Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1 Эпимеризация авермектина 11
1.2 Методы синтеза авермектина 16
1.3 Методы деградации молекулы авермектина 20
1.4 Получение 4 и 4а-производных авермектина 22
1.5 Получение 4-производных авермектина 28
1.6 Получение оксо-соединений авермектина 35
1.7 Получение различных алкилпроизводных авермектина 40
2 Химическая часть 47
2.1 Разделение метильной и этильной компонент авермектина ВЭЖХ 48
2.2 Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот 53
2.3 Силилирование авермектина по 5-гидроксильной группе 59
2.4 Ацилирование силильного производного авермектина по 4-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот 60
1.1 Ацилирование авермектина ангидридами холеновых кислот 70
1.2 Ацилирование авермектина по 4-гидроксильной группе ангидридами холеновых кислот 74
3 Экспериментальная часть 79
3.1 Исходные соединения 79
3.2 Применяемые методы анализа 79
3.3 Методики синтеза соединений 80
3.3.1 Ацилирование авермектина малеиновым ангидридом 80
3.3.2 Ацилирование авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты 81
3.3.3 Ацилирование авермектина ангидридом 5-фенилбицикло[2.2.1]гептан-2,3-дикарбоновой кислоты 81
3.3.4 Ацилирование авермектина ангидридом трицикло[3.2.2.02,4 ]нон-8-ен-6,7-дикарбоновой кислоты 82
3.3.5 Ацилирование авермектина ангидридом циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоновой кислоты 83
3.3.6 Ацилирование авермектина ангидридом бензол-1,2-дикарбоновой кислоты 84
3.3.7 Ацилирование авермектина ангидридом бицикло[2.2.1 ]гепт-5-ен-2,3-дикарбоновой кислоты 84
3.3.8 Ацилирование авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1] гексан-2,3-дикарбоновой кислоты 85
3.3.9 Ацилирование авермектина ангидридом 3,4,5,6-тетрахлорбензол-1,2-дикарбоновой кислоты 86
3.3.10 Силилирование 5-ОН группы авермектина трет-бутилдиметилсилилхлоридом 87
3.3.11 Удаление силильной защиты 88
3.3.12 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом малеиновой к-ты 88
3.3.13 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой к-ты 89
3.3.14 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 5-фенилбицикло[2.2.1]гептан-2,3-дикарбоновой кислоты 89
3.3.15 Ацилирование авермектина ангидридом трицикло[3.2.2.02,4 ]нон-8-ен-6,7-дикарбоновой кислоты 90
3.3.16 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом циклогексен-1,2-дикарбоновой кислоты 91
3.3.17 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом бензол-1,2-дикарбоновой кислоты 92
3.3.18 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2,3-дикарбоновой кислоты 93
3.3.19 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 3,4,5,6-тетрахлорбензол-1,2-дикарбоновой кислоты 93
3.3.20 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1]гексан-2,3-дикарбоновой кислоты 94
3.3.21 Синтез ангидрида А5-3 Р-ацетоксихоленовой кислоты 95
3.3.22 Синтез ангидрида А4-3-кето-холеновой кислоты 95
3.3.23 Синтез ангидрида дегидрохоленовой кислоты 96
3.3.24 Ацилирование авермектина ангидридом А5-3Р-ацетоксихоленовой кислоты 96
3.3.25 Окисление по Оппенауэру холеновой кислоты 97
3.3.26 Ацилирование авермектина ангидридом А4-3-кето-холеновой кислоты 97
3.3.27 Ацилирование авермектина ангидридом дегидрохоленовой кислоты 98
3.3.28 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом А5-ЗР-
3.3.29 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом дегидрохоленовой кислоты 100
3.3.30 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом А4-3-кето-холеновой кислоты 100
3.3.31 Методика разделения метильной и этильной компонентов авермектина методом ВЭЖХ 101
3.3.32 Методика скрининга противопаразитарной активности 5-О-производных авермектина За-і на олигохетах Tubifwidal tubifex 102
Список принятых сокращений 105
Список использованной литературы 106
- Методы деградации молекулы авермектина
- Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот
- Ацилирование авермектина малеиновым ангидридом
- Ацилирование авермектина ангидридом А5-3Р-ацетоксихоленовой кислоты
Методы деградации молекулы авермектина
Полный синтез авермектина был рассмотрен в статьях [21, 22]. Изначально также получали агликон из трех субъединиц, состоящих из фрагмента гексагидробензофурана (А), спирокеталя - сегмент (B), а также ациклической части (С), включающей атомы C9-C15. Каждый из сегментов синтезировали отдельно и затем соединяли. Присоединение осуществляли в последовательности B+C (B - C) + А, и полный синтез завершали путем присоединения к агликону дисахарида L-олеандрозил-L- олеандрозы.
Также 16-стадийный синтез единичного фрагмента спирокеталя молекулы авермектина В1 описан в статье [23]. В другой работе [24] синтезировали олигосахариды из тиофенилсахаров через гликозилфториды, которые затем использовали для синтеза авермектина В1а.
В работе [25] сообщается о первом синтезе (+)-авермектина B1a. Его получение основано на стереоспецифическом полном синтезе "северного" C11-C28 сегмента молекулы авермектина, полученного из (S)-яблочной кислоты и L-изолейцина и последующим соединением с функционализированным "южным" сегментом, макролактонизации, стереоконтролируемого гликозилирования.
Важным фактором при планировании синтеза авермектина является наличие необходимых единиц дисахаридов. Данишевский с сотрудниками [26] решили эту проблему, разработав полный синтез олеандрозил-олеандрозы (10 стадий из ацетальдегида до гликаля - аналога 2-4"-ацетата). Другой полный синтез производных дисахаров был описан Николау [27], Ватс [28] и Барретом [29]. Альтернативный метод состоял в получении олеандрозил-олеандрозы путем химической деструкции природного авермектина [30]. В другой работе [31] для получения желаемого дисахарида авторы предлагали двухстадийную деструкцию авермектина, используя озон, метилсульфид и далее DBU (схема 1.7).
Авермектин является одним из нескольких натуральных продуктов, который получают с помощью итерационного гликозилирования, то есть посредством образования связи с олигосахаридами. В работе [32] присоединение различных остатков сахаров, катализируемое олеандрозил-дисахаридами, происходило тандемно без полного биохимического синтеза авермектина. Это исследование значительно расширило набор известных D-сахаров нуклеотидных субстратов и обеспечило быстрый одностадийный синтез для создания 50 различных гликозилированных авермектинов. 1.3 Методы деградации молекулы авермектина
Помимо введения в структуру авермектина различных функциональных групп, ряд авторов [33, 34] также проводили и его деструкцию, чтобы получить соответствующие функциональные сегменты. Последние могут быть использованы для подтверждения структуры промежуточных соединений, а также в качестве прекурсоров гибридных или полусинтетических аналогов (схема 1.8).
В статье [35] рассмотрена деструкция авермектина с помощью DBU в метаноле с получением нескольких продуктов, основным из которых был дельта-2,3-секо-метиловый эфир кислоты, который может быть использован, как исходный материал для синтеза аналогов авермектина. При выборе в качестве растворителя диэтиламин был получен единственный продукт (выход 90 %) дельта-2,3-изомер авермектина B1 (схема 1.9). но,,
В работе [36] были рассмотрены несколько возможных путей деградации авермектинов, в том числе кислотно-катализируемое сольволитическое замещение группы олеандрозы, что приводило к моносахариду и агликону, а также присоединение молекулы растворителя к 22-23 двойной связи авермектина. При гидролизе авермектина в водном THF, содержащем 10 % концентрированной H2SO4, получалась смесь моносахаридов 5 и 6 агликона (рисунок 1.3), из которой чистые агликоны были выделены только с помощью колоночной хроматографии. При применении кислотно-катализируемого метанолиза чистый агликон 6 также не был получен. Замена метанола на 2-пропанол привела к селективному расщеплению только олеандрозил-олеандрозы связи и получению моносахарида 7 с хорошим выходом.
Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот
В результате анализа имеющихся в литературе данных о современных противопаразитарных лекарственных веществах в качестве исходного объекта для разработки эффективного препарата нового поколения был выбран авермектин В1.
Как уже отмечалось выше, в молекуле авермектина В1 имеется несколько реакционных центров, позволяющих проводить различные модификации. За более чем тридцатилетнюю историю развития химии авермектинов накоплен большой материал, отраженный в обзоре литературы. При планировании синтеза перспективных веществ с потенциально высокой противопаразитарной активностью необходимо было исключить из рассмотрения все уже использованные в литературе варианты получения производных авермектина. Из всего многообразия возможных реакционных центров в молекуле этого макролида наибольший интерес представляет самая доступная и, соответственно, наиболее реакционноспособная гидроксильная группа в 5 положении макролидного цикла, а также стерически затрудненная, но также реакционноспособная гидроксильная группа в 4 положении остатка 2,6-дидезокси-3-О-метил-L-арабиногексозы. Однако мы установили, что количество производных, полученных с использованием гидроксильной группы в 5 положении, относительно невелико. Это, по-видимому, связано с тем, что долгое время считалось необходимым для проявления противопаразитарной активности наличие в молекуле замещенного авермектина «свободной» гидроксильной группы в наиболее реакционноспособном 5 положении макроцикла. В то же время, рассмотрение литературных источников показало, что такие вещества не были получены, и изучение противопаразитарной активности этих производных не проводилось (возможно, за исключением 5-ацетилавермектина).
В связи с этим наиболее перспективным направлением исследований, по нашему мнению, был синтез с использованием гидроксильной группы в 5 и 4 положениях. Из огромного числа возможных превращений нами были выбраны реакции ацилирования. Эти реакции характеризуются относительно дешевизной исходных реагентов, простотой исполнения и отсутствием необходимости больших энергозатрат. В качестве ацилирующих агентов предполагалось применять ангидриды двухосновных карбоновых кислот, так как наличие карбоксильной группы в молекуле синтезированных соединений обеспечит хорошую растворимость в воде. Это, во-первых, существенно упрощает получение препаратов и, во-вторых, будет способствовать быстрому выведению из организма животных после оказания лечебного действия.
Полученные в результате целевые вещества являются результатом минимальной (1 стадия) обработки исходного авермектина В1, а отходы производства практически отсутствуют, т.к. авермектин В1 и ангидриды дикарбоновых кислот практически полностью расходуются и все используемые растворители регенерируются.
Разделение метильной и этильной компонент авермектина ВЭЖХ Как уже говорилось выше, авермектин В1 (1) является двухкомпонентной смесью (основной компонент B1a содержит втор-бутильную группу у C25 атома углерода ( 80%); вспомогательный компонент В1b, ( 20%) содержит изопропильную группу). В литературе, однако, данные по активности индивидуальных веществ отсутствовали. Поэтому, прежде всего перед нами стояла задача разделения компонентов авермектина и гемисукцината авермектина методом ВЭЖХ и исследование биологической активности индивидуальных компонентов. Это позволило бы сделать выводы о целесообразности использования смеси или индивидуально одного из составляющих авермектина. С помощью ВЭЖХ были успешно выделены метильная и этильная производные авермектина. На хроматограмме были обнаружены два пика: 1, соответствующий метильной компоненте и 2, соответствующий этильной (рисунок 2.1). Нами также было проведено получение этильного и метильного компонент 5-О-гемисукцинатов авермектина.
Индивидуальные компоненты были наработаны в количествах, достаточных для изучения их строения, а также для проведения испытаний на противопаразитарную активность. В Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии (МГАВМиБ) сравнением биоцидного действия на олигохетах Tubificidal tubifex было установлено, что противопаразитарная активность метильного и этильного производных авермектина практически одинаковы. Как и в случае самого авермектина, противопаразитарная активность гемисукцианов также оказалась близкой. Нами было проведено исследование строения метильной и этильной компонент авермектина и гемисукцината авермектина с помощью одномерных и двумерных методик спектроскопии ЯМР Н и ЯМР 13С. Следует отметить, сравнительно малое количество данных о строении авермектина в литературных источниках. ЯМР !Н спектр авермектина представлен на рисунке 2.2. Полученные результаты также доказывают: ацилирование авермектина протекает именно по 5 гидроксильной группе, так как изменяются сигналы близлежащих групп, в то время как сигналы у 4-ОН группы остаются постоянными (значения м.д. сигналов (области), представлены в таблице 2.1).
Ацилирование авермектина малеиновым ангидридом
Наши предположения были подтверждены данными инфракрасной спектроскопии при исследовании раствора авермектина с различной концентрацией в CDCl3. Из литературных данных известно, что межмолекулярные водородные связи разрываются при разбавлении в неполярных растворителях, тогда как внутримолекулярные водородные связи от растворителя не зависят [95]. Интенсивные полосы гидроксильных групп, связанных межмолекулярной водородной связью, увеличиваются с возрастанием концентрации раствора, а полоса гидроксильной группы с внутримолекулярной водородной связью не зависит от концентрации [96]. При рассмотрении инфракрасного спектра 0,1М раствора авермектина в СDCl3 (рисунок 2.11) видно, что валентные колебания ОН группы в области 3474 см-1 соответствуют межмолекулярным ассоциированным водородным связям, так как уменьшаются (3480 см-1) при разбавлении раствора авермектина в 5 раз, а при разбавлении в 10 раз исчезают совсем. В то время как полоса поглощения в области 3573 см-1 не изменяется с разбавлением раствора и остается постоянной, что свидетельствует о наличии внутримолекулярной водородной связи в молекуле авермектина.
Таким образом, ацилирование авермектина протекает селективно по 5 гидроксильной группе, которая не связана водородной связью (расчетное расстояние 3,71 ) и является более реакционноспособной. 4-гидроксильная группа менее реакционно способна в реакциях ацилирования, поскольку протон 4-ОН группы участвует в образовании водородной связи с метокси группой. Ацилирование по 4 положению можно осуществить только после блокирования 5-гидроксильной группы трет-бутилдиметилсилильной защитой и увеличения времени реакции.
Во-вторых, следует отметить, что 5 гидроксильная группа находится в аллиловом положении по отношению к двойной связи в 4 положении макролидного цикла (см. рисунок 1.1, стр. 10). Энергия связи в аллиловых спиртах (С5—ОН) обычно на 50-105 кДж/моль меньше, чем в насыщенном аналоге (С4-ОН), что также может являться одной из причин повышенной химической активности 5 гидроксильной группы в реакциях ацилирования по сравнению с 4-ОН группой.
При проведении реакции ацилирования вицинальными дикарбоновыми кислотами мы использовали 4-диметиламинопиридин (DMAP) в качестве катализатора. Образующаяся промежуточная частица (схема 2.4) является ацилирующим агентом, намного превосходящим по реакционной способности ацилгалогениды, ангидриды и другие производные карбоновых кислот. При взаимодействии ацилдиметиламинопиридиний-катиона с аверметином в первую очередь происходило ацилирование более реакционноспособной 5 гидроксильной группы с образованием устойчивого промежуточного комплекса.
При изучении противопаразитарной активности синтезированных соединений [92] в НИЛ Бионаноиммунологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина, был использован экспресс-метод оценки биоцидной активности с применением олигохет Tubificidal tubifex в качестве тест-объектов. Экспресс-метод проводили по методике [93], определяя концентрацию исследуемого образца, при которой смертность олигохет составляет 50 % (СК50). Противопаразитарную активность определяли путем сравнения СК50 исследуемого образца и эталонного образца известной концентрации, полученные данные представлены в таблице 2.3.
Анализ данных таблицы свидетельствует, что противопаразитарные соединения более активны по сравнению с известными средствами. Так, например, как видно из таблицы 2.2, известное средство «клозантел» значительно уступает предлагаемым соединениям. Что же касается авермектина В1, то при его использовании для поражения 80-100 % олигохет при концентрации 25 мкг/мл необходима экспозиция в течение 180 минут, тогда как при использовании предлагаемых соединений для достижения такого же эффекта требуется в шесть раз меньше времени (30 минут).
Анализ противопаразитарной активности 4-О-производных авермектина в НИЛ Бионаноиммунологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина на олигохетах Tubificidal tubifex показал, что все полученные и исследованные вещества имели аналогичную высокую активность, превосходящую активность известных препаратов, используемых в качестве контроля. Следовательно синтезированные новые карбоксилсодержащие 5-О- и 4-О-ацилпроизводные авермектина могут быть использованы для замены препарата, к которому развилась резистентность у паразитов с течением времени.
Ацилирование авермектина ангидридами холеновых кислот
Следующим аспектом нашей работы была попытка провести ацилирование авермектина ангидридами, содержащими стероидный фрагмент. Поскольку стероиды обладают высокой биологической активностью, то можно было предположить, что стероидные производные авермектина проявят, помимо противопаразитарной активности, дополнительный набор свойств. В связи с этим перед нами стояла перспективность синтеза новых препаратов на основе авермектина и холеновых кислот с целью улучшения их фармакокинетических свойств, таких как растворимость, биодоступность и низкая токсичность. Для получения ангидридов были опробованы несколько методик с пентаоксидом фосфора и Л -дициклогексилкарбодиимидом в сухом хлористом метилене. Реакция с пятиокисью фосфора не прошла, с DCC впервые был получен ангидрид 5-Зр-ацетоксихоленовой кислоты 8 с выходом 78 % (схема 2.5).
Ацилирование авермектина ангидридом А5-3Р-ацетоксихоленовой кислоты
Окисление холеновой кислоты (0,1 г, 0,27 ммоль) по Оппенауэру проводят в сухом толуоле. Прибавляют к раствору свежеперегнанный циклогексанон (1,5 мл) и растворенный Al(/-РгО)3 (0,121г, 0,59 ммоль) в сухом толуоле (10 мл). Реакционную смесь кипятят Зч (контроль по ТСХ). Затем охлаждают до комнатной температуры. Для разложения избытка изопропоксида алюминия к реакционной смеси добавляют 30 % раствор уксусной кислоты (150 мл), органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором NaHCOs (3х10мл). Водный слой экстрагируют хлороформом (3х15мл) и промывают насыщенным раствором NaHCO3 (3х10мл). Органические слои объединяют, промывают водой до рН=7. Циклогексанон удаляют перегонкой с паром. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем (элюент: петролейный эфир-этилацетат). Получают 65мг. Выход 66 %. ЯМР 1Н (300 МГц, CDC13, , м.д., J/Гц): 0.71 (с, 3Н, 18-СН3), 0,92 (3Н, с, 20-СН3), 1.10 (3Н, с, 19-СН3), 5.74 (1Н, с, 4-Н). Ацилирование авермектина ангидридом А4-3-кето-холеновой кислоты
Растворяют 0,200г (2,2910"5 моль) авермектина в сухом СН2С12, вносят 0,043 г (5,92Ю-5 моль) ангидрида А4-3-кето-холеновой кислоты и добавляют каталитическое количество 4-диметиламинопиридина (DMAP) (10мг). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 13 суток (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь выливают в воду.
Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом А5-Зр-ацетоксихоленовой кислоты
Растворяют 0,081г (8,19хЮ"5 моль) силильного производного авермектина в сухом СН2С12, вносят 0,200г (2,46хЮ 4 моль) ангидрида и добавляют каталитическое количество DMAP (15мг). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 26 суток (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь выливают в воду. Полученный мелкокристаллический осадок экстрагируют этилацетатом (3x10 мл), объединенные органические фракции сушат MgS04, фильтруют и упаривают в вакууме. Разделение проводилось на жидкостном хроматографе 1100 LC/MSD фирмы AgilentTechnologies (США) с колонкой HiQ (С18) 5мкм, 4,650 мм (PeekeScientific, США), расход элюента 3,750 мл/мин., объем пробы варьировался в зависимости от концентрации веществ от 0,5мкл до 12мкл. Детекторы: УФ-спектрофотометрический детектор (DAD), детектор по светорассеиванию в паровой фазе (SEDEXLT-ELSD85 (Sedere, France)) и одноквадрупольный масс-селективный детектор с ионизацией при атмосферном давлении в режиме электрораспыления (ЭР, API-ES) и химической ионизацией при атмосферном давлении (ХИАД, APCl). В качестве подвижных фаз использовали: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле/воде (5/95), 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Авермектин - время удерживания: Пик 1 – минорная компонента (метильная) – 2,214 мин, пик 2 – мажорная компонента (этильная) – 2,
Методика скрининга противопаразитарной активности 5-О-производных авермектина 3а-i на олигохетах Tubificidal tubifex. При изучении противопаразитарной активности был использован экспресс метод оценки биоцидной активности с применением олигохет Tubificidal tubifex в качестве тест-объектов [90]. Образцы соединений по 10мг (взвешиваются на электронных весах) вносят в плоскодонные колбочки (объем 20-30 мл). Наливают по 10 мл этилового (или изопропилового) спирта и перемешивая растворяют. Далее продолжают разведения до концентраций в интервале от 1 мкг\мл до 100 мкг/мл с шагами 5-10 или 10-20 мкг/мл. Растворы нужной концентрации выливают в чашки Петри с диаметром 5-10 см, куда переносят по 10-15 особей олигохет произвольных размеров, фиксируя время. Наблюдая за активностью червей через 30, 60, 120 или 180 мин находят концентрацию, при которой достигается 50% гибель олигохет. Наиболее эффективные соединения отбираются для дальнейших исследований. Олигохеты культивируются в прозрачных стеклянных емкостях, наполненных пресней водой. Двигательная активность фиксируется визиуально. Результаты наблюдения записываются в таблицах в лабораторных журналах. В качестве контроля используют применяемые в настоящее время в ветеринарии препараты: абамектин, ивермектин, клозантел и другие.
При определении активности исследуемое вещество растворяют в воде при определенной концентрации, затем в полученное средство (препарат) вносят олигохеты по 10 - 20 особей и выдерживают, в течение 1 - 3 ч, после чего подсчитывают общее количество олигохет А в каждом из растворов исследуемого вещества, количество активно подвижных нематод B, количество нематод с нарушенной подвижностью C и количество неподвижных нематод D, вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении по формуле 1 - [B + (C 0,5) + (D 0)] /A 100, находят концентрацию исследуемого образца при которой смертность олигохет составляет 50% (СК50), и определяют противопаразитарную активность путем сравнения СК50 исследуемого образца и эталонного образца известной концентрации. Проводили определение нематоцидной активности c использованием предлагаемого средства при концентрации 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл. Результаты исследования средств, содержащих соединение общей формулы 3а-i, приведены в таблице 2.3 химической части и в приложении.
