аминоэтилгликозида 3, за исключением того, что сигналы кольцевых атомов глюкозного остатка и спейсерной группы сильно уширены. По-видимому, это связано с близостью данных атомов к полимерной матрице, что вызывает изменение их времен релаксации. Присутствие в гликоконъюгате 63 2-оксиэтиламидных групп подтвержалось наличием сигналов (5 47.1 и 55.7 для групп NHCH2 и СНгОН соответственно) в спектре 13С-ЯМР. Сигналы полимерной матрицы в спектре 13С-ЯМР практически неразличимы, а в протонном спектре очень сильно уширены. Таким образом, сигналы полимерной матрицы в водном растворе конъюгата 63 имеют вид более характерный для спектров ЯМР твердого тела.
Методики очистки растворителей и реагентов, условия съемки спектров ЯМР и определения физико-химических констант приведены в работе [92]. Молекулярные сита активировали нагреванием при 180 С в вакууме масляного насоса (0.1 мм рт.ст) в течение 2-4 часов, после чего они хранились в атмосфере Аг. В реакциях гликозилирования использовались порошкообразные молекулярные сита Union Carbide Type 3 А и 4 A (Fluka). Спектры 1Н- и 13С-ЯМР регистрировали на приборах Bruker DRX-500 и Bruker АМ-300 при 25 С. При описании спектров ЯМР используется маркировка одинаковых моносахаридных остатков штрихом начиная с восстанавливающего конца. Оптическое вращение измеряли на цифровом поляриметре Jasco DIP-360 при 18-25С. Масс-спектры (электроспрей) регистрировали на приборе Finnigan LCQ. Хроматографию в тонком слое проводили на пластинках с силикагелем Kieselgel-60 F254 (Merck), вещества обнаруживали обработкой 10 об.% раствором ортофосфорной кислоты в этиловом спирте, или (для аминов) раствором нингидрина (3 г/л в смеси бутанол/уксусная кислота, 30:1) с последующим нагреванием при 150 С. Колоночную хроматографию выполняли на силикагеле Silicagel 60 (70-230 меш, Fluka) 0.063 - 0.2 мм. Хроматографию MPLC (Medium pressure liquid chromatography) выполняли на колонках с силикагелем Silasorb 600 (20 мкм, Chemapol). Хроматографию на обращенной фазе выполняли на колонке Chromsphere 5 CI8 (Chrompack), при элюировании водой. Гель-хроматографию выполняли на колонках с гелем Sephadex LH-20 (2 х 40 см) при элюировании метанолом со скоростью потока 1мл/мин, Bio-Beads S-X3 (68 х 2.5 см, Bio-Rad) при элюировании толуолом и TSK-HW40S (1.5 х 90 см) при элюировании 0.1 М водной уксусной кислотой со скоростью потока 1 мл/мин. Гидрогенолиз проводили над 10% Pd/C (Merck) при атмосферном давлении. Тонкослойную хроматографию свободных аминоэтилгликозидов проводили в смесях элюотропных систем БПС (бутанол, пропанол, ОЛ М соляная кислота 1:2:1) и АМВ (ацетонитрил, метанол, вода 1:1:1). (2-Хлорзтил)-2,3,6-три-0-ацетил-4-0-(2,3,4,6-тетра-(?-ацетил-Р-і)-галактопиранозил)-р-І -глюкошіранозид (18). Раствор 2.02 г (2.9 ммоль) лактозилбромида (17) в сухом 2-хлорэтаноле (4 мл) перемешивали при 60 С с 729 мг (2,88 ммоль) цианида ртути и 110 мг (0.31 ммоль) бромида ртути 4 часа при к.т. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (150 мл) и органический слой промывали насыщенным раствором NaHCOj (2x50 мл), водой (70 мл) и упаривали. Остаток хроматографировали в системе толуол - этилацетат 2:1 и получали 1.5 г (74%) гликозида (18), белая пена, Rf 0.54 (толуол - этилацетат, 3:2), [а]о +9.0 (с 1, хлороформ). (2-Азндоэтил)-2,3,6-три-0-ацетил-4-0-(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-0-галактопираіюзил)-Р-/ -глн копираііозид (19). Суспензию 2.15 г (33 ммоль) NaN3 в растворе 2.81 г (3,3 ммоль) хлорэтилгликозида (18) и 871 мг (3.3 ммоль) 18-краун-6 в ДМФА (12 мл) перемешивали в течение 18 ч при 65 С. Смесь разбавляли этилацетатом (350 мл), промывали водой (4x150 мл), фильтровали через слой ваты, упаривали и получали 2,27 г (97%) азида (19), белая пена, Rf 0.62 (толуол - этилацетат, 3:2), [а]о -16.5 (с 2, этилацетат). Элементный анализ, %: найдено С 48.18, Н 5.71, N 6.24; C28H54O18N3.
Вычислено %: С 47.66, Н 5.53, N 5.96. (2-Азидоэтил)-4-СЦЗ,4-0-изопропилиден-р-/)-галактопиранозил)-р-/ -глюко-пиранозид (20). Раствор 5.17 г (7.33 ммоль) азидоэтиллактозида (19) в 35 мл ОЛ н. раствора метилата натрия в метаноле выдерживали 24 часа и нейтализовали катионитом КУ-2 (ЇҐ), фильтровали, катионит промывали метанолом (2x10 мл), фильтраты объединяли и концентрировали на роторном испарителе. Остаток 2 часа высушивали на вакууме масляного насоса, растворяли в смеси 6 мл 2,2-диметоксипропана, 1.8 мл ацетона и 23 мг моногидрата п-толуол сульфокислоти и перемешивали 5 мин. при 60 С. Смесь охлаждали до к.т., выпавшие кристаллы отфильтровывали и промывали 5 мл холодного ацетона, объединенные фильтраты концентрировали и перекристаллизовывали из 1 мл ацетона. После высушивания на вакууме масляного насоса получали 2.73 г (82%) ацетонида (20), белые кристаллы, іпл— 167 - 169 С, R{ 0.50 (этилацетат - метанол, 3:1), [а]о +19.8 (с 1, метанол). (2-Азидоэтил)-2,3,6-три-0-бензил-4-0-(2,6-ди-0-бензил-р-/)-галакто-пиранозил)-Р-.0-глюкопиранозид (12). К раствору 0.5 г (1.07 ммоль) ацетонида (20) в сухом ДМФ (10 мл), охлажденному до 0 С, при перемешивании прибавляли 430 мг (60% суспензия в масле, 10.8 ммоль) NaH. После прекращения выделения газа, при перемешивании прикапывали 760 мкл (6.4 ммоль) ВпВг. Выдерживали 4 часа, избыток NaH разлагали метанолом (2 мл). К реакционной смеси прибавляли 90% АсОН (10 мл) и нагревали на масляной бане до 80 С в течении 5 часов. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (100 мл), промывали водой (2 х 100 мл) и насыщенным раствором NaCl (50 мл). Органический слой отделяли, упаривали и из остатка колоночной хроматографией (толуол-этилацетат, 3:1) выделяли 900 мг (98%) дисахарида (12), белая пена, Rr 0.23 (дихлорметан - этилацетат, 10:1), [a]D +15.2 (с 2, СНОз). (2-Азидоэтил)-2,3,6-три-0-бензил-4-0-[2,6-ди-0-бензил-3-0-(4-метокси-бензил)-р-/)-галактопиранозил]-Р-/ -глюкопиранозид (10). К раствору 170 мг (0.2 ммоль) диола (12) в толуоле (10 мл) прибавляли 60 мг (0.24 ммоль) ВигЗпО и кипятили с азеотропной отгонкой воды в течение 1 ч. К реакционной смеси прибавляли 30 мкл (0.22 ммоль) МРМС1 , 64 мг (0.2 ммоль) Bii4NBr и кипятили 1.5 ч. Реакционную смесь упаривали, из остатка колоночной хроматографией (дихлорметан-этилацетат, 15:1) выделяли 180 мг (93%) дисахарида (10), белая пена, Rf 0.67 (дихлорметан -этилацетат, 10:1), [ct]D +24.2 (с 2, СНС13). (2-Азидозтил)-4-0-(4,6-0-бензилиден-р-і)-галактопиранозил)-Р-і -глюкопиранозид (21). Раствор 4.3 г (6.1 ммоль) азидоэтиллактозида (19) в 30 мл 0Л н. раствора метилата натрия в метаноле выдерживали 24 часа и нейтрализовали катионитом КУ-2 (let), фильтровали, катионит промывали метанолом (2x10 мл), фильтраты объединяли и концентрировали на роторном испарителе.
