Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Синтез производных салициловой кислоты (литературный обзор) .. 7
1.1 Общие методы получения простых и сложных эфиров салициловой кислоты 7
1.2 Общие методы получения амидов салициловой кислоты 18
1.3 Влияние изменений в строении производных салициловой кислоты на их активность 26
1.4 Заключение по литературному обзору 29
Глава 2. Обсуждение результатов 30
2.1 Исследование особенностей синтеза алкильных эфиров салициловой кислоты: этерификация спиртами и алкилирование галогенидами 30
2.2 Кинетика алкилирования салициловой кислоты 50
2.3 Синтез амидов салициловой кислоты 58
2.4 Изучение липофильности и липофобности производных салициловой кислоты 64
2.5 Исследование физиологической активности и острой токсичности производных салициловой кислоты 70
Глава 3. Экспериментальная часть 84
3.1 Физико-химические методы исследования и аппаратура 84
3.2 Исходные реагенты и растворители 84
3.3 Синтез производных салициловой кислоты 86
3.4 Методы исследования биологической активности 97
Выводы 100
Список цитированной литературы 102
- Влияние изменений в строении производных салициловой кислоты на их активность
- Исследование особенностей синтеза алкильных эфиров салициловой кислоты: этерификация спиртами и алкилирование галогенидами
- Исследование физиологической активности и острой токсичности производных салициловой кислоты
- Синтез производных салициловой кислоты
Введение к работе
Актуальность темы. Химия нестероидных противовоспалительных средств (НГТВС) является одной из динамически развивающихся отраслей химической науки, что обусловлено практической значимостью этих соединений. НГТВС представляют собой обширную и разнообразную по химическому строению группу лекарственных средств, широко применяющихся в клинической практике [1]. Большинство препаратов группы НГТВС (в том числе и производные о-оксибензойной кислоты, известной как салициловая кислота — СК), относятся по современной терминологии к "кислотным" противовоспалительным средствам [1]. Им присущи и сходные побочные эффекты: повреждающее действие на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, нарушение функции почек и некоторые другие. Производные СК (салицилаты) вошли в клиническую практику с конца ХГХ века и повсеместно применяются до настоящего времени. Такие производные СК как ацетилсалициловая кислота (АСК, аспирин), салицилат натрия, салициламид (САМ), метилсалицилат используются в медицине в качестве анальгетиков (болеутоляющее), антипиретиков (жаропонижающее) и антиагрегантов (антитромботическое) [1, 2]. По последним данным производные СК можно рассматривать как биорегуляторы, которые синтезируются самим организмом и выполняют защитные функции. И это позволяет переосмыслить роль СК в патофизиологии человека и животных [3].
В связи с этим, актуальной задачей является разработка новых и усовершенствование известных путей синтеза производных СК, а также целенаправленный поиск эффективных терапевтических агентов на основе СК, отличающихся повышенной биологической активностью в сочетании с низкой токсичностью и менее выраженным побочным действием.
Цель работы состоит в разработке улучшенных способов синтеза, исследовании биологической активности производных СК, включающих
амиды, сложные и простые эфиры СК, и выявлении взаимосвязей структуры, различных видов биологической активности и острой токсичности полученных соединений.
Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:
Исследовать пути синтеза эфиров СК и АСК и подобрать оптимальные условия их получения.
Изучить кинетику синтеза сложных эфиров алкилированием соли СК соответствующими алкилгалогенидами. Определить кинетические параметры реакции.
Исследовать условия и пути синтеза амидов СК с использованием в качестве амидирующих агентов гидроксиламина, у-оксипропил амина, морфолина, аминокислот.
Изучить липофильности и липофобности полученных соединений.
Экспериментально изучить биологическую активность синтезированных соединений, включающую жаропонижающую активность, антибактериальное действие и острую токсичность. Научная новизна. Впервые получены фосфорсодержащие сложные
эфиры салициловой кислоты, а также амиды на основе различных амидирующих агентов (таких как аминокислоты, аминоспирты и морфолин), синтезированы и вновь установлены физико-химические константы ранее полученных амидов и эфиров салициловой кислоты. Изучена кинетика и установлены кинетические параметры реакции алкилирования соли салициловой кислоты аллилбромидом. Установлено, что для проведения данной реакции наиболее эффективным является К,Ы-диметилформамид.
Впервые рассчитаны константы LogP и рКа, характеризующие липофильность и липофобность веществ, позволяющие использовать их для прогноза взаимосвязи «строение - жаропонижающая активность - острая токсичность» в ряду синтезированных производных. Экспериментально установлено, что жаропонижающая и антибактериальная активности, а также
острая токсичность (ЛД50) синтезированных производных коррелируют с рассчитанными константами. Найдены соединения, имеющие более выраженную жаропонижающую активность с пролонгированным действием по сравнению с аспирином.
Практическая значимость работы. Синтезировано и
охарактеризовано 17 эфиров и 6 амидов СК.
Разработаны улучшенные способы получения эфиров СК и АСК этерификацией и алкилированием их солей алкилгалогенидом, являющихся потенциальными высокоэффективными жаропонижающими средствами, позволяющие получать целевые соединения с высоким выходом и высокой чистотой.
Предложен метод получения N-салицилоилпроизводных ГАМК и метилового эфира (З-фенил-у-аминомасляной кислоты.
Экспериментальное исследование жаропонижающей,
противомикробной активности синтезированных производных выявило высокую биологическую активность некоторых производных в сочетании с низкой токсичностью.
Изучение липофильности и липофобности полученных производных СК и АСК позволило выявить взаимосвязь «структура-активность-токсичность» в ряду полученных соединений. Установлено, что на основе синтезированных веществ целесообразен поиск новых производных СК и АСК, обладающих жаропонижающей, противомикробной и другими видами активностей пролонгированного действия, характеризующихся низкой токсичностью.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на ежегодных сессиях ВолГМУ 2003-2007 гг, Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования» (г. Воронеж, 2005 г), на III съезде фармакологов России (г. С.-Петербург, 2007 г), Международной специализированной выставке «Аптека-2007» (г. Москва, 2007 г ), III
научной международной конференции «Современные проблемы науки и образования» (г. Москва, 2008 г)
Публикация результатов. Результаты проведенных исследований опубликованы в 11 работах, из них 5 статей (из которых 1 статья в издании, рекомендованном ВАК по химическим дисциплинам и 1 статья — по биологическим наукам и медицине), тезисы 6 научных докладов, получен приоритет на 1 патент.
Объем и структура работы. Диссертационная работа включает введение, 3 главы, выводы и список использованной литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 25 рисунков и 116 литературных ссылок.
Первая глава посвящена обзору литературы по методам синтеза, химическим и фармакологическим свойствам производных СК.
Во второй главе представлены результаты исследований путей и условий синтеза производных СК и изучения различных аспектов их биологической активности.
В третьей главе изложены характеристики исходных веществ, подробное описание прописей синтеза полученных соединений и их анализа.
Влияние изменений в строении производных салициловой кислоты на их активность
Сложные эфиры, в которых СК этерифицирована активным гидроксил-несущим веществом. В данном случае действие эфира будет напоминать действие СК и соответствующего спирта или фенола. Например, фенилсалицилат, на ряду с жаропонижающим и противовоспалительным действием СК, имеет антисептическую активность [69]. Соединения, синтезированные на основе АСК и капотена [43] или СК и ибупрофена [70] имеют пролонгированное действие.
Важным фактом является то, что в случае производных АСК, этерификация карбоксильной группы делает ацильную группу в ацетилсалициловой кислоте восприимчивой к ферментативному отщеплению. Например, для сложных эфиров АСК период полуреакции для деацилирования составляет 1-3 мин, тогда как гидролиз АСК при тех же условиях длится 2 ч [17]. Кауфман с сотрудниками исследовали влияние длины цепи ацильной группы СК. Они нашли, что быстрота наступления действия (насколько это можно было судить по выделению свободной СК с мочой) изменяется параллельно с легкостью химического гидролиза. Высшие ацилсалициловые кислоты, в частности каприлсалицилат натрия, обнаруживают наркотические свойства. Диэтилацетилсалициловая кислота оказалась очень трудно поддающаяся химическому гидролизу, и вместе с тем она проявляет умеренную активность [69].
САМ лучше растворим, чем СК, но не гидролизуется с образованием свободной СК, поэтому оказывает более выраженное анальгезирующее действие, но не жаропонижающее [22]. 3-Алкилпроизводные N-замещенных САМ обладают пролонгированной анальгетической активностью, причем алкильная группа не должна содержать более четырех углеродных атомов в цепи. Было показано, что 3-амил, 3-октилпроизводные практически анальгетически неактивны [71]. Производные САМ, у которых в положении 5 имеется группа, содержащая гетероцикл, активны как гипотензивные препараты [72].
Ozawa I. с сотрудниками [58] предложили и синтезировали в качестве противогрибковых и бактерицидных препаратов для медицины и сельского хозяйства ряд галогенсалициланилидов, причем наличие атомов фтора и йода в положении 5 существенно усиливало эти виды активности. Как известно, наряду с полезными свойствами салицилатов (обезболивающее, противовоспалительное, жаропонижающее и антибактериальное действие) им присущи побочные эффекты, связанные с наличием зон селективного накопления, такие как снижение барьерной функции слизистых оболочек [22]; повышенная кровоточивость как результат ослабления агрегационной способности тромбоцитов; реакции гиперчувствительности [113] и др. Например, растворимый в воде салицилат натрия в концентрации менее 5,0 % не обеспечивает лечебного эффекта, а более 10 % не обеспечивает его растворимость в водорастворимой основе мазей, так как получается перенасыщенный раствор, и мазь быстро кристаллизуется. Но вследствие плохой растворимости в жировых основах салицилат натрия неудобен в применении в качестве антибактериального компонента жиросодержащих форм [93]. Жирорастворимые метилсалицилат и этилсалицилат, проявляющие противовоспалительные свойства, применяются наружно, избегая прямого контакта с поврежденной кожей в связи с их высокой кислотностью [22]. Таким образом, наличие или отсутствие тех или иных побочных эффектов со стороны лекарственного препарата, а также величина его токсичности зависит, в первую очередь, от кислотных свойств и способности вещества проникать через биологические мембраны. Поэтому для синтезируемых новых производных СК, необходимо определить, проанализировать и систематизировать такие универсальные параметры для описания физиологически активных веществ, как кислотность и коэффициент распределения в водно-органических системах. Проанализировав литературные данные можно сделать следующие выводы: 1. Поиск оптимальных условий синтеза сложных эфиров СК и АСК этерификацией алифатическими спиртами и их производными является актуальным. Так как в литературных источниках отсутствуют данные по кинетическим исследованиям синтеза сложных эфиров алкилированием соли СК алкилгалогенидами, что представляется интересным изучить кинетику этой реакции. В литературе не описан" ряд эфиров СК в том числе на основе фосфорсодержащих спиртов. 2. Синтез амидов СК, особенно амидов на основе аминокислот с учетом активности аминокислотного фрагмента, и недостаток информации по этим производным предполагает возможность их синтеза. 3. В литературных источниках отсутствуют сведения о величинах, отражающих липофильность и липофобность производных СК, поэтому представляется интересным определить эти величины. 4. В связи с отсутствием в источниках закономерности «строение-биологическая активность-острая токсичность» в ряду различных производных СК предполагает изучить различные виды биологической активности (жаропонижающую, антибактериальную) и острую, токсичность этих соединений, найти эту закономерность, что позволит осуществить целенаправленный синтез биологически активных веществ на основе СК.
Исследование особенностей синтеза алкильных эфиров салициловой кислоты: этерификация спиртами и алкилирование галогенидами
Классический метод синтеза сложных эфиров карбоновых кислот в присутствии минеральных кислот в качестве катализаторов — этерификация — имеет ряд недостатков, а реакция солей карбоновых кислот с галогеналкилами является простым методом получения эфиров, которая позволяет их избежать. В связи с этим нами изучена кинетика реакции алкилирования СК аллилбромидом.
Pfeffer Р. Е. и Silbert L. S. изучали кинетику алкилирования солей ароматических карбоновых кислот (серебряных и солей щелочных металлов) со стерически заслоненной карбоксильной группой в присутствии аминов в полярном апротонном растворителе (ДМФА, гексаметилфосфорамид (ГМФА), диметилсульфоксид (ДМСО)) [81-83]. Было выяснено, что в случае этерификации таких кислот спиртами в условиях кислотного катализа, выход целевых продуктов напрямую зависит от стабильности карбоксилат аниона. Стерически затрудненный подход молекулы спирта к протонированному кислороду тетраэдрического интермедиата препятствует этерификации [83].
Алкилирование соответствующей соли позволяет обойти эту проблему, что объясняется изолированием катиона металла и десольватацией карбоксилат аниона [83]. Ранее кинетика реакции алкилирования солей ароматических кислот изучалась при соотношении компонентов соль :галогенид= 1:3 в апротонных растворителях (ДМФА, ГМФА, ДМСО) при 60 С. Количественное определение непрореагировавшеи соли проводилось титриметрическим методом. Реакция протекала по SN2 механизму. Активность катиона в реакции алкилирования увеличивается в ряду Li Na К Са. Активности галогена в алкилгалогениде в реакции S j2 следующая: I Вг С1 [81, 82]. Изученная нами реакция алкилирования салицилата калия аллилбромидом протекает согласно схеме: Реакция осуществлялась в интервале температур 15-65 С при большом избытке аллилбромида (соль СК : аллилбромид = 1:60), кинетические зависимости соответствовали реакции псевдопервого порядка. Т.к. калий ион является стандартным катионом в кинетических исследованиях, то в качестве соли был использован салицилат калия, который готовили по .методике, указанной в [7] (без выделения), с последующим термостатированием. Алкилирующий агент - аллилбромид - очищали по стандартной методике [83]. По данным ТСХ единственным продуктом реакции алкилирования является аллилсалицилат.
В литературе [84] описан весовой метод количественного определения соединений, но он дает высокие погрешности и поэтому неприменим для кинетических исследований. В связи с этим, за процессом алкилирования сaледили по количеству образующегося аллилсалицилата. Количественный анализ осуществляли на газовом хроматографе «Цвет-500». Разделение проводили на колонке длиной 1,0 м с неподвижной фазой Chromaton N-super с 3 % OV-225 (0,125-0,160 мм). Газ-носитель - аргон, температура испарителя и детектора 170С (рис. 10).
Ионофоры (в данном случае, салицилат калия) при введении в раствор диссоциируют, причем основную роль в процессе диссоциации играет диэлектрическая проницаемость среды (є). Соединения ионного типа часто диссоциируют и растворяются в полярных апротонных растворителях таких как ДМФА, ДМСО, нитробензол, ацетонитрил, но обычно в меньшей степени, чем в спирте, водно-спиртовых или водно-диоксановых смесях, имеющих близкие к апротонным растворителям значения є. В полярных апротонных растворителях анионы слабее сольватированы, чем катионы. Разная сольватация аниона в различных растворителях существенно влияет на растворимость многих натриевых и калиевых солей. Например, хлористый калий значительно хуже растворим в ДМФА, чем в метаноле, диэлектрические проницаемости, которых близки. Но катионы, обычно сильнее сольватированы в электронодонорных растворителях, обладающих сравнительно высокой основностью (эфиры, кетоны, амиды, сульфоксиды) [82].
Ионоген (аллилбромид) — молекулярное соединение, образующее ионы в растворе в результате специфической сольватации катиона или аниона молекулами растворителя. Диэлектрическая проницаемость в этом процессе имеет несущественное значение, основную роль играет химическая природа растворителя. В апротонных растворителях степень сольватации изменяется в следующем ряду: ОН, F Cl Br N3 I SCN
Независимо от природы сил, вызывающих диссоциацию, между недиссоциированным электролитом и свободными ионами в растворе существует равновесие, включающее в общем случае стадию образования ионной пары из двух противоположно заряженных ионов:
Ионная пара X Y называется контактной ионной парой, в отличие от сольватно-разделенной пары Х+ Y" , которая образуется на следующей стадии диссоциации и непосредственно предшествует образованию свободных ионов. В органических растворителях время жизни ионных пар достаточно велико, так что они успевают проявить себя как кинетически независимые частицы [82]. На схеме приведен один из возможных механизмов реакции взаимодействия салицилата калия с аллилбромидом:
Исследование физиологической активности и острой токсичности производных салициловой кислоты
Известно, что СК используется в производстве АСК и является интермедиантом в синтезе большого количества производных СК в промышленности, необходимо знать растворимость СК и ее производных в различных растворителях при разных температурных условиях. В промышленности наибольший интерес представляют собой такие растворители как вода, этанол, четыреххлористый углерод, этилацетат, ксилол и пр. В биосистемах средой, в которой происходит растворение лекарственного препарата, является вода и/или липиды [94, 116].
Одним из важных путей адсорбции лекарственного препарата является пассивная диффузия через мембраны клеток по градиенту концентрации путем растворения в липидах мембран. Это наиболее значимый механизм, так как для большинства лекарств характерна существенно большая растворимость в липидах, чем в воде. Таким образом, для осуществления всасывания (абсорбции) по этому пути пассивной диффузии лекарство должно быть липофильно, то есть должно быть со слабой степенью ионизации [116]. Другими словами, оно должно быть мало ионизировано, недиссоциировано. Установлено, что если лекарственное вещество при значениях рН, свойственных средам организма, находится главным образом в неионизированном виде (то есть в липофильной форме), оно лучше растворимо в липидах, чем в воде и хорошо проникает через биологические мембраны. И наоборот, если вещество ионизировано, оно плохо проникает через мембраны клеток в различные органы и ткани, но обладает лучшей водорастворимостью. Таким образом, скорость и степень всасывания лекарств, например, в желудке и кишечнике зависят от того, является ли вещество преимущественно водорастворимым (ионизированным, диссоциированным) или жирорастворимым (неионизированным), а это во многом определяется тем, является ли оно (лекарство) слабой кислотой или слабым основанием [96]. Например, ацетилсалициловая кислота (аспирин) представляет собой слабую кислоту (рКа = 3,5 [4]) и попав в кислотное содержимое желудка, ацетилсалициловая кислота будет менее диссоциироваться, а значит очень хорошо всасываться. Для изучения влияния структуры алкильной группы в эфирах СК и АСК на кислотность применялось уравнения Тафта [85]: Тафт показал, что в тех случаях, когда существует прямое пространственное взаимодействие заместителя с реакционным центром, возможно разделение индуктивного и пространственного эффектов. При использовании гидролиза о-замещенных эфиров бензойной кислоты в качества стандарта была выбрана формула (1). Для реакций, катализируемых кислотами, i T — bhs [97]. Считается, что параметр а характеризует чисто индукционное влияние заместителей. В качестве заместителей могут рассматриваться самые разные группы. В нашей работе использовалось приведенное уравнение, т.к. стерическое и резонансное влияния заместителей постоянны для данного набора заместителей [88]. Наряду с а Тафтом предложена альтернативная шкала индукционных констант заместителей, обозначенных а,, связанных с а зависимостью с, = 0,45cr . Величина сг1 для заместителя X определяется уравнением: где к0 - константа кислотности уксусной кислоты, к - константа кислотности кислоты с заместителем X. Однако есть свидетельства, что константы о"/, полученные из алифатических соединений, могут использоваться для корреляции со свойствами производных бензойных кислот [85].
Кроме констант кислотности, универсальными параметрами для описания токсикокинетики и токсикодинамики физиологически активных веществ являются коэффициенты их распределения в различных водно-органических системах (logP логарифм коэффициента распределения в системе «октанол — вода», характеризует различную растворимость вещества в двух несмешивающихся растворителях) [98]. С точки зрения фармакокинетики коэффициент распределения влияет на адсорбцию, распределение, метаболизм и выделение лекарственного препарата. Так как гидрофобность соединения определяет адсорбцию per oz лекарственный препарат при приеме внутрь должен, во-первых, проникнуть через липидный бислой кишечного эпителия. Эффективный транспорт препарата будет обеспечиваться «достаточной» гидрофобностью, чтобы проникнуть через липидный слой, но не слишком высокой, чтобы удержаться внутри клетки. Таким образом, гидрофобный эффект - основная движущая сила для связывания препарата с рецепторами активного центра. С другой стороны, гидрофобные вещества обычно более токсичны, т.к. удерживаются в организме дольше и часто менее селективны при связывании с рецепторами [98, 99]. Липофильность эфиров выражали в виде logP (где Р представляет собой коэффициент распределения определенного эфира между водой и н-октанолом). Молекулярные значения logP рассчитаны с помощью программы ACDLab v. 11.
Синтез производных салициловой кислоты
Под воздействием веществ XII и VIII температура тела через 2 ч после их введения не достоверно снижалась на 0,8 и 0,87 С, соответственно, что составляло 2,04 и 2,18 % относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии и по эффективности превосходило АСК. При наблюдении в течение 5 ч температура тела оставалась достоверно сниженной. Так, под воздействием вещества XII через 3 ч температура достоверно снижалась на 1,85 С (4,72 %), через 4 ч - на 1,73С (4,43 %), через 5 ч - на 1,53 С (3,91 %). То есть под влиянием вещества XII температура снижалась медленнее, но гипотермический эффект достоверен в течение 5 ч. Под воздействием вещества VIII через 3 ч температура достоверно снижалась на 0,97 С (2,43 %), через 4 ч - на 0,87 С (2,18 %). Эффективность гипотермического эффекта вещества VIII близка к эффективность гипотермического эффекта АСК. При анализе новых синтезированных фосфорсодержащих производных СК выявлена следующая закономерность:
Влияние АСК и фосфорсодержащих производных СК на температуру тела крыс на модели гипертермии. Вещества IX, XI и XVII являются фосфорсодержащими эфирами. Под воздействием вещества IX температура тела через 2 ч после введения снижалась на 1,47 С, что составляло 3,72 % относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии и по эффективности превосходило АСК. При последующем наблюдении за животными в течение 5 ч, температура под воздействием IX постепенно восстанавливалась, но разница по температуре (в момент введения вещества и при наблюдении в течение 5 ч) была выше, чем у АСК. Так через 3 ч температура оставалась сниженной на 1,27 С , через 4 ч- на 1,03 С, а через 5 ч - на 0,93 С (что по эффективности равно, соответственно, 3,21; 2,62 и 2,37 относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии).
Под воздействием вещества XI температура тела через 2 ч после введения достоверно снижалась на 1,03 С, что составляло 2,69 % относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии и по эффективности немного превышало эффективность АСК. При последующем наблюдении за животными отмечали, что температура тела постепенно восстанавливалась. Так через 3 ч температура достоверно оставалась сниженной на 0,9 С , а через 4 ч - на 0,83 С, что по эффективности равно, соответственно, 2,34 и 2,17 % относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии. Через 5 ч температура тела восстановилась, практически, до исходной. Под воздействием вещества XVII температура тела через 2 ч после введения снижалась на 0,5 С, что составляло 1,27 % относительно температуры тела животных на фоне развившейся гипертермии и по эффективности не превосходило АСК. При дальнейшем наблюдении соединение XVII жаропонижающей активности не проявляло, наоборот, проявлялся гипертермический эффект. У веществ XVII жаропонижающая активность была ниже, чем у препарата сравнения АСК, XXI вообще не проявляло жаропонижающей активности.
Таким образом, среди всех исследованных соединений можно выделить ряд производных, отличающихся повышенной жаропонижающей активностью, по сравнению с АСК [91, 92]:
Изучение чувствительности Е. coli и золотистого стафилококка к растворам производных салициловой кислоты По результатам исследования чувствительности золотистого стафилококка к 2 % спиртовому раствору СК и её производным методом стандартных дисков определено, что данные препараты обладают низким бактериостатическим эффектом, однако все изученные соединения проявляли большую или сопоставимую активность, по сравнению с СК. Анализируя данные, приведенные в рисунке 21 видно, что производное СК под шифром III и XXI обладают наиболее выраженным действием на микроорганизмы (максимальная зона задержки роста - 25 и 27 мм, соответственно).
