Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 6
2.1. Синтез водорастворимых соединений на основе фуллеренов 6
2.1.1 Классификация водорастворимых производных фуллеренов 6
2.1.2 «Условно водорастворимые» производные фуллеренов 7
2.1.3 «Истинно водорастворимые» производные фуллеренов 14
2.2. Биологическая активность производных фуллеренов 24
2.2.1 Токсичность производных фуллерена, выведение их из организма. 24
2.2.2 Взаимодействие производных фуллеренов с ферментами ВИЧ. 26
2.2.3 Перспективы создания противораковых препаратов на основе фуллеренов 32
2.2.4 Производные фуллерена как антиоксиданты и нейропротекторы 37
2.2.5. Антибиотики и фунгициды на основе производных фуллеренов 39
2.2.6. Контрастные агенты для рентгеновской- и ЯМР-томографии на основе производных фуллеренов 42
2.3 Заключение 43
3. Экспериментальная часть 45
3.1. Инструментальные методы 45
3.1.1. Спектроскопия ЯМР 45
3.1.2. Электронная спектроскопия и масс-спектрометрия 45
3.1.3. Реагенты, растворители и материалы 45
3.2. Методики синтезов и спектральные данные продуктов 46
3.2.1. Общая методика проведения реакций С бо с аминами la-f. 46
3.2.2. Получение аминофуллеренов 9 и 10 47
3.2.3. Общая методика получения 5а, 5с и солей аминофуллеренов 9 и 10 48
3.2.4. Общая методика получения аминофуллеренов 1 lc-d 48
3.2.5. Общая методика получения диаминофутеренов За, Зс, 3d, 3f в реакции С6оС1б с N-замещенными пиперазинами 49
3.2.6. Взаимопревращение 1,4-диаминофуллеренов 50
3.2.7. Взаимопревращение 1,4-диаминофуллеренов без доступа воздуха и света 50
3.2.8. Методика получения соединений 14а,Ь : 51
3.2.9. Методика получения соединений 15а-Ъ 52
3.3. Исследования противовирусной активности 52
4. Результаты и обсуждение: 54
4.1 Фотохимическое радикальное присоединение вторичных аминов к фуллерену Сбо—54
4.1.1. Реакция См сN-метилпиперазином иморфолином 55
4.1.2. Реакция С во с пиперазинами 1 c-f. 59
4.1.3. Механизм реакции Сво со вторичными аминами 63
4.1.4. Превращение тетрааминофуллеренов CeofctMunJ^O в водорастворимые соли 67
4.1.5. Превращение пирролидино-и метанофуллеренов А=Сбо в тетрааминофуллерены А=Сбо[амин]40 69
4.2. Реакция фотохимического радикального присоединения вторичных аминов к фуллерену С70 70
4.2.1.Механизм фотохимической реакции CJO со вторичными аминами 77
4.3. Реакции галогенфуллеренов СбоСІб, СбоСЫ, СбоСЬо, Cecfoe со вторичными аминами79
4.3.1. Реакция хлорфуллерена СбоСІб с N-замещенными пиперазинами 79
4.3.2. Реакции высших галогенфуллеренов с N-замещенными пиперазинами 85
4.4. Реакция взаимопревращения 1,4-диаминофуллеренов 86
4.5. Получение поликарбоксильных производных из СбоСІб 89
4.5.1. Синтез соединений 14а-Ь 89
4.5.2 Гидролиз эфирных групп в 14а-Ь и выделение поликарбоновых кислот 15а-Ъ 93
4.5.3. Растворимость поликарбоновых кислот 15а-Ъ и их солей в воде 96
4.6 Свойства водных растворов солей аминофуллеренов и поликарбоксильных соединений 97
4.7 Противовирусная активность полученных соединений фуллерена 99
4.7.1. Противовирусная активность поликарбоксильных производных фуллерена Сво 99
4.7.2. Противовирусная активность аминопроизводных фуллерена Со 102
5. Выводы 104
6. Литература 105
- «Истинно водорастворимые» производные фуллеренов
- Взаимопревращение 1,4-диаминофуллеренов без доступа воздуха и света
- Реакция фотохимического радикального присоединения вторичных аминов к фуллерену С70
- Свойства водных растворов солей аминофуллеренов и поликарбоксильных соединений
Введение к работе
Интенсивное изучение свойств фуллеренов их производных в течение последнего десятилетия позволило найти многие области их возможного практического использования. Одним из наиболее интересных направлений является исследование биологической активности производных фуллеренов [1].
Фуллерен Сбо и многие его производные обладают необычными фотофизическими свойствами. Например, поглощение света в ультрафиолетовой и в видимой областях приводит к образованию долгоживущего возбужденного триплетного состояния. При переносе энергии с возбужденной молекулы фуллерена на молекулу кислорода образуется высоко реакционноспособная частица - синглетный кислород. Квантовый выход фотосенсибилизированной генерации синглетного кислорода с участием фуллерена достигает 96-99%. Это свойство фуллеренов потенциально может быть использовано для фотодинамической терапии раковых опухолей. Обнаружено также, что некоторые соединения фуллеренов действуют на раковые клетки непосредственно, без участия кислорода, и могут выступать в качестве химиотерапевтических препаратов[2-4].
Размер и форма углеродного каркаса в молекулах С6о и С70 достаточно точно совпадает с размером и формой активного центра ряда ферментов. Поэтому некоторые соединения фуллеренов аллостерически ингибируют ферменты ВИЧ (ВИЧ-протеазу и обратную транскриптазу), что делает их перспективными для создания медицинских препаратов для борьбы со СПИДом [5-7].
Высокая способность фуллеренов улавливать свободные радикалы (эффект «радикальной губки») может быть использована при создании антиоксидантов нейрозащитного действия. Соединения фуллерена, введенные в организм животных, значительно повышают их устойчивость к оксидативным стрессам и препятствуют протеканию нейродегеративных процессов. Возможно, систематический прием таких препаратов поможет снизить риск возникновения заболеваний человека, связанных с высоким уровнем свободных радикалов в организме (например, болезнь Паркинсона и синдром Альцгеймера) [8].
Водорастворимые производные фуллеренов, обогащенные йодом или содержащие атомы металлов внутри углеродного каркаса, исследуются в качестве контрастных агентов в рентгеновской и магнитно-резонансной томографии [9-Ю].
Выявлена бактериостатическая, и даже бактерицидная активность некоторых водорастворимых производных фуллеренов; это в перспективе может дать начало антибиотикам, предназначенным для борьбы со специфическими группами микроорганизмов [3,11].
Приведенные примеры указывают на большой потенциал развития медицинской химии фуллеренов. Основной проблемой сегодня является малая доступность высоко растворимых в воде (более 1 мг в 1 мл) соединений фуллеренов с однозначно установленным составом и строением.
Целью данной работы стала разработка эффективных методов синтеза различных типов высоко водорастворимых соединений фуллеренов в макроколичествах, исследование физико-химических свойств и противовирусного действия полученных соединений.
«Истинно водорастворимые» производные фуллеренов
Полученное производное (Рисунок За) растворяется в смеси ДМСО-вода (10% ДМСО), но не растворяется в чистой воде. Конъюгат фуллерена с паклитакселом устойчив в твердом виде, апротонных органических растворителях и в водной среде, однако в коровьей плазме при 37 С разлагается с выделением паклитаксела. Известно, что цитотоксичность паклитаксела зависит больше от времени экспозиции, чем от концентрации. Период полураспада конъюгата в результате гидролиза составляет около 80 мин. Время полураспада самого паклитаксела составляет лишь 20 минут. Конъюгат на долгое время задерживается в легких, в отличие от самого паклитаксела, что в совокупности с его периодом полураспада приводит к существенному увеличению времени экспозиции раковых клеток. Это может позволить использовать конъюгат in vivo в качестве эффективного препарата для лечения рака легких.
Благодаря наличию 30 двойных связей в молекуле, фуллерен способен присоединять свободные радикалы, которые постоянно образуются в живых системах. За это свойство фуллерену было дано название - «радикальная губка» [95]. Способность присоединять радикалы тесно связана с характером я-системы фуллереновой молекулы. При присоединении солюбилизирующих групп к фуллерену часть двойных связей раскрывается. Электронное строение полученных соединений отличается от строения молекулы Сбо, потому они являются менее активными. Следовательно, чем меньше раскрыто двойных связей, тем выше способность фуллерена улавливать свободные радикалы. Это утверждение оспаривается в некоторых работах, где указывается на повышенную реакционную способность соединений фуллерена по отношению к свободным радикалам в сравнении с немодифицированным Сбо [96].
Ряд производных фуллерена (Схема 8) обладают способностью улавливать свободные радикалы, например, гидроксильный радикал (НО) и супероксид анион (Of )-Это свойство производных фуллерена доказано с использованием ЭПР спектроскопии [8, 97] и детально изучено методом флеш-фотолиза с пикосекундным разрешением во времени [98]. Показано, что эффективность взаимодействия производных фуллерена со свободными радикалами сильно снижается с увеличением числа групп (раскрытых двойных С=С связей в Сбо), присоединенных к фуллереновому каркасу.
Исследовано взаимодействие гидроксильных радикалов с соединениями фуллерена, содержащими 1-4 фрагмента малоновой кислоты на углеродном каркасе. Радикалы генерировались по реакции Фентона. Показано, что моноаддукт поглощает около 40% радикалов при концентрации 2-Ю"4 моль/л, тогда как тетрааддукт вообще не присоединяет радикалы даже при концентрации 8-Ю"4 моль/л [99].
Свободные радикалы в живых клетках выполняют важные функции, связанные с апоптическим и некротическим разрушением тканей. Повышение уровня свободных радикалов приводит к особенно сильным повреждениям нервных тканей и волокон, в частности, центральной нервной системы. Такие нейродегеративные процессы сопровождают возникновение болезней Альцгеймера и Паркинсона [100].
Производные фуллерена, представленные на Схема 8, обладают нейрозащитными свойствами. Наиболее детально исследованы in vivo и in vitro два изомера карбоксифуллеренов и показано, что они сокращают более чем на 80% гибель кортикальных нейронов, подвергшихся воздействию N-метил-О-аспартата или сс-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты [8]. При этом эффективность действия Бз-изомера уступает активности Сз-карбоксифуллерена. По-видимому, это связано с тем, что Сз-изомер соединения лучше взаимодействует с клеточными мембранами, чем его Эз-аналог.
Карбоксифуллерены в значительной степени подавляют нейрональный апоптоз, происходящий в нервной ткани, лишенной нейроглии, или же случающийся при действии амилоидного пептида АРмг, отвечающего за возникновение болезни Альцгеймера [8]. Введение мышам карбоксифуллеренов внутримышечно в течение 2 месяцев приводило к значительному улучшению их состояния, более позднему проявлению симптомов болезни Альцгеймера, и увеличению времени их жизни [8].
Подавление апоптоза также продемонстрировано на культурах клеток печени человека [101]. В этом случае наблюдаемый эффект объяснили ингибированием карбоксифуллереном белка TGF-P, индуцирующего процесс апоптоза.
Карбоксифуллерены существенно снижают вероятность возникновения инфаркта коры головного мозга крыс после кратковременной ишемической реперфузии. Эффект наблюдается только при интрацеребровентикулярном введении карбоксифуллеренов в дозе 0.1-0.3 мг на крысу; внутривенное введение препаратов не дает никакого результата. Предполагается, что антиоксидантное действие карбоксифуллеренов гасит последствия, вызываемые кратковременной ишемической реперфузией. Карбоксифуллерены предотвращают такие процессы, сопровождающие инфаркт, как повышенное липидное окисление и снижение содержания глутатиона [102]. Другие водорастворимые производные фуллерена (FC4S, Схема 8) также уменьшают повреждения, вызываемые инфарктом в коре головного мозга крыс [103].
Несмотря на низкую способность улавливать свободные радикалы, фуллеренолы (Схема 8d) тоже обладают ярко выраженными нейрозащитными свойствами. В этом случае защитный эффект связан с ингибированием глутаматных рецепторов, расположенных в мембранах нервных клеток. Глутаминовая кислота, связываясь с этими рецепторами, приводит к повышению внутриклеточного содержания ионов кальция, что впоследствии приводит к разрушению нервной клетки. Конкурентное ингибирование глутаматных рецепторов фуллеренолами способствует их выживаемости в среде, содержащей глутаминовую кислоту [80].
В качестве ловушек радикалов интерес представляют аддукты фуллеренов с фенолами (Схема 9), которые сочетают в себе антиоксидантные свойства как фуллеренового каркаса, так и фенольного остатка [104]. Показано, что соединение обладает также мутагенной активностью в штаммах Salmonella Typhimurium [105].
Взаимопревращение 1,4-диаминофуллеренов без доступа воздуха и света
Гексахлорфуллерен (200 мг, 0,278 ммоль) растворяли в 100 мл сухого толуола (толуол перегоняли над металлическим натрием) при 80 С в течение 3 часов. Затем тщательно высушенный карбонат калия (5-Ю г) прибавляли к горячему раствору хлорфуллерена и затем по каплям прибавляли амин la-f (2 ммоль), растворенный в 40 мл толуола. Полученную смесь перемешивали 20 ч при 80 С, охлаждали до комнатной температуры. Карбонат калия и другие нерастворимые продукты отфильтровывали, фильтрат упаривали на роторном испарителе. Полученный коричневый остаток промывали гексаном и сушили на воздухе.
Для выделения Зс, 3d, 3f, неочищенный продукт растворяли в толуоле (концентрация 0.3 мг в 1 мл), затем в этот раствор прибавляли гексан в количестве, равном объему толуола. Полученный раствор фильтровали и наносили на колонку с силикагелем (Acros Organics, 30-75ц, 90 А). Небольшое количество фуллерена Сбо (менее 1 -2 мг), образующегося из СбоСІб в результате элиминирования атомов хлора с каркаса, вымывали из колонки в ходе нанесения продуктов. Последующее элюирование смесью толуол-метанол (толуол/МеОН 99.2:0.8) приводило к четким фракциям диаминофуллеренов Зс, 3d, 3f. Увеличение содержания метанола в смеси растворителей (толуол/МеОН 98 : 2 - 97 : 3) позволяет выделить фракции полиаминофуллеренов 12c-f. Растворы Зс, 3d, 3f сконцентрировали на роторном испарителе до объема 10-15 мл; затем прибавляли гексан (40-50 мл). Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием и высушили на воздухе. Выход соединений Зс, 3d, 3f составил 5-20%. Спектральные характеристики диаминофуллеренов Зс, 3d, приведены выше. Соединение 3f 1Н ЯМ? (400 МГц, CDC13): 5= 1.55 (18Н; с), 3.60-3.90 (16Н; ушир, м,) мд. 13С ЯМ? (150 МГц, CS2-C6Di2 10:1): 8= 28.3, 30.1, 49.9, 73.4, 78.6, 138.2, 139.7, 140.4, 141.1, 142.1, 142.2, 142.5, 142.9, 143.0, 143.0, 143.1, 143.2, 143.4, 143.4, 143.6, 144.0, 144.1, 144.1, 144.3, 145.3, 145.6, 146.1, 146.5, 146.6, 146.7, 146.9, 147.0, 147.2, 148.6, 149.5, 150.7, 153.1 мд. Элементный анализ (%): С, 85.74; Н, 3.16; N; 5.07. Рассчитано для C78H34N4O4: С, 85.86; Н, 3.14; N, 5.13. ИК-спектр (KBr): отах=528, 1001, 1126, 1167, 1251, 1286, 1365, 1421,1458,1698,1743,2851,2921 см-1.
Соединение 12а: ИК-спектр (KBr): umax= 525, 732, 773, 943, 980, 1007, 1097, 1126, 1160, 1246, 1280, 1313, 1437, 1482, 1594, 2851, 2925 см"1; ]Н ЯМ? (400 МГц, CDCI3): 5= 2.88-3.96 (широкий м, 16Н), 6.50-6.70 (широкий м, 4Н), 7.36-7.53 (ушир, м, 2Н), 8.09-8.33 (ушир, м, 2Н) мд.
Соединение Зс (50 мг, 0.048 ммоль) растворяли в 50 мл 1,2-дихлорбензола и затем прибавляли 100 мг (0.610 ммоль) Id или 120 мг (0.645 ммоль) If. Полученную смесь облучали на воздухе лампой накаливания (60 Вт) течение 5 ч (Id) и 20 ч (Id).
После облучения реакционную смесь разбавляли трехкратным количеством толуола (по объему) и таким же количеством н-гексана. Полученный раствор фильтровали и наносили на колонку с силикагелем (Acros Organics, 30-75 ц, 90 А), предварительно промытую смесью толуола с гексаном в соотношении 1:1 по объему. Соединения 3d и 3f элюировались смесью толуола с метанолом в соотношении 99:1; их выход составил 50% и 30 %, соответственно. Дальнейшее увеличение полярности элюента (от 99:1 к 90:10 толуол : метанол) не давало в результате каких-либо индивидуальных фракций, но вещество постепенно смывалось с колонки. Данные спектроскопии ЯМР показали, что элюирующийся таким образом материал является сложной смесью соединений.
Исходный диаминофуллерен (Зс, 3d, 3f) обрабатывали 6-8 эквивалентами другого амина при перемешивании в аргоновой атмосфере в темноте в течение 4-5 часов при комнатной температуре. Разделение продуктов реакции проводили так, как описано выше. Спектральные характеристики соединений Зс, 3d, 3f соответствуют приведенным выше.
Хлорфуллерен СбоСЦ (200 мг, 0.214 ммоль) растворяли при перемешивании при 100 С в 100 мл тщательно высушенного нитробензола в течение 2 ч в атмосфере аргона. К горячему раствору СбоСІб прибавляли 8 мл эфира 13а-Ь и несколько кристаллов безводного FeCb. Полученную смесь перемешивали при 100 С в течение 1 ч, охлаждали до комнатной температуры и прибавляли 10 мл CF3COOH. Затем реакционную смесь разбавляли 100 мл CCU. Полученный раствор промывали три раза 150-200 мл воды, сушили над безводным Na2SC«4 (или MgS04), фильтровали и наносили на колонку с силикагелем (40-100ц, 60 А). Со смесью метанол-толуол 0.5:99.5 (по объему) элюировалась первая фракция, представленная в основном СбоАг4. Соединения 14а-Ь элюировались смесью метанол-толуол 0.8-99.2 (по объему) как ярко-оранжевые нечеткие фракции. Выходы: 14а: 193 мг, 60%; 14Ь: 200 мг, 50%.
Соединение 14а Н ЯМР (600 МГц, CS2-(CD3)2CO 10:1): 8 = 3.40-3.80 (СЯ2, 0-СЯ3, м, 25Н), 6.98 (д, 2Н), 7.11 (д, 2Н), 7.17 (д, 4Н), 7.25 (д, 4Н), 7.53 (д, 4Н), 7.83 (д, 4Н) мд. 13С ЯМР (150 МГц, CS2-(CD3)2CO 10:1): 5 = 40.58(СН2), 40.65(СН2), 40.71(СН2), 51.47(ОСН3), 51.57(ОСН3), 51.69(ОСНз), 57.86(каркас), 60.52(каркас), бЗЛб(каркас), 76.26(каркас), 127.02(Аг), 127.25(Аг), 127.81(Аг), 128.77(Аг), 128.84(Аг), 128.96(Аг), 129.95(Аг), 129.99(Аг), 130.06, 130.29, 133.47, 134.12, 134.16, 135.79, 137.28, 142.06, 143.10, 143.43, 143.52, 143.73, 143.76, 144.05, 144.39, 144.48, 144.55, 144.75, 145.29, 145.40, 146.70, 147.32, 147.46, 147.94, 148.23, 148.36, 148.56, 148.76, 148.81, 148.86, 150.40, 151.07, 153.54,156.72,169.8 4(С=0), 170.05(С=О), 170.10(С=О) мд.
Соединение 14Ь Н ЯМР (600 МГц, CS2-(CD3)2CO 10:1): 5 = 3.02 (СЯ2, д, 2Н), 3.16 (СЯ2, д, 8Н), 3.50-3.70 (СЯ, 0-СЯ3, м, 35Н), 6.91 (д, 2Н), 7.03 (д, 2Н), 7.11 (д, 4Н), 7.16 (д, 4Н), 7.44 (д, 4Н), 7.75 (д, 4Н) мд. 13С ЯМР (150 МГц, CS2-(CD3)2CO 10:1): 6 = 34.37(СН2), 34.47(СН2), 34.56(СН2), 51.90(ОСН3), 52.01(ОСН3), 52.06(ОСН3), 52.97(СЯ), 53.26(СЯ), 57.84(каркас), 60.47(каркас), 63.07(каркас), 76.47(каркас), 128.48(Аг), 128.73(Аг), 128.87(Аг), 129.47(Аг), 130.26(Аг), 135.41, 136.92, 137.47, 137.91, 138.02, 141.76, 143.08, 143.40, 143.58, 143.67, 143.78, 144.07, 144.37, 144.45, 144.50, 144.72, 145.26, 145.42, 146.71, 147.30, 147.44, 147.91, 148.22, 148.34, 148.54, 148.73, 148.72, 148.74, 148.78, 148.83,150.32,151.10,153.43,156.62,167.92(С=0), 167.95(С=0)мд.
Реакция фотохимического радикального присоединения вторичных аминов к фуллерену С70
Поскольку реакция ld-f с фуллереном Сбо приводит к образованию тетрааминофуллеренов Сбо[МІ2]40 (2d-f), мы, исходя из Зс, ожидали получение смешанных тетрааминофуллеренов (с различными аминными группами на фуллереновом каркасе),. Реакции проводили в обычных условиях - длительное облучение на воздухе растворов в 1,2-дихлорбензоле Зс и соответствующего пиперазина (Id или If). Хроматографическим разделением продуктов реакции выделили 3d и 3f, соответственно.
Состав и строение 3d и 3f было подтверждено спектрами ЯМР, которые оказались полностью идентичны спектрам тех же диаминофуллеренов, полученных из Сбо или из СбоСІб.
Чтобы объяснить столь легкое замещение М-(2-пиридил)пиперазиниловых групп аминами ld-f, мы исследовали обратную реакцию. Для этой цели 3d обработали избытком М-(2-пиридил)пиперазина в типичных условиях фотохимической реакции. Исследование неочищенного продукта с помощью спектроскопии ЛМР показало, что все (2-пиримидинил)пиперазиновые группы вытеснены с каркаса фуллерена. Но, вместе с небольшим количеством диаминофуллерена Зс, образовалась смесь изомерных тетра- и даже гексааминофуллеренов. Такой же состав продуктов получается и в контрольном эксперименте при облучении Зс с Ы-(2-пиридил)пиперазином. Превращение 3d в 3f и наоборот происходит гладко и не дает большого количества побочных продуктов полиприсоединения. Таким образом, мы впервые установили, что аминные группы на фуллереновом каркасе могут замещаться другими аминами при облучении видимым светом (Схема 26) и эта реакция обратима.
Дальнейшие исследования показали, что взаимное превращение 1,4-диаминофуллеренов протекает также эффективно при комнатной температуре даже в отсутствии света и воздуха. Поэтому участие свободных радикалов в этой реакции должно исключаться.
Замещение третичных аминных групп сильными нуклеофилами хорошо известно для алифатических субстратов. Согласно известному механизму, оно начинается с протонирования атома азота с последующим элиминированием R2NH и образованием соответствующего карбокатиона [147]. Присоединение R2NH к этому карбокатиону и последующее элиминирование протона может приводить к формальному замещению R2N группы на R 2N на фуллереновом каркасе (Схема 27).
Если наблюдаемое взаимопревращение 1,4-диаминофуллеренов действительно подчиняется такому механизму, все другие известные типы аминированных фуллеренов, в частности, соединения 11с и 2с (Рисунок 20) также должны быть реакционно-способными в данных условиях. Однако мы не наблюдали замещения аминогрупп в 11с и 2с даже в условиях облучения на воздухе. Вероятно, легкое замещение аминных групп связано со специфичностью молекулярной структуры 1,4-диаминофуллеренов. Мы полагаем, что первая стадия реакции - присоединение R2NH к 1,4- C6o[NR.2b -приводит к «аллильному» интермедиату А [148]. Образование подобного интермедиата из 11 с невозможно из-за присутствия двух аминных групп у соседних атомов углерода фуллеренового каркаса молекулы (мотив 1,2—присоединения). Тетрааминофуллерен 2с уже имеет в молекулярной структуре стабилизированную циклопентадиенильную часть (четыре аминных остатка и эпоксидный кислород, присоединенные вокруг одного пятичленного цикла), что делает это соединение слишком инертным к дальнейшему взаимодействию [128]. Последующий перенос водорода приводит к превращению А в В, а дальнейшее элиминирование R2NH завершает замещение одной аминной группы на другую (Схема 28).
Таким образом, мы нашли новую реакцию исключительно легкого замещения аминных групп в карбоциюшческих системах. Структура 1,4-диаминофуллерена делает возможным образование сравнительно стабильного цвиттер-ионного интермедиата «аллильного» типа, что обеспечивает замещение аминных групп на поверхности фуллерена. Можно ожидать, что реакция !,4 диаминофуллеренов с более широким кругом нуклсофилов найдет разнообразное применение.
Наибольшее число биологических исследований выполнено с фуллерен-содержашими карбоновыми кислотами, а именно с двумя производными, содержащими остатки малоновой кислоты Сбо[С(СООН)зЬ (изомеры С; и D3) и дендро[60]фуллереном с 18 карбоксильными группами. Однако синтез этих соединений идет в несколько стадий с относительно низкими общими выходами (10-20%), что ограничивает их применение.
Мы разработали простой способ, позволяющий с высокими выходами получать водорастворимые фуллерсн-содержащие поликарбоновые кислоты из хлорфуллерена СбоСІб- Для этой цели модифицировали описанную ранее реакцию арилирования C№CU по Фриделю-Крафтсу [146], в качестве реагентов при этом использовали метиловые эфиры фенилуксусной и бензилмалоновой кислот (Схема 29).
Все описанные ранее реакции арилирования С СІс по Фриделю-Крафтсу были выполнены с жидкими ароматическими соединениями, такими как бензол, толуол, фторбензол, анизол, трет-бутилбензол, тиофен и фенилтриметилсилан. Во всех этих случаях в качестве растворителя использовали избыток реагента [149]. Метиловые эфиры фенилуксусной и бензилмалоновой кислот оказались более инертными по отношению к СбоСІб чем ранее использовавшиеся соединения [146, 149]. Реакции без растворителя, катализируемые FeCb, протекают только при повышенных температурах (выше 50-60 С). Синтезы требуют очень большого избытка реагента 13а-Ь ( 10 г на 100 мг СбоСІб) и не дают высоких выходов ожидаемых соединений CeoArsCI из-за образования продуктов элиминирования - СбоАг4 и СбоАгг.
Для повышения селективности реакций и сокращения количества расходуемых реагентов, мы исследовали возможность проведения реакции в различных растворителях. Однако хлорбензол и 1,2-дихлорбензол неприменимы в качестве растворителей, т. к. они тоже вступают в реакцию с СбоСІб, конкурируя с 13а. Разделение полученной смеси продуктов методом колоночной хроматографии дает многочисленные плохо-разрешенные фракции, представляющие соединения СбоАгх(Аг )5-хС1, что установлено с помощью MALDITOF масс-спектрометрии.
Свойства водных растворов солей аминофуллеренов и поликарбоксильных соединений
Водные растворы соединений стабильны в течение длительного времени (1 месяц). Исключение составляют соли N-метилпиперазиновых аддуктов, которые в растворе подвергаются медленному гидролизу с образованием аморфных осадков гидроксилированных продуктов. Важным свойством соединений фуллеренов является их агрегация в водных растворах в нанокластеры из-за гидрофобного взаимодействия фуллереновых сфер. Как правило, малорастворимые соединения фуллеренов агрегированы нацело, их кластеры нестабильны в растворах и постепенно осаждаются. Мощная агрегация соединений фуллеренов препятствует их прохождению через биологические мембраны и сильно снижает их активность (выделение синглетного кислорода, ингибирование ферментов ВИЧ, способность поглощать свободные радикалы). Сольватация препятствует ассоциации молекул соединения фуллерена в нанокластеры, а повышение концентрации раствора приводит к увеличению степени агрегации.
Об образовании нанокластеров из соединений фуллеренов в полярных растворителях свидетельствует уширение спектров поглощения и значительный батохромный сдвиг полос (на 50-200 нм) [27]. На Рисунок 25 сопоставлены спектры поглощения водных растворов солей 5с и 18а со спектрами тетрааминофуллерена 2с и эфира 14а в толуоле, соответственно.
Соединения 2с и 14а имеют одинаковые сопряженные тг-системы потому их спектры очень похожи. Присутствуют четкие максимумы при 383, 431 и 462 нм. В спектрах 5с и 18а максимумы сглаживаются, однако существенного батохромного сдвига не наблюдается. Подобное изменение спектров свидетельствует о некоторой агрегации в водных растворах, но образования больших кластеров не происходит. Этим полученные в данной работе соединения существенно отличаются от большей части описанных в литературе водорастворимых производных фуллеренов. Агрегация в случае 5с и 18а может быть связана с тем, что гидрофильные группы располагаются лишь на небольшом участке фуллеренового каркаса, тогда как большая часть гидрофобной сферы СЙО остается свободной.
Особенность молекулярных структур 15а и 15Ы-3 заключается в том, что в этих молекулах все органические адденды, располагаясь вокруг одного пятичленного кольца, занимают лишь небольшую часть фуллеренового каркаса (Рисунок 26). Большая часть фуллеренового каркаса свободна и доступна для взаимодействия с биологическими мишенями. Поэтому соединения 15а и 15Ы-3 являются хорошими моделями для исследования биологической активности фуллеренов.
Проведено предварительное тестирование калиевых солей 18а и 18Ь на культурах клеток лимфоцитов (СЕМ) против штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [154]. Тесты основаны на подавлении цитопатологий (образование гигантских клеток), вызываемых вирусами, на 4-5 день после введения тестируемых соединений. Цитостатическая активность соединений (подавление размножения клеток) изучена на тех же культурах на 3 или 4 день после инкубации с тестируемыми соединениями. Результаты приведены в таблице 14, где для сравнения приведены также недавно описанные в литературе данные по анти-ВИЧ активности изомерных биспирролидинофуллеренов 19 и 20, относящихся к наиболее сильным ингибиторам ВИЧ на основе фуллеренов [6]. Как видно из таблицы 14, соединения 18а и 18Ь обладают ярко выраженной активностью против обоих штаммов вируса ВИЧ. В соответствии с общепринятым механизмом, анти-ВИЧ активность соединений фуллеренов объясняется тем, что углеродная сфера Ceo соответствует по форме и размеру активному центру некоторых ферментов ВИЧ (например, ВИЧ-протеазе) [7,32,33,78]. Фуллерен и некоторые его производные аллостерически ингибируют активный центр фермента, «затыкая» его гидрофобную полость. Объемные органические адденды, присоединенные к фуллереновому каркасу могут подавлять взаимодействие соединений фуллерена с энзимами ВИЧ. Обнаружено, что 18Ь примерно в два раза менее активно, чем 18а. Возможно, это связано именно с тем, что18Ь имеет более объемные органические адденды, чем 18а.
Абсолютные значения IC50 для 18а в 3-6 раз выше, чем для 19 и 20. Однако 18а в 6-20 раз менее цитотоксичен, чем 19 и 20. Поэтому соотношение СС50ЯС50 составляет 52 для 18а (ВИЧ-1), тогда как для соединений 19 и 20 эти значения составляют лишь 14 и 26, соответственно. Таким образом, 18а можно рассматривать как более перспективный анти-ВИЧ препарат на основе фуллерена.
Особо следует отметить, что синтез 18а прост, выход продукта в несколько раз вьппе, чем в синтезах 19 и 20, и при этом для выделения соединений не требуется использование трудоемкой процедуры ВЭЖХ. Растворимость 18а в воде примерно в 100 раз вьппе растворимости 19 и 20, что является очень важным условием для внутривенного введения в организм этого соединения. Исследование действия 18а против других вирусов продолжается в настоящее время. Уже обнаружено, что 18а практически не активен против многих других вирусов, отличных от ВИЧ, включая вирусы простого герпеса (тип 1 (KOS) и тип 2 HSV-2 (G)), вирус коровьей оспы, вирус везикулярного стоматита, коксаки-вирус В4, респираторный синцитальный вирус, вирус парагриппозной инфекции-3, реовирус-1, синдбис вирус и вирус Пунта Торо. В то же время, 18а может быть хорошим стартовым соединением для дальнейшего дизайна поликарбоксильных соединений фуллеренов, более активных по отношению к инфекции ВИЧ.
