Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одним из наиболее фундаментальных вопросов энзимологии является выяснение механизма действия ферментов, благодаря которому сложные белковые соединения осуществляют специфичный и эффективный катализ. Ответ на него представляется весьма трудной задачей, решение которой требует всестороннего использования данных, полученных в результате применения различных, подходов и методов.
Известно, что среди ферментативных систем, играющих основную роль з общем обмене веществ в клетке, выделяются комплексы тизмйнзависишх ферментов, а их числе щгрузатдекарбоксилаза и тиаминкиназа. Тиамкновне ферменты катализируют значительное количество реакций, которые можно свести к нескйльким основным типам: неокислительнае декарбоксилирование а-кетокислот и синтез ацетоинов; окислительное декарбоксилирование а-кетокислот, в том числе и пирувата? образование и расщепление о-оксикетонов и дике тонов. Во всех случаях коферментную функцию выполняют тиаюш и его производные.
Тиамин широко применяется в лечебной практике как витаминный и формакодинамический агент; в наши дшї применение тиаминди-фосфата (ТДФ, кокарбоксилаза) при сахарном диабете и сердечко-еоеудиатых заболевашіях общепринято. В изучении функциональной значимости тиамина имеется большое количество данных, полученных з опытах на шгаотных к з клинике, о лечебном эффекте тиамина и тиаминдифосфата, специфических функциях атомов и групп в молекуле витамина. Использование модельных систем позволила представить отдельные тиаминзаЕискмые ферментативные процессы в виде схем последовательных элементарных реакций. Некоторые из этих реакций удалось осуществить в опытах с тиаминовыми ферментами, зоказав их реальность в условиях ферментативного катализа. Йзу-Ї9НІЇЮ кетэлятят&ской Фукмшн fB$ в реакция дзкатэйсксидтсоввния мровшіоградной кислоты (ПК), являющейся важнейшим метаболитом гглеводного обмена, связующим звеном в превращениях белков,-зш-хзв и углеводов, также посвящен обширный литературный материал, їмеетея ряд данных по структуре ПК и ее ионных форм.
Анализ имеющегося" литературного материала показывает, что іти процессы в большинства случаев постулируются я описываются 'Ж фактически сущестзущив без особо удачнных попыток их спрог-
нозировать. Последнее, на наш взгляд, возможно осуществить лишь при изучении физических аспектов упомянутой проблемы. Тем не менее, до сих пор практически отсутствуют данные о строении активного центра таких ферментов как тиаминкиназа и пируватдекарбок-силаза, о природе и энергетике мекмолекулирных взаимомодействий в нем; то же касается внутримолекулярных процессов в молекулах тиамина и его производных. Большое значение в рассматриваемом плане имеет изучение межмолекулярных взаимодействий тиамина с пировиноградной кислотой, строения пировиноградной кислоты и ее" ионных форм, комплексов пировиноградной кислоты, тиамина с ионами металлов (кофакторов), участвующих в осуществлении ферментативного катализа! Ще меньше данных имеется оО общей структуре указанных ферментов, их функциональных группах, внутримолекулярной подвижности и возможных путях регуляции их каталитической активности.
В то же время современные методы кинетической споктрофлуо-риметрии, комбинационного рассеяния света (КР) и гигантского КР (ГКР) позволяют решать перечисленные вопросы. По сути дела, изучение внутримолекулярной динамики ферментов, связи между структурой и их функцией позволяет подойти к решению допроса о возможностях управления ею. Поэтому такие исследования могут существенно развить представления о механизмах функционирования перечисленного класса соединений.
Исходя из выше изложенного, целью настоящей работы являлось изучение строения, электронной структуры производных тиамина, закономерностей спектроскопических проявлений специфических взаимодействий, происходящих в системах, содержащих растворитель, ткзмиЕ, ионы металлов, пировиноградну» кислоту, адсороиругдую поверхность, ферменты, и их роли в процессах функционирования последних.
Достижение поставленной цели предполагало решение следующих задач:
1. Изучение путей дезактивации злвктрошю-возбузденных сос
тояний з производных тиамина и влияние ив них температуры, внут
ри- и міжмолекулярних специфических взаимодействий.
2. Выявление взаимосвязи между спектрвльно-кпнутическими
характеристиками люминесценции, спектрами К? л'структурными фор
мами производных тиамина, пировиноградной кислоты и триптофана,
сущастзущими в различных средах.
-
Изучение влияния специфических взаимодействий в модельных системах, содержащих тиамин, пировинограднуго кислоту, триптофан, имидазол, ионны двухвалентных металлов в растворах и в адсорбированном на поверхности состоянии, на их спектроскопические характеристики.
-
Изучение спектров КР и ГКР, а также собственной люминесценции тиаминкиназы и нируватдэкарбоксилазы и связанных с ниш зондов и меток и влияния на люминесцентные характеристики указанных систем ионов двухвалентных металлов, субстратов и эффекторов ферментативных рэакций.
-
Разработку аппаратуры и методов обработки эксперимента-лы!цх данных длл спектрально-кинетических исследований ЛЮМИНЗС-
ЦОНЦЛК її К?.
Научная новизна работы.
В диссертационной работе обладают научной новизной:
результаты спектрально-кинетических исследований люминесценции производных тиамина, пировиноградной кислоты и их комплексов с ионами двухвалентных металлов в различных растворителях и при различных рН, позволившие построить схему их электрснко-воз-бунденных состоящей, определить пути и механизмы д-ззактпванш' последних и выявить закономерности влияния специфических ззаимс-дайстЕий окружения на электронную структуру указашшх хрсмофо--ров;
полученные из анализа спектров КР и ГКР тиаминдпфосфтга ;; ппрузата данные о структуре этих молекул в растворах ;і в адсорбированном из поверхности состоянии, данныо о наличии специфической ассоциации меаду ними в адсорбированном состоянии и зависимости структуры данного комплекса от потетталз поверхности;
ВИВОДИ С ГеТОрОГеННОСТИ, ГИДрофюОКОСТИ И МаЛОЙ ПОДаЛХНСС -
ги :.'Лкрсокружешія триптофановых. остатков в тиаминкиназе и гатру-затдекарбоксилазе, о влиянии на внутримолекулярную подвижность указанных белков ионов двухвалентных металлов, субстратов и эф-
ректороз ферментативных реакций, которые были сделаны исходя :-і.; ;эзультатоз спектрально-кинетических исследований дшшусцонцпіі;
- прэдлогяннпе модели стцукт'/ры активных центров тияминкп--
«азы к пируватдекарбоксилазы, как результат#анализа выполненных
і работе спектроскопических исследований модельных систем и фер-
:энтншс комплексов.
Научная и практическая значимость работы.
Полученные в работе результаты связывают воедино электронное строение, структуру, физико-химические (в частности, спектрально-люминесцентные) свойства обширного класса биоорганических соединений, в том числе тиамина, пирувата, триптофана, с их биохимической активностью. Построенные модели активных центров тиа-минкиназы и пируватдекарбоксилазы и обнаруженные эффекты влияния внешних факторов на структурную организацию и динамику данных ферментов позволили прояснить механизмы их функционирования и регулирования ряда биохимических процессов в системах жизнедеятельности живых организмов. Выявленные закономерности влияния различных эффекторов на внутримолекулярную динамику упомянутых ферментов свидетельствуют о принципиальном значении спонтанной подвижности белковых структур в процессах ферментативного катализа и указывают на возможные пути его регуляции. Полученные результаты по исследованию процессов релаксации межмолекулярных взаимодействий в ферментах развивают представления спектроскопии межмолекулярных взаимодействий в сложных многокомпонентных системах. Созданные установки и развитые методы исследования люминесценции с субнаносекундным временным разрешением, КР и ГКР отражают современные тенденции в развитии техники и методики спектроскопии и могут найти широкое применение при решении многих научных и производственных задач.
Защищаемые положения:
-
Систематика уровней энергии, электронных переходов между ними для тиамина и рассматриваемых в работе молекулярных комплексов.
-
Фотофизическив процессы в комплексах тиамина с пировино-градной кислотой и ионами металлов, осуществляющиеся в соответствии с их структурой и электронным строением.
-
Влияние внешней среды (растворителя, адсорбирующей подложки, температуры) на спектроскопические характеристики и ферментативную активность тивминкиназы и пируватдекарбоксилазы; особенности структуры и фотофизических свойств замороженных водных и водно-солевых растворов упомянутых систем.
-
Структурная организация тиаминкиназы и пируватдекарбоксилазы и их комплексов с ионами двухвалентных металлов с учетом специфических взаимодействий между ниш.
-
Роль различных эффекторов изученных ферментов и их хро-
? мофоров в преобразовании энергии электронного возбувдения и пути
их влияния на биохимические процессы.
6. Построение моделей структуры активных центров ферментов и ближайшего окружения на основании спектроскопических исследований (на примере тиаминкиназы и пируватдекарбоксилазы).
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы докладывались на XIII Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Польша, Вроцлав, 197? г.), XXIV, XXV, XXVII Совещаниях по люминесценции (Минск, 1977 г., Самарканд, 1979 г., Харьков 1982 г., Караганда, 1989 г.), IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979 г.), VI Межреспубликанской конференции биохимиков (Юрмала, 1981 r.)t I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982 г.), Всесоюзном семинаре "Физика быстропротекающих плазменных процессов" (Гродно, 1986 г.). IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов мшсроорганизмами" (Ташкент, 1988 г.), XX Всесоюзном съезде по спектроскопии (Киев, 1988 г.), XII Всесоюзном совещании по применению колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений (Минск, 1989 г.). ТІ Межреспубликанской школе-семинаре "Современные проблемы спектроскопии, лазерной физики и плазмы", (Минск, 1990 г.), Всесоюзной конференции "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных'' (Ташкент, 1990 г.), XX конференции Европейского биохимического общества (Венгрия, Болотон, 1990 г.), XII, XIII Мездунаро-дшх конференциях по спектроскопии комбинацинного рассеяния света (США, Колумбия, 1990 г., Германия, Вюрцбург, 1992 г.), XX Европейском конгрессе по молекулярной .спектроскопии (Югославия, Загреб, 1991 г), 17 Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Англия, Йорк, 1991 г.), VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 г.), XXI Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Австрия, Зека, 1992 г.)
Публикации.
Основные результаты работы опубликованы в 59 статьях, тезисах докладов, в трудах конференций и совещаний.
Личный вклад автора.
В диссертации изложены результаты работ, выполненных'.автором лично и под его руководством вместе с учениками - Маскевичем З.А., Гачко Г.А., Маскевичем А.А., Подтынченко С.Г., Вороничем
''.... 8
B.E., Стрекаль Н.Д., Башариным С.К. Ряд работ выполнялся совмес-тно с Институтом биохимии АН РБ (г. Гродно), Институтом биоорганической химии РАН им. Шемякина (г. Москва), лабораториями НИИ' ПФП им. А.Н. Савченко, а также кафедрами физического факультета Белгосуниверситета (г. Минск).
Вклад автора диссертации в упомянутые выше публикации заключался в определении направления и постановке конкретной задачи исследования, в разработке методик эксперимента и расчетных "моделей, непосредственном участии в выполнении измерений, проведении анализа и обобщения полученных результатов.
Диссертационная работа выполнена на кафедре общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им.Я.Нупаш в 1976-1992 г. в соответствии с плановыми научными исследованиями по темам, входящим в планы АН СССР и АН БССР. Ряд из этих тем выполнялось по постановлениям ГКНТ СССР и Правительств СССР и республики.
Структура работы.-
