Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Оптические методы получили широкое распространение в исследованиях и контроле различных процессов и объектов в физике, химии, медицине, экологии и других областях. Особенно эффективны оптические методы в сочетании с методами разделения и анализа веществ на основе капиллярного электрофореза и в системах проточно-инжекционного анализа. Многообразие анализируемых веществ, необходимость проведения экспресс-анализов требуют разработки приборов, позволяющих проводить исследование и определение полного состава микрообъёмов проб вещества за короткое время, что возможно с помощью оптических детекторов в составе приборов на основе высокоэффективного капиллярного электрофореза, микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.
В оптических методах регистрации и исследовании веществ на основе тепловой линзы, в оптических детекторах для микрокояоночной жидкостной хроматографии и приборов капиллярного электрофореза, при анализах физических свойств жидкостей широко применяются кюветы цилиндрической формы (капилляры). В настоящее время в высокоэффективном капиллярном электрофорезе разделение веществ и их детектирование проводится, в основном, в капиллярах диаметром от десятков до нескольких сотен микрометров. В микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии используются кварцевые капилляры с диаметром в несколько сотен микрометров. Однако с целью уменьшения расходов реактивов, повышения эффективности разделения веществ предпочтительны колонки с меньшим диаметром, что соответственно ведёт к уменьшению размеров кювет оптических детекторов.
При анализе негавестньгх проб важно зарегистрировать все вещества, содержащиеся в образце. Единственным из известных принципов оптического детектирования, удовлетворяющих этому требованию, является детектирование по изменению показателя преломления или рефрактометрическое детектирование.
Развитие капиллярного электрофореза, миниатюризация жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа, требуют развития метода детектирования по показателю преломления в ультрамалых объёмах порядка единиц и долей нанолитров. Исследования по рефрактометрическому детектированию в таких объёмах были начаты во второй половине 80-х годов. Однако до настоящего времени серийно выпускаемых приборов с рефрактометрическими детекторами в ультрамалых объёмах не существует, что обусловлено рядом причин. К основным из них относятся: отсутствие однозначных критериев по выбору оптимальных условий, обеспечивающих достижение минимальных пределов рефрактометрического детектирования вещества в капиллярах; сложность юстировки и
2 эксплуатации предлагаемых оптических схем; недостаточное понимаш физических процессов и факторов, ограничивающих достижение мин мальных пределов рефрактометрического метода детектирования вещест Рассмотрение указанных вопросов является актуальной задачей. Связь с крупными научными программами, темами Результаты, положенные в основу настоящей диссертации, были п< лучены при проведении работ в рамках Республиканской государственнс научно-технической программы "Здоровье" по х/д 236-93 "Разработать изготовить два опытных образца прибора для капиллярного электрофор за с лазерным рефрактометрическим детектором для контроля качестп пищевых продуктов, лекарств, витаминов и других биологически активнь: веществ" (1993-1995 г.г.) и темы Белорусского республиканского фощ фундаментальных исследований (Ш М96-11 от 17.02.1997 г.) "Комплексне применение методов спектроскопии и капиллярного электрофореза для Иі следований продуктов реакций в лазерной плазме". Цель и задачи исследования Целью диссертационной работы являлось выяснение основных закс номерностей и определение характеристик процессов, происходящих пр лазерном детектировании веществ по изменению показателя преломлени в жидкой фазе и ультрамалых объёмах, для оценки потенциальных во: можностей создания рефрактометрических детекторов для приборов ш пиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографи и проточно-инжекциошюго анализа.
Для выполнения поставленной цели исследования требовалось решит следующие задачи:
выяснить особенности распространения лазерного пучка через кювет цилиндрического вида, провести оценку влияния характеристик кюветь свойств анализируемого вещества в жидкой фазе и параметров лазерне го источника излучения на минимальный предел детектирования веще ства по показателю преломления;
исследовать оптимальные способы стабилизации температуры кюветь оценить влияние градиентов температуры в капилляре на эффективност разделения и чувствительность детектирования при разделении вещест методом высокоэффективного капиллярного электрофореза;
оптимизировать метод рефрактометрического детектирования веществ последующей разработкой и созданием автоматизированного прибор для разделения веществ методом капиллярного электрофореза и их де тестирования по показателю преломления, провести апробацию прибо ра для контроля и определения ультрамалых количеств веществ;
разработать рефрактометрический детектор на основе лазерного ис точника инфракрасного излучения для высокоэффективной жидкостно] хроматографии и проточно-инжекционного анализа, апробировать де
тектор для определения веществ в растворе, контроля скорости потоков, флуктуации давления и температуры в ультрамалых объёмах; определить дальнейшие пути и методы повышения чувствительности рефрактометрического детектирования веществ в ультрамалых объёмах.
Объект и предмет исследования
Объектом исследования являлось вещество, находящееся в жидкой фазе и прозрачное на длине волны зондирующего оптического излучения, а предметом исследования - распространение лазерного пучка через кювету цилиндрического вида, заполненную анализируемым веществом, и особенности детектирования веществ по изменению показателя преломления в условиях применения методов капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.
Методология и методы проведенного исследования
Проведено комплексное исследование по оптимизации метода детектирования веществ по показателю преломления в кювете цилиндрического вида с размерами, сравнимыми с диаметром зондирующего лазерного пучка. Оценки чувствительности разработанных рефрактометрических детекторов выполнялись в сочетании с методами разделения и определения веществ на основе высокоэффективного капиллярного электрофореза, микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа.
Научная новизна и значимость полученных результатов
Научная новизна и значимость полученных результатов состоит в следующем:
Впервые определено, что максимальные чувствительность и динамический диапазон лазерного рефрактометрического детектирования вещества в капилляре достигаются при распространении лазерного пучка вне оси капилляра и регистрации смещения образованной интерференционной полосы, имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения, причём показатель преломления материала капилляра должен быть больше показателей преломления вещества и среды, окружающей капилляр.
Впервые выяснено, что при рефрактометрическом детектировании веществ в капилляре путём регистрации смещения интерференционной по-пгосы, имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения, минимальный предел количества детектируемого вещества уменьшается с уве-пичением отношения внутреннего радиуса канала капилляра к его внешнему радиусу, увеличением отношения показателя преломления анализируемой жидкости к показателю преломления материала капилляра, а также эпределяется соотношением поперечных размеров лазерного пучка и капилляра.
Впервые показано, что различие условий отвода тепла от участков сапилляра ухудшает эффективность разделения и чувствительность детек-гирования в высокоэффективном капиллярном электрофорезе, особенно
4 для веществ с коэффициентами диффузии порядка Ю-10 м2/с, а повышение чувствительности рефрактометрического детектирования вещества в ка-пилляре обеспечивается при жидкостном термостатировапии капилляра і зондировании капилляра пучком лазерного полупроводникового диода генерирующего в одномодовом режиме и имеющего гауссов профилі пучка в плоскости, перпендикулярной оси капилляра.
Разработан прибор для капиллярного электрофореза с лазерные рефрактометрическим детектором, юстировка, настройка и работа кото рого выполняются в автоматическом режиме как при замене капилляра иг новый, так и при переводе фотоприёмного устройства в точку максимальной чувствительности рефрактометрического детектирования веществ прг смене электролитов и включении высокого напряжения.
Впервые предложено для повышения чувствительности рефрактометрического детектирования веществ в капиллярном электрофорезе регистрировать изменение показателя преломления жидкости в капилляре с помощью двух пространственно совпадающих лазерных пучков с различными длинами волн, а концентрацию вещества в жидкости определять после исключения из результатов измерений приращений показателя преломления, обусловленных флуктуациями температуры зондируемогс объёма.
Практическая значимость полученных результатов
Практическая значимость полученных результатов исследований определяется возможностью их использования для разработки и создания компактных автоматизированных детекторов по показателю преломления в ультрамалых объёмах с лазерными источниками излучения для приборов капиллярного электрофореза, микроколоночной жидкостной хроматографии и проточно-инжекционного анализа. Результаты расчётов имеют практическое значение для оптимизации и повышения чувствительности рефрактометрических детекторов.
На основании результатов исследований создан автоматизированный прибор для капиллярного электрофореза с рефрактометрическим детектором на основе полупроводникового лазера. По сравнению с существующими аналогами данный прибор характеризуется следующими особенностями: возможностью разделения методом капиллярного электрофореза: и регистрации простых и сложных веществ без их дериватизации и подготовки проб с инжектируемым объёмом на уровне десятка нанолит-ров, концентрационной чувствительностью 10-М (И моль/л и зондируемым объёмом около 0,1 нл.
Экономическая значимость результатов проведенных исследований и экспериментов заключается в том, что разработанные детектор по показателю преломления на основе полупроводникового лазера, прибор капиллярного электрофореза с рефрактометрическим детектором являются полностью автоматизированными и могут использоваться для анализа ве-
5 ществ в жидкой фазе объёмом в несколько десятков нанолитров. Применение кювет с внутренним диаметром меньше сотни микрометров позволит уменьшить количество используемых химических реактивов при проведении анализов и исследований, снизить расходы на проведение мероприятий по охране окружающей среды.
Разработанное устройство для визуализации инфракрасного излучения на основе жидкокристаллической плёнки позволяет проводить настройку и юстировку детекторов с источниками оптического излучения в ИК области без привлечения дорогостоящих тепловизоров и фоточувствительных матриц с переносом заряда.
На основе проведенных исследований возможно дальнейшее развитие приборов для капиллярного электрофореза с одновременным применением метода рефрактометрического детектирования и других оптических методов регистрации вещества, таких, как абсорбционное и флуоромет-рическое детектирование, что позволит повысить чувствительность регистрации и расширить спектр их применения для разделения и определения малых количеств веществ в объектах окружающей среды, выполнения анализов в химии, физике, биологии, фармацевтике, пищевой промышленности и других областях науки и техники.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
При распространении вне оси капилляра оптического пучка полупроводникового лазера с гауссовым распределением интенсивности в плоскости, перпендикулярной оси капилляра, образующаяся за капилляром интерференционная картина определяется положением и размером лазерного пучка, внутренним и внешним радиусами капилляра, показателями преломления материала капилляра и жидкости в нём, и на этой основе возможно автоматизированное определение изменений показателя преломления жидкости с помощью рефрактометрического детектора, чувствительность детектирования веществ которого улучшается при генерации лазерного диода в одномодовом режиме.
Максимальные чувствительность и динамический диапазон рефрактометрического детектирования вещества в капилляре достигаются при комплексном выполнении следующих условий: регистрации смещения интерференционной полосы,- образованной при распространении лазерного пучка вне оси капилляра и имеющей максимальные интенсивность и угол отклонения; увеличении отношений внутреннего радиуса канала капилляра к его внешнему радиусу и показателя преломления анализируемой жидкости к показателю преломления материала капилляра; компенсации ламинарных потоков, возникающих в результате различных условий отвода тепловой мощности от участков капилляра.
Измерения изменений показателя преломления жидкости в капилляре с помощью двух пространственно совпадающих лазерных пучков с различными длинами волн обеспечивает возможность исключения из ре-
зультатов измерений приращений показателя преломления, обусловленны флуктуациями температуры зондируемого объёма, и повышени чувствительности лазерного рефрактометрического детектирования ві ществ в условиях флуктуации температуры жидкости в капилляре. Личный вклад соискателя
