Введение к работе
Актуальность темы.
Развитие в последнее десятилетие техники счета одиночных фотонов с временным разрешением позволило добиться значительного професса в изучении быст-ропротекающих процессов.Одним из наиболее чувствительных и информативных методов исследования короткоживущих возбужденных состояний органических молекул является кинетическая флуоресцентная спектроскопия, предоставляющая информацию о структуре электронных уровней и релаксации энергии электронного возбуждения. Благодаря высокой чувствительности флуоресцентной спектроскопии оказывается возможным изучение структуры органических молекул в возбужденных электронных состояниях не только в растворах, но и непофедственно в биологических объектах. Это открывает широкие возможности для флуоресцентной диагностики биологически важных молекул в тканях, клетках и других модельных системах, что имеет важное значение для медицинских приложений. Применение методов поляризационной флуоресцентной спектроскопии позволяет получать информацию о размерах и форме флуорофоров, а также оценить вязкость их микроокружения.
Существенно расширяются возможности таких применений благодаря интенсивному развитию в последние годы техники лазерной микроскопии, которая позволяет фокусировать излучение в предельно малые, дифракционно офаниченные длиной волны света, размеры. Представляет большой интерес объединение такой фокусировки в пространстве и времени с возможностями поляризационной спектроскопии. Плодотворным оказалось использование методов флуоресцентной мик-роспектрофлуорометрии, и в особенности ее поляризационного варианта, при исследовании взаимодействия, локализации!! агрегации молекул фотосенсибилизаторов в различных биосистемах. Несмотря на интенсивные исследования, проводимые впоследние 10 лет, до сих пор не существует единого понимания фотохимических реакций, протекающих при использовании порфиринов в фотодинамической терапии рака (ФДТ). Наиболее вероятным является путь фотодинамического разрушения, сопровождающийся генерацией синглетного кислорода, эффективность которой зависит от квантового выхода триплетного состояния красителей. Различия в механизмах проникновения мономерной, димерной и олигомерной фракций порфириновых препаратов в клетки, неоднородность их распределения, процессы афегации и дезафегации при взаимодействии с клеточным субстратом вкупе с различной эффективностью генерации синглетного кислорода создают сложную и противоречивую картину механизма сенсибилизированной фотодеструкции.
Вследствие этого, изучение влияния афегации и дезагрегации на фотопроцессы порфиринов является важным и актуальным.
Наиболее адекватной экспериментальной методикой для решения этой задачи является стационарная поляризационная микрофлуорометрия, дающая пространственную картиігу распределения различных компонент порфириновых препаратов в клетке, дополненная более детальной информацией о динамике вращения молекул порфирина различной степени агрегации, полученной на лазерном поляризационном микрофлуориметре с пикосекудным временным разрешением.
Цель и задачи диссертационной работы.
Целью диссертационной работы было создание адекватной экспериментальной техники с высоким пространственным и временным разрешением и развитие метода лазерной пикосекундной поляризационной микрофлуорометрии для изучения сложных органических молекул в растворах, клетках и модельных биологических системах. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:
-
Создание автоматизированного пикосекундного лазерного поляризационного микроспектрофлуориметра на основе метода счета одиночных фотонов для исследования биологически важных молекул методами флуоресцентной спектроскопии.
-
Разработка методики обработки экспериментальных результатов, полученных методами поляризационной флуоресцентной спектроскопии и счета одиночных фотонов с временным разрешением с учетом ошибок и погрешностей последнего.
-
Исследование афегационных процессов гематопорфирина при помоши разрешенной во времени кинетической поляризационной спектроскопии в растворах, липосомах и одиночной живой клетке.
Научная новизна.
Разработан новый экспериментальный подход к исследованию динамики вращательного движения биомолекул непосредственно внутри одиночной живой клетки, основанный на использовании пикосекундного лазерного поляризационного флуоресцентного микроскопа.
Экспериментально обоснована возможность проведения поляризационных измерений с высоким пространственіїьім разрешением. Разработана методика компенсации искажений, вносимых основными элементами оптической схемы, и выработан критерий оценки достоверности полученных результатов.
Впервые экспериментально измерена кинетика затухания поляризованных компонент флуоресценции гематопорфирина в различных частях живой клетки: плазматической и ядерной мембранах и цитоплазме.
Разработано и использовано программное обеспечение для обработки экспериментальных результатов, использующее квазинепрерывное распределение^вре-мен затухания флуоресценции и метод неотрицательных наименьших квадратов для обработки кривых затухания флуоресценции и метод градиентного спуска для нахождения параметров анизотропии флуоресценции многокомпонентной смеси флуорофоров.
На основе теории деполяризации флуоресценции, обусловленной вращательной диффузией молекул, имеющих форму эллипсоида вращения, получена количественная оценка степени агрегации гематопорфирина в различных частях живой клетки.
Практическая ценность.
Полученные в настоящей диссертации результаты носят в основном прикладной характер. Полученные результаты и методика могут быть использованы в различных областях химии, биолопіи и медицины. Развитый в работе подход, основанный на поляризационной флуоресцентной спектроскопии с высоким временным и пространственным разрешением с последующим применением компьютерной обработки результатов и теории вращательной диффузии флуорофоров, открывает новые методические возможности для применения пикосекундной спектроскопии для решения широкого круга задач фотохимии и фотобиологии, в первую очередь позволяя по изменению времени вращательной корреляции получать информацию об изменениях размеров и формы молекул, вязкости микроокруже-иия и подвижности флуоресцентно меченых белков.
Практическая ценность выполненной работы состоит в экспериментальной реализации лазерного поляризационного микроспектрофлуориметра, основанного на пикосекундном Nd:YAG-лазере с килогерцовой частотой повторения импульсов и системе регистрации по методу время-коррелированного счета фотонов, имеющего широкое применение для исследования широкого круга проблем, связанных с пространственным и временным разрешением, определением размера и формы флуорофоров, микровязкости липидных мембран, а также для задач диагностического характера в медицине.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Оказалось возможный проведение измерений поляризованных компонент флуоресценции фотосенсибилизаторов с пикосекуішньш временным и микронным пространственным разрешением непосредственно в отдельной живой клетке при сохранении жизнеспособности исследуемого объекта.
-
Теория деполяризации флуоресценции, обусловленная вращательной диффузией флуорофоров, имеющих форму эллипсоида вращения, адекватно описывает процесс агрегации гематопорфирина в водных растворах и липидных мембранах.
3- Разработанное программное обеспечение позволяет обрабатывать экспериментальные кривые затухания флуоресценции, используя квазинепрерывное распределение экспоненциальных компонент и определяя их количество, на основе метода неотрицательных наименьших квадратов. Метод градиентного спуска позволяет определить значения параметров анизотропии флуоресценции для многокомпонентно» системы флуорофоров.
-
При oTqTCTBini систематических ошибок, вносимых системой регистрации, ошибка, с которой определяются параметры анизотропии флуоресценции разработанным программным обеспечением, однозначно определяется амплитудой накопления экспериментальных кривых затухания.
-
Установлено, что водный раствор гематопорфирина представляет собой смесь мономеров, димеров и агрегатных форм большей степени, соотношение которых определяется концентрацией раствора. При проникновении в плазматическую мембран)' клетки в ней происходит преимущественное накопление мономеров, которые затем начинают вновь агрегировать. К концу 2-го часа инкубации в плазматической мембране устанавливается стационарное распределение мономеров, димеров и агрегатов третьей степени. В цитоплазме присутствуют в основном распределенные диффузно мономеры. В ядерной мембране к 6-му часу инкубации начинается агрегация мономеров с образованием димерных форм.
-
Результаты кюветных измерений анизотропии флуоресценции гематопорфирина в суспензии липосом указывают на определяющую роль липидного бислоя на процессы проникновения, локализации, агрегации и дезагрегации гематопорфирина в живой клетке.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях, совещаниях и школах:
-
На научно-техническом семинаре "Лазеры в народном хозяйстве" (Москва, 1989).
-
На II Республиканской школе-семинаре "Методы лазерной биофизики и их применение в медицине" (Тарту, 1989).
-
На научно-техническом семинаре "Применение лазеров в биологии и медицине" (Москва - Ростов- Великий, 1990).
-
На V Координационном семинаре "Исследование структуры, физических свойств и энергетики биолопічеки активных молекул" (Кошице - Прага, ЧСФР, 1990).
-
На V Международной школе по применению лазеров "ISLA'90" (Вильнюс, 1990).
-
На III Международной кон ференции "Применение лазеров в науках о жизни LALS'90" (Москва, 1990).
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 8 научных работах, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на 148 страницах, включающих 27 рисунков, 5 таблиц и список литературы из 152 наименований.
