Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Малоинвазивные методы 14
1.2 Лазерно-флуоресцентная спектроскопия в медицине 15
13 Обзор ФДТ 16
1.3.1 Положение дел в ФДТ 17
1.3.2 Фотосенсибилизатор 18
1.3.3 Физика фотодинамического эффекта 19
1.3.4 Дозиметрия при ФДТ 22
1.4 Распространение света в биологических тканях 25
1.5 Малоинвазивные методики определения содержания сахара в крови человека... 32
1.5.1 Методики множественной перфорации и постоянного автономного мониторинга 33
1.5.2 Электро-перфузия с химическим детектированием 34
1.5.3 ИК-спектроскопия основанная на био-имплантантах 36
1.5.4 ИК спектроскопия на поверхности кожи 36
1.5.5 Определение концентрации глюкозы на основе импедансной радиоволновой спектроскопии 37
1.5.6 Химическое детектирование глюкозы на контактных линзах 38
1.5.7 Флуоресцентные сенсоры-имплантанты 38
Глава 2. Система для определения плотности мощности излучения в биологических тканях при минимальной инвазии 40
2.1 Цели создания системы 40
2.2 Вступление 41
23 Описание системы 42
2.4 Флуорофоры 45
2.5 Геометрия волокон 49
2.6 Методика расчета вклада флуорофоров в конечный спектр 50
2.7 Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли 52
2.8 Пример решения уравнения для четырех ЛФ 55
2.8.1 Относительные спектральные координаты нулевого порядка 57
2.8.2 Спектральные координаты первого порядка 58
2.8.3 Спектральные координаты второго порядка 60
2.8.4 Спектральные координаты третьего порядка 61
Спектральные координаты четвертого порядка 62
2.9 Методика декомпозиции спектров по спектральным координатам 63
2.10 Оптимизация методики декомпозиции спектра по спектральным координатам. 65
2.11 Модификация метода введением весовых коэффициентов 66
2.12 Калибровка прибора 68
2.13 Оценка изотропности распределения света в калибровочной установке 72
Глава 3. Измерения и валидация системы определения плотности мощности излучения в биологических тканях 75
3.1 Измерение волокна с насечками без нанесения флуорофоров 75
3.2 Измерение одного ЛФ 77
3.3 Модельные эксперименты 81
3.4 Опыты на экспериментальных животных 86
Глава 4. Микроперфорация колеи с использованием лазера YAG:Er 91
4.1 Введение 91
4.2 Исследование взаимодействия лазерного облучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости 92
Глава 5. Измерение концентрации глюкозы в межклеточной жидкости . 97
5.1 Методика определения содержания глюкозы в малых объемах жидкости 97
5.2 Калибровка тест полосок с помощью стандартных растворов глюкозы 100
5.3 Измерение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости, полученной после лазерной микроперфорации кожи 105
5.4 Выводы 107
Заключение 108
Список публикаций 110
Список литературы
- Физика фотодинамического эффекта
- Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли
- Измерение одного ЛФ
- Исследование взаимодействия лазерного облучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости
Введение к работе
Вступление.
Лазеры и лазерные технологии за последние три десятка лет вошли во все сферы человеческой деятельности. Одной из наиболее важных для общества областей применения лазеров является медицина [1, 2 ,3]. Благодаря высокой плотности мощности излучения и низкой расходимости пучка, лазер является наилучшим источником света для работы с оптоволоконной техникой. В зависимости от длины волны, плотности мощности и времени импульса излучения, лазер может быть как скальпелем с минимальной шириной «лезвия», так и аппаратом точечного выпаривания сколь угодно малых участков биологической ткани [4]. Высокая спектральная и пространственная плотность мощности позволяет использовать лазеры для измерения, как люминесцентных свойств ткани, так и таких тонких явлений, как доплеровский сдвиг спектра при отражении луча от движущихся молекул гемоглобина в кровеносных сосудах.
Ярким примером медицинского применения лазеров и флуоресцентной спектроскопии является бурно развивающаяся область фотодинамической терапии (ФДТ) [5] злокачественных новообразований. Для корректного проведения ФДТ одним из важнейших критериев является точная информация о пространственном и временном распределении света внутри биологической ткани, которое зависит от типа ткани, геометрии органа, его кровенаполненности, степени оксигенации [6], расположения сосудов [7], выгорания препарата [8, 9] и пр. и т.п. [10, 11].
Существует множество подходов, позволяющих либо в явном виде измерить, либо посредством математической модели [12 13] предсказать распределение плотности мощности внутри органа при ФДТ, однако, явное измерение зачастую неприемлемо по причине высокой степени инвазии в ткань, что недопустимо при лечении онкологических заболеваний, а модельные приближения не всегда дают точный ответ, что чревато неэффективным ходом лечения.
В настоящей работе предлагается явный и, в то же время, малоинвазивный метод дозиметрии пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения в биологической ткани при ФДТ с использованием флуоресцентной спектроскопии [14, 15]. Низкая степень инвазии достигается за счет размещения нескольких флуоресцентных сенсоров на одном оптоволокне достаточно маленького диаметра (200мкм), чтобы не вызвать патологические процессы.
В качестве другого применения лазерно-флуоресцентной спектроскопии для малоинвазивной диагностики, в работе предлагается оригинальная методика измерения сахара в крови человека путем получения межклеточной жидкости при лазерной перфорации поверхности кожи с последующим флуоресцентным анализом капли на содержание глюкозы.
Актуальность темы
В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение малоинвазивные лазерно-спектроскопические методы исследования и диагностики различных патологий на различных тканях [16].
Одной из наиболее важных проблем является проведение точной пространственной дозиметрии и мониторинга во времени лазерного излучения внутри биологической ткани в процессе фото динамической терапии [17]. Связано это в том числе с тем, что в последнее время в фотодинамической терапии все больше используются фотосенсибилизаторы сосудистого типа, имеющие относительно низкий контраст накопления в опухоли относительно
9 нормальной ткани, в частности, Тукад, Визудин, пр. В этом случае лазерное излучение должно доставляться так и в том объеме, чтобы не повредить здоровые ткани, особенно жизненно важных органов. Особенную актуальность задача приобрела при все более широком внедрении ФДТ в лечение внутритканевых глубокозалегающих опухолей, соседствующих с жизненно-важными органами. К примеру, при лечении рака предстательной железы, который в современном мире выходит на первое место по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний, с помощью ФДТ, очень важно, чтобы лазерное излучение не повредило расположенную рядом уретру, являющуюся легко подверженным повреждению органом. С другой стороны, если доза лазерного излучения окажется ниже пороговой величины для ФДТ в какой-либо части опухоли, то раковые клетки останутся неповрежденными и с высокой вероятностью вызовут рецидив, что недопустимо.
Другой актуальной проблемой, которой посвящена вторая часть работы, является малоинвазивная диагностика и мониторинг сахара в крови человека [18]. Широкая распространенность, ранняя инвалидизация и высокая смертность больных определили сахарный диабет как острую медико-социальную проблему современного мира. По данным ВОЗ, диабетом в той или иной форме страдают до 10% населения (приблизительно 4,6 млн. чел. в России по состоянию на 2000г) [19], и это число продолжает расти. Больные диабетом должны регулярно (мин 2 раза в сутки) измерять уровень сахара в крови. В настоящее время для этого используется метод прокола пальца ланцетом и анализ полученной капли крови. Эта процедура болезненна, неудобна, может вызвать проникновение инфекции, вид крови у многих (особенно у детей) вызывает стрессовое состояние. Актуальность предлагаемого в работе малоинвазивного и бескровного метода получения и анализа малых капель межклеточной жидкости не вызывает сомнений.
10 Цель исследования:
Основной целью диссертационной работы является развитие малоинвазивных методов дозиметрии пространственного распределения плотности мощности света при лазерном облучении биологических тканей в процессе фотодинамической терапии и малоинвазивных методов дозиметрии содержания глюкозы в крови путем лазерной перфорации кожного покрова и анализа межтканевой жидкости с помощью лазерно-флуоресцентной спектроскопии.
Задачи исследования
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
Разработка, расчет, моделирование и экспериментальные исследования оптоволоконных флуоресцентных многосенсорных зондов с пространственно разнесенными флуорофорами для контроля пространственной плотности мощности лазерного терапевтического излучения с длиной волны 670 нм, возбуждаемых терапевтическим излучением и обеспечивающих за счет спектральных различий флуоресценции используемых флуорофоров возможность определения парциальных вкладов каждого из них.
Разработка физической модели (подхода) и математического алгоритма для расчета пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани из спектрально-флуоресцентных данных, полученных с оптоволоконных зондов.
3. Разработка многоканальной волоконно-оптической регистрирующей системы для изучения спектров излучения, выходящего из оптоволоконных зондов, и специального математического обеспечения для сбора и обработки получаемых спектральных данных.
Проведение модельных и экспериментальных исследований по определению плотности мощности лазерного излучения в тканях предстательной железы экспериментальных животных в процессе ФДТ.
Экспериментальное исследование взаимодействия с поверхностью кожи лазерного излучения с длиной волны 2.9 мкм, имеющего различную длительность и энергию импульсов.
6. Исследование методами лазерно-флуоресцентной спектроскопии процессов, происходящих при взаимодействии глюкозы в хроматографической бумаге, пропитанной специальными химическими реагентами.
7. Спектрально-флуоресцентное определение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости человека, полученной при лазерной перфорации кожи.
Научная новизна исследования
Впервые проведены исследования, показывающие принципиальную возможность определения пространственного распределения света в биологической ткани с помощью моноволоконного датчика с 4-мя разными флуорофорами путем одновременной передачи флуоресцентного сигнала от них по одному оптическому волокну с возможностью последующей дешифровки вклада каждого из флуорофоров в общий спектр при возбуждении флуоресценции флуорофоров внутри биологической ткани изучаемым при ФДТ лазерным излучением низкой интенсивности.
Впервые метод спектральных координат применен для расшифровки спектральных данных, получаемых с флуоресцентных зондов.
Впервые обнаружен и изучен эффект образования капли внутритканевой — жидкости на поверхности кожи человека из кратера, образованного при
Ф перфорации верхних слоев кожи лазерным импульсом.
Методами лазерно-флуоресцентного анализа была изучена кинетика протекания реакции глюкозы, содержащейся в межклеточной жидкости, с химическими реагентами (Amplex Red, кислород, глюкозоксидаза, пероксидаза), результатом которой является сильно-флуоресцирующее вещество Резоруфин.
Практическая значимость. -U\ Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, позволяют существенно улучшить качество дозиметрии ФДТ, тем самым, с одной стороны, уменьшить количество возникновений рецидивов, с другой стороны, не повреждать жизненно важные органы, находящиеся в непосредственной близости от опухоли. Созданная в рамках работы установка может служить прототипом системы для клинического применения.
Разработанная методика определения концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости может послужить основой для создания клинической диагностической малоинвазивной системы измерения сахара в крови человека.
Разработанное в процессе выполнения данной работы программное обеспечение по получению и разностороннему анализу и формализации спектральной информации нашло широкое применение в различных областях спектроскопии и вошло в стандартную комплектацию серийного спектрометра ц ЛЭСА-01-Биоспек [20], успешно функционирует в более чем 20-и лабораториях
России, а также Канаде, Словакии, США, Южной Корее, Польше.
13 Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (С.-Петербург, 2001), Международном симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан-Хосе, США, 2001), десятом Конгрессе Европейского Фотобиологического Общества (10 Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 6-11, 2003), Международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике (Saratov fall meeting 2005, Саратов, 2005), Международной конференции Photonics in Medicine, (Торонто, Канада, 13-14 сентября, 2005).
Публикации.
По результатам диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, включая патент РФ (№2258452 от 20.08.05 с приоритетом от 03.09.03), две статьи в рецензируемых изданиях, 3 статьи в иностранных журналах, 5 публикаций в материалах российских конференций и 3 публикации в материалах зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения и 5-й глав. Содержание диссертации изложено на 125 страницах, иллюстрировано 48-ю рисунками. Список цитируемой литературы включат 107 источников. Приводятся 2 приложения і общим объемом 28 страниц, иллюстрированные 12-ю рисунками.
Физика фотодинамического эффекта
Явление фотодинамического эффекта открыто в 1900 г. Раабом и Таппайнером в Мюнхенском Фармакологическом институте. Этот эффект проявляется в природной способности клеток живого организма реагировать на световое излучение. Если по каким-то причинам клетки окрашены и могут поглощать свет видимого диапазона длин волн, то при освещении и поглощении света этими клетками они теряют подвижность и гибнут.
Механизм действия фото динамической терапии состоит в следующем (см. Рис. 1.2.). Молекула фотосенсибилизатора в основном состоянии поглощает квант света и переходит в возбужденное синглетное состояние. Далее за время порядка 10 - 13 не происходит колебательная релаксация на основной колебательный уровень возбужденного синглетного состояния. Оттуда молекула ФС может релаксировать в свое основное состояние с излучением фотона (флуоресценция) за время порядка несколько наносекунд либо с трансформацией энергии в тепло. Кроме того, молекула ФС с помощью интерконверсии может перейти в триплетное состояние, время жизни которого может достигать долей миллисекунды. В триплетном состоянии молекула ФС может провзаимодействовать с молекулой кислорода, основное состояние которой также триплет. В результате взаимодействия молекула кислорода переходит в возбужденное синглетное состояние, а молекула ФС возвращается в свое основное состояние. Молекула кислорода в синглетном состоянии является очень активным окислителем и мгновенно реагирует с окружающими биологическими тканями (липиды и белки), приводя к их окислению и утилизации кислорода.
Скорость потребления кислорода при ФДТ, при условии, что сам по себе дефицит кислорода не является лимитирующим фактором и низкой плотности мощности облучения, когда уменьшение заселения основного уровня ФС незначительно, можно выразить следующим уравнением: где Трот - скорость потребления кислорода, измеряемая в моль/литр-с, [С] - концентрация ФС, измеряемая в молях/литр, Р - плотность мощности излучения, измеряемая в Вт/см , а - коэффициент эффективности генерации синглетного кислорода измеряемый в см /Дж , (pcf,- квантовый выход химического (необратимого) тушения синглетного кислорода. Реализуется так же механизм физического (обратимого) тушения, во время которого синглетный кислород в результате дезактивации переходит в триплетное состояние, то есть в обычный молекулярный кислород. Коэффициент эффективности генерации синглетного кислорода может быть записан следующим образом [61]: где а- поперечное сечение поглощения молекулы ФС [см ], Ehv - энергия фотона [Дж], Х- длина волны облучения [нм], рд - квантовый выход образования синглетного кислорода, є - коэффициент экстинкции ФС [моль"1 см" ]. Величина а имеет смысл количества молекул синглетного кислорода, образованного одной молекулой ФС при световой дозе в 1 Дж/см2, а произведение a(pch в формуле (1.1) имеет смысл количества утилизированных молекул кислорода на одну молекулу ФС также при световой дозе 1 Дж/см . При этом предполагается, что кислород в основном (триплетном) состоянии присутствует в избытке и не является лимитирующим звеном при генерации синглетного кислорода.
Коэффициент эффективности генерации синглетного кислорода а очень удобен для оценки фотодинамической активности ФС-ов, работающих по механизму II типа. Можно оценить значение а снизу, т.е. получить минимальное значение, выше которого возможна реализация фотокаталитического эффекта. Для этого нужно, чтобы за время светового облучения одна молекула ФС сгенерировала, по крайней мере, одну молекулу синглетного кислорода. Средняя световая доза/во время ФДТ с большинством ФС составляет порядка 100 Дж/см (варьируется в пределах от 50 до 400 Дж/см ). Для типичных ФС коэффициент экстинкции находится в области 10 моль см"1, а рд 0А+0.3, X 670 нм, коэффициент эффективности генерации синглетного кислорода согласно формуле (1.2) будет примерно равен а 140 -І- 500 см /Дж.
Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли
При расчете геометрии волокон решающее значение имеет среда, в которой такие волокна будут собирать информацию о плотности мощности излучения. С известными допущениями, плотность мощности света на удалении х от точечного источника в гомогенной среде можно записать как где jx - коэффициент экстинкции, или обратная длина свободного пробега фотона в среде. Очевидно, что расстояние между сенсорами должно быть того же порядка, что и длина свободного пробега фотона. Для биологических тканей таких органов, как простата этот показатель колеблется в пределах нескольких миллиметров. С другой стороны, важно учесть размеры органа и размеры возможной патологии, которые составляют несколько сантиметров. Соответственно, для 4-х сенсорной системы оптимальным расстоянием будет 5 - 7 мм между сенсорами.
От геометрии насечек на волокне зонда зависит, в первую очередь, количество флуоресцентного излучения, попавшего в волокно, с другой стороны, от геометрии насечек зависит количество потерь излучения от сенсоров, находящихся ближе к дистальному концу зонда. В качестве оптимального значения опытным путем было подобрано 200 мкм длина насечки при использовании пластикового волокна с диаметром сердцевины 200 мкм.
Анализируемый спектр S необходимо разложить на составляющие спектры ЛФ или представить этот спектр в виде линейной суперпозиции спектров ЛФ. Где S - суммарный спектр, Sj - спектры ЛФ и а, - соответствующие коэффициенты или веса, М - количество ЛФ на одном зонде, X - длина волны. При должной калибровке прибора, очевидно, что получение значений щ дает информацию о величине плотности мощности излучения внутри ткани.
Очевидным ограничением при выборе метода разложения является то условие, что вычисления должны проводиться на компьютере ограниченной вычислительной мощности и в режиме реального времени, т.е. выполнять декомпозицию по мере поступления спектров. Время сканирования (время, требуемое аппаратурой для перемещения информации с матрицы ПЗС в память компьютера) используемой ПЗС матрицы составляет приблизительно 1600 мс. С учетом времени накопления это приблизительно две секунды.
Стандартным решением такой задачи является метод наименьших квадратов, как метод получения наилучшего решения для переопределенной системы уравнений. Предполагая, что наилучшее решение удовлетворяет условию min (2.5) Где х - функция минимизации, N - количество точек в спектре. Функция минимизации представляет собой многомерную параболу с одним единственным минимумом, для нахождения которого функцию необходимо продифференцировать и найти нули первой производной по всем
Чем больше детерминант отличен от нуля - тем устойчивее решение системы. Такой метод во всех случаях дает одно решение, т.к. на выходе имеет систему линейных алгебраических уравнений и единственным способом настройки метода является выбор диапазона вычислений (если не считать описанных ниже способов задания весовых функций).
В настоящей работе предлагается другой метод: метод декомпозиции с использованием спектральных координат, основанный на том свойстве линейной комбинации спектров, что если сумма 4-х спектров равна некоторому пятому спектру, то и сумма моментов любого порядка этих 4-х спектров будет равна соответствующему моменту 5-го спектра.
Поскольку спектры ЛФ не очень сильно отличаются друг от друга, в том числе по причине ограничений, связанных с применением в медицинской промышленности, то необходимо разрабатывать специальные методы декомпозиции спектров. Проблема такая: по почти идентичным спектрам ЛФ определить парциальные доли спектров ЛФ в спектре анализируемого излучения.
Анализируемый спектр S необходимо разложить на четыре спектра ЛФ или представить этот спектр в виде линейной суперпозиции спектров 4 ЛФ.
/=і
Разложение по амплитудам спектра не эффективно, так как вызывает большие вычислительные трудности и требует определенного времени обработки спектральных данных. Однако условия применения метода требуют проведения анализа в режиме реального времени, поэтому необходимо разрабатывать методы спектрального анализа, не требующего большого времени вычислений.
Для этого была разработана модификация метода спектральных координат (МСК). Основы МСК изложены в Приложении 1. Обе части уравнения ( 2.8) умножаются на частоту перехода f и интегрируются по всему спектру:
В левой части этого равенства стоит момент n-го порядка анализируемого спектра, а справа стоит линейная комбинация этих же моментов с парциальными коэффициентами я„ величины которых надо определить.
Измерение одного ЛФ
При создании оптоволоконных флуоресцентных зондов важным условием являлось то, что попавший в люминофор свет, с одной стороны, имеет достаточную вероятность попасть внутрь волокна, с другой стороны, не выходит наружу при прохождении других сенсоров по пути к детектору. Практическим путем была выбрана ширина насечки 200 мкм. (см. пп.2.5 ) Далее, таким образом подготовленное волокно было прокалибровано с использованием стандартной процедуры в непрозрачной трубке с прорезью. На рисунке ниже (Рис. 3.1) представлена карта такого измерения.
Из Рис. 3.1. видно, что, несмотря на фильтр, установленный в системе, небольшое количество лазерного излучения проходит в насечки (что, очевидно, связано с не идеальностью поверхности насечек) причем, это количество невелико, раз высокочувствительная система не ушла в перенасыщение, во-вторых, можно сделать вывод, что некоторое количество света, вошедшее в дальнюю от спектрометра насечку, было потеряно при прохождении остальных насечек, но это количество сравнительно невелико — количество поступившего на ПЗС матрицу света от насечки к насечке не разнится более чем в 3 раза.
Как было показано в предыдущем пункте, свет может распространяться внутри волокна от сенсора к сенсору, что в перспективе может дать некий паразитный вклад флуоресценции последующего сенсора к сигналу предыдущего. Кроме того, оптические свойства клея могут внести коррективы в распространение света внутри волокна. Для количественной оценки такого рода явлений был проведен следующий эксперимент: на волокно с четырьмя насечками в одну из насечек был нанесен флуорофор (во 2-ю с дальнего от спектрометра конца волокна), а в соседние ячейки были нанесены капли чистого клея, по объему приблизительно равные капле с флуорофором. Далее приготовленное таким образом волокно было прокалибровано согласно стандартной схеме в непрозрачной трубке с прорезью. Результаты эксперимента приведены на Рис. 3.2.
Как видно из калибровочной карты, практически весь свет, поступивший от дальней от спектрометра насечки, был поглощен флуорофором, но вышедший в результате этого флуоресцентный сигнал оказался настолько слаб, что на карте в линейном масштабе кодирования интенсивностей этот сигнал неразличим. Свет, попавший через щель непосредственно на флуорофор (2-я насечка), вызвал отчетливый сильный флуоресцентный сигнал, тем не менее, ограниченный геометрией сенсора. Эффекта растекания почти не наблюдается. Кроме того, не наблюдается и лазерного излучения, которое было полностью поглощено флуорофором, зато лазерное излучение наблюдается в 3-й и 4-й насечке, кроме того, из диаграммы видно, что часть этого излучения дошла до флуорофора, возбудила флуоресценцию, и эта флуоресценция была зарегистрирована спектрометром.
Из графика, приведенного на рисунке (Рис. 3.2) видно, что амплитуда флуоресценции во флуорофоре ощутимо выше флуоресценции, возбужденной через прочие насечки. Из Рис. 3.3. видно, что в худшем случае интенсивность флуоресценции, возбужденной через соседние насечки, составляет не более 3% от интенсивности флуоресценции в самом флуорофоре. Кроме того, важно учесть, что интенсивность лазерного излучения, проникшего внутрь волокна через флуорофор, резко падает в сравнении с количеством света, попавшего в волокно через незаполненную насечку или насечку, заполненную «чистым» клеем.
На графике рисунка (Рис. 3.4) видно, что лазерное излучение в насечке с флуорофором и предшествующей насечке подавлено примерно в три раза в сравнении с графиком на Рис. 3.1. Таким образом, пренебрегая перепоглощением между сенсорами внутри волокна, можно сказать, что интенсивность флуоресценции при попадании света на флуорофор в 33 - 100 раз выше чем при попадании света на соседние сенсоры, что близко к соотношению сигнал-шум системы.
Следующим этапом исследования было измерение реальных спектров флуоресценции, излученной нанесенными на зонды флуорофорами. Были взяты сенсоры N, D, L, Р, причем при нанесении старались разместить их так, чтобы сенсоры с максимальным квантовым выходом располагались дальше от спектрометра. Далее была проведена калибровка стандартным способом с использованием непрозрачной трубки с прорезью. Результаты приведены на Рис. 3.5. Как видно из рисунка, все сенсоры отчетливо просматриваются на карте, также видна и подавленная фильтром лазерная линия (670 нм), которая возрастает от сенсора к сенсору с приближением к спектрометру.
График на рисунке демонстрирует, что интенсивность, взятая на 2-х характерных длинах волн, равномерно возрастает с приближением сенсора к прорези внутри непрозрачной трубки, а затем достаточно равномерно убывает. Некоторым исключением является сенсор L, интенсивность которого убывает неодинаково на разных длинах волн с изменением угла падения света на сенсор внутри непрозрачной трубки. Таким образом, в этом случае был зарегистрирован эффект перепоглощения.
Исследование взаимодействия лазерного облучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости
Для определения содержания глюкозы в малых объемах жидкости был использован метод лазерно-флуоресцентной спектроскопии с использованием специальных маркеров, нанесенных на специальную хроматографическую бумагу толщиной 450 мкм (тест-полоски). Приготовление тест полосок производилось следующим образом. На образцы хроматографической бумаги (примерно 10 см в длину и 3 см в ширину) наносились основные компоненты химических маркеров: раствор Amplex Red, раствор пероксидазы, раствор глюкозоксидазы.
Далее полоски просушивались при комнатной температуре в темном помещении в течение одного часа. Приготовленные таким образом тестовые полоски сохраняли свои свойства, как минимум, в течение недели при условии хранения в сухом темном месте.
Для проверки тест полосок на них наносились капли раствора глюкозы с известной концентрацией. Объем капель составлял 1-2 мл, что соответствует количеству внутритканевой жидкости, получаемой при лазерной микроперфорации кожи. Концентрации глюкозы в растворе выбирались с тем, чтобы соответствовать возможным биологическим концентрациям глюкозы в крови человека (3-12 [мМ]). При проведении исследований предполагалось, что результат не будет зависеть от величины капли, если ее радиус значительно больше толщины бумаги и размер капли на бумаге значительно превышает зондируемый объем при измерении спектров флуоресценции. Это предположение основывается на том факте, что при нанесении капли жидкости на хроматографическую бумагу, благодаря капиллярным эффектам, жидкость мгновенно заполняет все полости внутри бумаги. При этом, концентрация глюкозы в пятне на хроматографической бумаге, выраженная в молях на см2, не будет зависеть от объема капли. Тот же самый принцип используется при измерении глюкозы в крови с помощью коммерческих тест полосок. Экспериментальные измерения показали, что в диапазоне объемов капель 0.5 -2 мл интенсивность флуоресценции маркера (см. ниже) менялась менее чем на 20%.
После нанесения капли раствора глюкозы, раствор «впитывается» в бумагу, и начинается реакция глюкозоксидазы с глюкозой с образованием глюконолактоны и перикиси водорода. Перекись водорода немедленно обнаруживается красителем Amplex-Red. В присутствии пероксидазы AmplexRed реагирует с перекисью водорода (стехиометрия процесса 1:1) в результате чего образуется сильно флуоресцирующее (с пиком возбуждения в районе 563нм и пиком излучения в 587нм) вещество резоруфин (см. Рис. 5.1). Интенсивность излучения полученного таким образом резоруфина измерялась с использованием оптоволоконного спектрометра. (Рис. 5.1.)
На Рис. 5.1. приведена схема экспериментальной установки созданной для измерения содержания глюкозы в межклеточной жидкости. В качестве регистрирующей системы был использован волоконно-оптический спектрометр и программное обеспечение (Приложение 2).
Свет от твердотельного лазера с длиной волны 532 нм и мощностью 10 мВт доставлялся к полоскам посредством передающего кварцевого волокна с диаметром сердцевины 200 мкм. Флуоресцентное излучение поступало в спектрометр по приемному кварцевому волокну с таким же сечением в 200мкм. Расстояние между приемным и передающим волокнами 250 мкм (от центра до центра). На входе спектрометра установлен оптический фильтр, подавляющий длину волны лазерного излучения, с целью уменьшения интенсивности поступающего в спектрометр рассеянного лазерного излучения до величин, сравнимых с величиной интенсивности флуоресценции резоруфина. Разработанное программное обеспечение позволяет производить измерения спектров, производить обработку, как в режиме реального времени, так и в режиме постпроцессинга, отслеживать временные параметры процессов.
Измерения проводились в полном контакте приемного и передающего волокон с поверхностью тест полоски. Тем самым глубина зондирования составляла приблизительно 400мкм. Интенсивность лазерного излучения на выходе передающего волокна находилась в диапазоне от 0,05 до 0,2 мВт что позволяло получать достаточный уровень сигнал-шум и не вызывало чрезвычайно быстрого фотобличинга резоруфина.
На Рис. 5.2 представлены спектры флуоресценции капель резоруфина разной концентрации на подготовленной с Amplex Red диагностической бумаге. Пик на длине волны 532нм обусловлен усеченной фильтром лазерной линией, широкий пик в диапазоне 594нм - 615нм флуоресцентное излучение, искаженное фильтром и перепоглощением флуоресценции. Спектры нормированы на амплитуду усеченной лазерной линии в 532нм. Это позволяет учитывать нестабильность лазерного излучения и частично нивелировать эффект от неидеальности геометрического расположения волокон и образца. Интенсивность флуоресценции рассчитывалась как площадь под кривой от 550 до 750 нм деленная на площадь под рассеянной и подавленной фильтром лазерной линией 524нм - 540нм. Из Рис. 5.2 очевидно, что при больших концентрациях резоруфина, пик флуоресценции смещается в красную область, что связано с эффектом перепоглощения. Тем не менее, очевидно, что такой эффект малозначителен для первых трех спектров, которые сняты с образцов до 0.04 [мМ], что говорит о том, что зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации резоруфина при концентрации резоруфина ниже 0.04 [мМ] близка к линейной. Для более высоких концентраций резоруфина такая зависимость нелинейна.
