Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Численное моделирование процесса оптического захвата биологического микрообъекта 22
1.1. Основные сведения о моделируемых микрообъектах 22
1.2. Метод расчета 23
1.3. Моделирование движения частицы в оптической ловушке 34
1.4. Учет теплового воздействия на микрообъект 37
1.5. Выводы 38
Глава 2. Пучки с распределением интенсивности в виде полумесяца 40
2.1. Теоретическое исследование распределения интенсивности в виде полумесяца 40
2.2. Теоретическая оценка повреждающей способности пучков-полумесяцев 46
2.3. Измерения дифракционной эффективности ДОЭ, образующих пучки-полумесяцы 48
2.4. Эксперименты по оптическому манипулированию клетками Saccharomyces cerevisiae при помощи пучков-полумесяцев 51
2.5. Выводы 59
Глава 3. Суперпозиция вихревых пучков с разными топологическими зарядами для формирования пучка в форме полумесяца 61
3.1. Вихревые пучки в задачах оптического манипулирования 61
3.2. Распределение интенсивности в форме полумесяца с кусочно-непрерывной фазой 62
3.3. Теоретическая оценка повреждающей способности и поля оптических сил суперпозиции вихревых пучков 64
3.4. Эксперименты по оптическому манипулированию клетками К562 при помощи луча, являющегося суперпозицией вихревых пучков 68
3.5. Выводы 72
Заключение 74
Список литературы 75
- Моделирование движения частицы в оптической ловушке
- Учет теплового воздействия на микрообъект
- Теоретическая оценка повреждающей способности пучков-полумесяцев
- Теоретическая оценка повреждающей способности и поля оптических сил суперпозиции вихревых пучков
Моделирование движения частицы в оптической ловушке
Микрообъекты, захват которых предполагается моделировать, имеют характерные размеры 5-20 мкм. В этот диапазон попадают клетки дрожжей, бактерии, некоторые одноклеточные организмы, клетки К562 [55] — одним словом, большая часть клеток, представляющих наибольший интерес для цитологов. Неровности этих микрообъектов — скажем, вогнутые поверхности эритроцитов — имеют характерные размеры порядка 0,5 - 1 мкм, что сравнимо с длиной волны лазера. Следовательно, каждый микрообъект можно аппроксимировать подходящим эллипсоидом, поскольку неровности порядка длины волны лазера не будут иметь сколько-нибудь заметного значения для геометрического приближения. Органел-лы, входящие в состав клетки — например, ядро клетки дрожжей — имеют характерные размеры на порядок меньше, и соответствующих размеров неровности на своей поверхности, поэтому также могут быть аппроксимированы эллипсоидом. Аналогичные приближения были использованы в работах [47—49].
Имеющиеся данные [56] позволяют утверждать, что передвижение органел-лы внутри клетки не свободно: отклонившись, органелла возвращается на прежнее место. Время установления равновесного положения микрообъекта в оптической ловушке сравнительно невелико, а существенное отклонение органеллы от своего положения внутри клетки означает явным образом большую степень её повреждения. Поэтому будем считать, что положение органелл не изменяется относительно центра клетки на протяжении моделируемого процесса. 1.2. Метод расчета
В работе [48] предложен геометрооптическии метод расчета сил действующих на микрообъект произвольной заданной формы в световом пучке с произвольным заданным распределением. В [48] также было показано, что при определенных условиях геометрооптическии метод рассчитывать силы, действующие на микрообъект с достаточной для практических расчетов точностью. Расчет сил для биологических микрообъектов имеет свою специфику. Во первых, для большинства биологических микрообъектов форма, размеры и оптические характеристики известны очень неточно. Поэтому нет смысла использовать более точные методы расчета, чем геометрооптическии метод. При таком расчете имеет смысл использовать некие усредненные параметры присущие клеткам определенного вида. Во вторых, биологический микрообъект не является однородным. Внутри клетки, как правило, содержатся фазовые неоднородности (органеллы). Это приводит к необходимости усовершенствования метода описанного в [48]. Усовершенствованный метод должен позволять учитывать дополнительные преломления и отражения на органеллах внутри клетки. В третьих, кроме расчета самой силы, действующей на биологический микрообъект необходимо рассчитывать локальное поглощение света, приводящее к нагреву и повреждению клетки.
Рассмотрим усовершенствованный метод расчета сил, основанный на методе, описанном в [48]. Рассмотрим микрочастицу произвольной формы в световом пучке. Будем считать, что соблюдается ряд условий: 1. Световой пучок задается функциями интенсивности 1(х, у) и фазы р(х, у) соответственно. 2. Биологический микрообъект ограничен поверхностью, которая задается функцией f(x,y,z) = 0 (рис. 1.1). 3. Внутри биологического микрообъекта находятся фазовые неоднородности (органеллы), поверхности которых задаются поверхностями ft(x, у, z) = 0. 4. Микрочастица движется по всем трем координатам. 5. Световой пучок падает на микрочастицу вдоль координаты z. 6. Каждый луч обладает определенной мощностью.
Из каждой точки пучка размером АхАу на плоскости перпендикулярной направлению распространения пучка (плоскость находится в непосредственной близости от микрообъекта) выходит луч, направление которого задает единичный направляющий вектор а (ах, ау, аХ Этот вектор, направляющий падающий луч можно определить с использованием функции фазы (р(х, у) светового пучка. Направляющий вектор должен быть всегда перпендикулярен волновому фронту. Тогда для направляющего вектора будет верным следующее соотношение: Кроме направления луч будет характеризоваться определенной мощностью, которая задается исходя из распределения интенсивности в падающем пучке 1(х, у). Мощность луча определяется по формуле
Учет теплового воздействия на микрообъект
Наличие органелл в клетке приводит к довольно существенному изменению направления распространения преломленного и отраженного лучей.
Используя формулы (1.1-1.17), можно рассчитать силу, действующую на микрообъект произвольной формы с некоторой внутренней структурой со стороны произвольного светового пучка. Однако геометрооптический подход для микрообъектов, сопоставимых по размеру с длиной волны, обычно дает очень неточный результат. Для проверки разработанного метода для расчета силы действия света был проведен ряд расчетов для одиночных лучей заданной мощности для простейшей структуры, состоящей из сферического микрообъекта и сферической же органеллы с общим геометрическим центром. Ряд проведенных расчетов для одиночных лучей показал полное совпадение результатов ручного расчета и расчета с помощью разработанной программы, что дает основание для утверждения адекватности разработанного метода расчета силы.
Как уже указывалось ранее, форму биологического микрообъекта и органелл внутри него будем описывать эллипсоидами вращения (величины двух полуосей совпадают). Такое описание удобно и вполне объяснимо, так как в большинстве случаев измерить форму реального микрообъекта и его внутренней структуры удается только по двум координатам. Кроме того, довольно точно можно определить силу вязкого трения, что очень важно в дальнейшем при использовании метода отрывных сил.
Движение объекта-эллипсоида происходит в водном растворе (например, в изотоническом растворе NaCI), то есть, в присутствии сил вязкого трения. Это движение при определённых допущениях можно разделить на два независимых друг от друга процесса: вращение вокруг центра масс эллипсоида и поступательное движение эллипсоида. Допущения, которые необходимо при этом сделать, следующие: органеллы неподвижны внутри клетки; органеллы не оказывают заметного влияния на расположение центра масс клетки: он совпадает с геометрическим центром эллипсоида; при вычислениях силы сопротивления поступательному движению не учитывается ориентация клетки. Уравнение поступательного движения клетки будет выглядеть следующим образом (см. [57]): где под X Fi подразумевается сумма всех сил (1.4), к — коэффициент сопротивле п ния, обусловленный вязким трением при движении в жидкости, a vn0T — скорость потока жидкости относительно лазерного пучка. Скорость потока окружающей жидкости и сила со стороны света предполагаются на каждом шаге постоянными, поскольку продолжительность этого шага много меньше времени, за которые обе величины успеют заметно измениться.
Решив задачу Коши для этого уравнения (предполагая, что Vo — начальная скорость), найдём положение центра масс объекта и его скорость через время т от начала движения (т.е., в нашем случае — в конце единичного шага ):
Произведём некоторые численные оценки. Как уже упоминалось, характерный размер объекта (наибольший диаметр клетки) 5 мкм. В этом случае к 10"8 —. Масса объекта не превысит нескольких десятков пикограммов ((Ю-6 м)3 1000 Ю-15 кг). Характерное время релаксации j при этом оказывается пренебрежимо малым, следовательно, е «т sc 1, а уравнения (1.19) и (1.20) упрощаются следующим образом [51 ]:
Через объем микрообъекта проходит совокупность лучей, имеющих различные направления — согласно распределению фазы, и мощности — согласно распределению интенсивности.
Рассмотрим сечения микрообъекта плоскостями перпендикулярными оси z, расположенными на расстоянии Az = Ах = Ду. На каждой такой плоскости, исходя из направления распространения лучей и их мощности, можно рассчитать распределение интенсивности по следующей формуле: где N - количество лучей пересекающих элементарную площадку АхАу, W; — мощность і-то луча. Так как коэффициент поглощения в частице очень мал (на толщинах исчисляемых микрометрами), то падением мощности луча от слоя к слою можно пренебречь.
Таким образом, на каждом сечении мы получаем распределение интенсивности. Будем считать коэффициент поглощения к постоянной величиной и пренебрежём её изменением на более плотной мембране клетки, так как толщина мембраны составляет порядка 100 нм [60, 61]. Тогда тепловая мощность, выделяемая в элементарном объеме AxAyAz, будет определяться по формуле
Эта модель используется в данной работе для численных оценок теплового повреждения биологических микрообъектов в световых пучках. Будем считать в дальнейшем, что попадание прямых проходящих лучей на органеллы недопустимо. Моделирование прохождения через биологический микрообъект пучка Гаусса (наиболее часто используемой ловушки) показало, что как при его захвате, так и при перемещении органеллы оказываются в области почти максимальной интенсивности. Следовательно, с точки зрения минимизации тепловых повреждений пу чок Гаусса совершенно неподходящий объект. Расположение в большинстве случаев органелл вблизи геометрического центра биологического микрообъекта наводит на мысль, что пучок должен проходить только через граничные области. То есть, его форма должна напоминать полумесяц.
В данной главе представлена математическая модель, использующаяся в работе для моделирования процессов оптического захвата. Теоретические основы такого расчёта были изложены в работах [48] и [47], и там же подтверждены экспериментом. Для моделирования использовался программный комплекс, описанный в [51 ], позволяющий, в отличие от аналогов, расчёт оптических сил и оценку повреждающего действия лазерного пучка. Моделирование основано на законах геометрической оптики, что, хотя и даёт довольно значительную погрешность при вычислениях, обеспечивает эффективность вычислений, позволяющую быстро оценить механические свойства оптической ловушки, создаваемой изучаемым пучком.
Лазерный пучок, падающий на объект, разделяется на (1 - 3) 105 лучей, каждый из которых представляет собой пучок фотонов. При помощи закона Снелли-уса в векторной форме можно вычислить направления отражённого и прошедшего лучей. Связывая интенсивность элементарных лучей и импульс фотонов, которые они моделируют, можно получить элементарный скачок импульса на границе раздела сред. Суммируя эти воздействия по времени, можно получить результирующую оптических сил. Беря в качестве точки приложения каждой элементарной силы точку преломления, можно посчитать результирующую моментов этих сил. Гидродинамические условия, в которых обычно происходит захват, таковы, что скорость линейно зависит от приложенной оптической силы, а угловая скорость линейно зависит от приложенного момента оптических сил.
Теоретическая оценка повреждающей способности пучков-полумесяцев
. Еще один случай может быть полезен при захвате биологических микрообъектов, который можно наблюдать при соблюдении условия \гп2 -mi\ - 2. Как видно из рис. 3.3 в результате дифракции на таком ДОЭ образуется распределение интенсивности в виде двух полумесяцев с нулевой интенсивностью в центре. Такое распределение удобно для задачи удерживания на месте биологического микроообъекта по одной координате. Это распределение интенсивности за счет концентрации энергии на одной координате позволяет получить большую силу захвата, по сравнению с обычным вихревым пучком такого же масштаба (на 20-25%) (правда, по другой координате сила захвата настолько же меньше). Эти результаты были получены путем моделирования оптического захвата биологического микрообъекта сферической формы методом, описанным в [48] и [51 ]. В случае увеличения количества вихрей в суперпозиции при сохранении шага 2 между их порядками (например, 1-3, 3-5-7, или 7-9-11-13), световые пятна растягиваются в стороны, а максимумы между ними увеличиваются. Такие распределения позволяют получить больший выигрыш в силе по одной из осей при удерживании объекта, чем суперпозиция двух вихрей.
Суперпозиция вихревых пучков с топологическими зарядами 2 и 4. (а) фаза DOE, которая дает в дальнем поле распределение интенсивности (б) и распределение фазы (в).
Порядок вихря регулирует размер двойного полумесяца. Полезно иметь возможность масштабировать размер ловушки без изменения изображающего микрообъектива. На рис. 3.3 показано распределение интенсивности и фазы пучка, являющегося композицией вихревых пучков с топологическими зарядами т\ - 2 и гп2 = 4, а также многоуровневый ДОЭ, который сформирует такое распределение. Эти изображения были получены при помощи свёртки функции плоского пучка с изображением ДОЭ.
3.3. Теоретическая оценка повреждающей способности и поля оптических сил суперпозиции вихревых пучков
Данный вид пучков был теоретически проанализирован тем же образом, как и пучки-полумесяцы в главе 2. Кроме того, была применена техника оценки оптического повреждения, применённая к пучкам-полумесяцам в параграфе 2.2. В параграфе 1.4 приводится модель оценки повреждений, которая используется в настоящей работе для изучения свойств суперпозиции вихревых пучков. Напомним, что согласно модели повреждение линейно зависит от длины пути каждого элементарного луча дискретного разложения пучка внутри клетки или органеллы. Повреждающую способность композиции оптических вихрей сравнивали с повреждающей способностью пучка Гаусса.
Теоретические расчёты показывают, что образуемый суперпозицией вихревых пучков с разностью топологических зарядов \тг - т\\ = 2 двойной полумесяц имеет такую область равновесия, что клетки будут удерживаться обеими половинами луча [64 ]. Для проверки этого предположения была проведена серия численного моделирования, результаты которой представлены на рис. 3.4. Был выполнен расчет оптической силы для каждого положения модели клетки, и промоделировано движение клетки, в предположении, что сила не меняется в течение шага интервала моделирования = 0,001 с). Размер клетки — 2x2,5 х 1,5 мкм, показатель преломления клетки относительно внешней среды — 1,03 [43], размер ядра 1 х 1,2 х 0,5 мкм, показатель преломления ядра относительно внутриклеточной среды — 1,0035, суммарная мощность лазерного пучка — 166 мВт. На рисунке видно, что клетка двигается в область равновесия — геометрический центр пучка.
На рисунках ЗЛа-г изображена модель клетки-эллипсоида со сферической "органеллой" внутри. Хотя понятно, что для перемещения объекта с помощью лазерного луча, последний должен пройти через этот объект, это не обязательно для объектов внутри захваченного объекта. Предположим, что "органелла" расположена в центре "клетки", и смоделируем повреждающие факторы оптического излучения. Как можно видеть по результатам вычисления, имеются два максимума повреждений "органеллы" на каждой стороне точки равновесия (см. рис. 3.5). Предположительно, что такой рисунок повреждений более приемлем для захвата и удержания клетки, чем захват гауссовым пучком, где точка максимального поражения центральной органеллы совпадает с положением равновесия. Заметим, что на рис. 3.5 для ясности сравнения фактор повреждения и сила захвата нормированы на соответствующие максимальные значений величин, так что они обе даны в долях единицы.
Моделирование захвата клетки суперпозицией вихревых пучков с топологическими зарядами 1 и 3. Рисунки а,б,в и г изображают процесс захвата в предположении, что в среде отсутствуют микропотоки. Рисунки разделены во времени 0,1 с.
Аналогичный результат дает численный анализ оптической силы, вызванной смещением клетки из центра пучка. Графики на рис. 3.6 показывают функции для Fx и Fy, если модель перемещается по х и _у оси соответственно.
Исследование также показывает, что максимальная сила захвата для суперпозиции вихревых пучков (Fxmax » 12 пН) существенно не превышает таковую для гауссова пучка примерно той же ширины (Fxmax « 10 пН), если мощность лазерного излучения в этих пучках одинакова.
Теоретическая оценка повреждающей способности и поля оптических сил суперпозиции вихревых пучков
Алгоритмы реализации физических законов могут быть как простыми и самоочевидными (к примеру, моделирование движения тела под действием постоянной силы, приложенной к центру тела), так и довольно сложными — в том случае, если в процессе участвует одновременно множество объектов и их взаимодействие между собой не описывается гладкой функцией. Отражение и преломления множества лучей на кривой поверхности — как раз такой случай: нам придётся вычислять точку пересечения с поверхностью для каждого луча, и для каждого Диаграмма классов: утилитные классы, инкапсулирующие математику задачи луча отдельно вычислять направление распространения проходящего и отражённых лучей. Поэтому особенно сложные алгоритмы мы построим предварительно в виде диаграмм деятельности.
Такие диаграммы тоже могут быть многоуровневыми, где каждый уровень описывает определённое приближение логики. На рисунках А.7, А.8 приведены алгоритмы прохождения луча через систему объектов. Рисунок А.7 отражает нулевое приближение алгоритма. Описывается порядок, в котором луч проходит через ближнюю поверхность объекта, потом через дочерние объекты и выходит через дальнюю поверхность. Отдельно обрабатывается случай полного внутреннего отражения — в этом варианте у объекта и луча образуется ещё одна точка пересечения.
Уровень программных интерфейсов (API): управление сценой На этот уровень вынесено общее управление физическими процессами в моделируемой сцене. Функционал этого уровня позволяет подгружать состояние сцены (клетку с набором органелл и лазерный пучок) из файла, запускать трас Scene берёт на себя архитектурные функции, функции жизненного цикла, предоставляет АРІ в более высоких терминах, чем Nature
Рис. A.6. Схема классов, образующих Посредник сировку лучей, запрашивать результаты (оптические силы и моменты сил, повреждающее действие пучка), сбрасывать результаты такой трассировки к исходным условиям, произвольным образом устанавливать координату центра клетки, запускать часть шага, ответственную за динамику. Всем этим функционалом нагружен класс Scene.
Загрузка сцены производится из файла в формате XML. Более подробно формат этого файла рассматривается в А.6.
Разделение трассировки и движения, а также наличие отдельного метода для прямой установки координаты напрямую вытекает из сценариев использования программы: построение поля сил требует императивного перемещения клетки, без учёта уравнения её движения. Количество лучей в исходной модели достигает нескольких сотен тысяч, поэтому оптимальнее использовать уже существующие объекты — полная загрузка луча из файла на каждом шагу является непроизводительной, гораздо более быстрым является алгоритм, повторно использующий уже загруженные объекты, сбрасывая их состояние к исходному, до трассировки.
В данной части системы инкапсулирован функционал сбора результатов численного эксперимента. Этот модуль используется при использовании продукта в сценариях построения поля и поля повреждений клетки или органеллы целиком, журналирования текущей скорости и оптических сил и моментов сил в сценариях моделирования динамики объекта.
В рамках решения поставленных перед модулем задач организована карта "ключ-значение" из строковых обозначений журналов и открытых в выходные файлы потоков. Потоки открываются при попытке первой записи в них, а сбрасываются на диск и закрываются централизованно, при выходе из приложения.
Важным моментом также является разделение действий над моделируемым миром и шагов сценария использования. Например, и в сценарии симуляции движения клетки, и в сценарии построения "поля" сил используется трассировка лучей через клетку. Однако в первом случае за трассировкой следует расчёт её движения под действием оптических сил, а в случае с построением поля сил — запись рассчитанного значения силы в файл результатов и передвижение в следующую точку, в которой будет измерено значение оптической силы.
С течением времени может возникнуть необходимость ввести дополнительные шаги в какой-либо из сценариев или заменить целиком один большой семантически целостный фрагмент на версию, лучше соответствующую требованиям пользователей. Такие масштабные изменения в коде могут обернуться потерей устойчивости кодовой базы, регрессией функциональности программного комплекса. Чтобы этого избежать, было принято решение создать специфичный для задачи язык поверх языка Java (DSL — domain specific language).
