Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 9
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Флуоресцентная диагностика (физические принципы) 14
1.2. Основные хромофоры 17
-
Триптофан . 18
-
Тирозин 19
-
Фенилаланин . 19
-
Вклад различных аминокислот в флуоресценцию белка 21
-
Коллаген и эластин 23
-
Пиридоксин и липопигменты 25
1.2.7.NADHuFAD, 26
1.3. Влияние оптических свойств ткани на спектры ЛИФ 30
-
Поглощение. 30
-
Рассеяние. 35
-
Фотовыцветание 38
-
Применение ЛИФ для идентификации состояния различных
биологических тканей. Известные спектры ЛИФ 41
1.5. Постановка задачи 45
ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 48
-
Измерение спектров путем сканирования 48
-
Многоканальная система регистрации спектров 53
-
Измерение глубины проникновения лазерного излучения в образцы биотканей 59
-
Исследование жизнеспособности миокарда с помощью флуоресцентных красителей 61
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ
ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИФ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ВЕЩСТВ И ТКАНЕЙ ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ ЛАЗЕРАМИ С
ДЛИНАМИ ВОЛН 248,308 И 337 НМ 62
-
лиф биологических тканей и веществ 62
-
Влияние лазерного излучения на исследуемое вещество 68
-
Измерение спектров ЛИФ с помощью многоканальной системы регистрации. Влияние лазерного излучения 72
-
Исследование глубины проникновения лазерного излучения в ткань миокарда 76
-
Обсуждение 78
ГЛАВА 4. ЛИФ КАЛЬЦИНИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ СЕРДЦА. ..80
4.1. Исследуемые образцы 80
-
Экспериментальные результаты 82
-
Обсуждение 84
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ С
ПОМОЩЬЮ ЛИФ 90
-
Исследуемые образцы 90
-
Сравнение различных методик постановки экспериментов
по определению жизнеспособности биологических тканей с
помощью ЛИФ 92
5.2.1. Исследования спектров ЛИФ тканей различной
жизнеспособности с помощью сканирующей системы.'. 92
5.2.2 Исследования спектров ЛИФ тканей различной
жизнеспособности с помощью многоканальной системы 94
-
Ткани кролика 94
-
Ткани свиньи 97
-
Обсуждение 103
5.3. Исследование ЛИФ ткани миокарда по мере снижения ее
жизнеспособности 104
-
Возбуждение эксимерным КгF лазером \—24Н нм 104
-
Контроль эюизнеспособности с помощью флуоресцентных зондов. 107
-
Возбуждение азотным лазером нм ПО
-
Обсуждение. 113
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
Введение к работе
Развитие фундаментальных исследований в области создания лазерных источников, изучение их влияния на биологические объекты открывает новые широкие перспективы использования лазеров в биологии, в экспериментальной и практической медицине. Лазерные технологии уже нашли свое применение в клинической практике. Они используются в хирургии для проведения ангиопластики [3, 45, 55, 56, 60, 64 73], хирургического лечения аритмии [73], операций на суставах [34]. Общеизвестно применение лазерных технологий в офтальмологии [52]. Опыт работы исследователей в последние годы показал, что лазер может быть использован для терапевтического лечения сложных заболеваний, таких как ревматоидный артрит [7, 31], и в онкологии [9, 29, 61]. Лазерные методы диагностики перспективны для определения наличия степени склероза и кальциноза сосудов [8, 17, 22], диагностики новообразований в желудочно-кишечном тракте [74] и дыхательных путях [87].
Метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) широко используется в медико-биологических исследованиях. В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминесцировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения [90, 92, 93, 104, 105]. Люминесцентный метод исследования белков позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики и др. [92]. Лазерно-индуцированная флуоресценция может быть использована в диагностике большого числа заболеваний. [104, 105]. Использование в качестве источника возбуждения ультрафиолетового излучения позволяет изучать люминесценцию в широком спектральном интервале, наблюдать перестройку спектров ЛИФ при развитии патологических изменений. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком [16, 21, 28, 33, 40, 48, 50, 62, 66, 81, 83, 89], отличать нормальную аорту от больной атеросклерозом [3, 8, 15, 17, 18, 19, 23, 24,45,47, 55, 56, 59, 60, 64]. В большинстве работ для возбуждения ЛИФ использовались лазеры с длиной волны больше 280 нм. Флуоресценция, индуцированная излучением с меньшей длиной волны, изучена мало, хотя использование коротковолновых источников света потенциально позволяет наблюдать флуоресценцию от большего числа компонентов. Например в работе [97] была продемонстрирована возможность использования ЛИФ возбуждаемой >^=248нм для идентификации тканей клапанов сердца, пораженных кальцинозом.
Источником излучения, возбуждающего люминесценцию, могут быть эксимерные лазеры. Применение метода лазерно- индуцированной флуоресценции, возбуждаемой излучением эксимерных лазеров, для исследования биологических тканей началось в конце 80-х годов, что соответствует этапу клинического внедрения этих систем в кардиологическую и офтальмологическую практику. Основное направление применения ЛИФ связано с созданием контролирующих систем, которые во время операции по лазерной абляции тканей с высокой плотностью энергии должны дифференцировать по спектрам ЛИФ патологически измененные и здоровые структуры и предотвращать повреждение тканей, не являющихся предметом оперативного вмешательства [45, 55, 56, 60, 64, 73]. В ряде исследований показано, что ЛИФ может вызываться при световом воздействии на ткани с невысокой плотностью энергии, что практически не вызывает какого-либо существенного повреждения тканей [36].
Одним из достоинств лазерных методов диагностики является их скорость. Возможность проводить экспресс-диагностику особенно актуальна в трансплантологии. Важным фактором, влияющим на успех трансплантации, является оценка жизнеспособности донорских тканей или органов, используемых для пересадки. Исходное неудовлетворительное состояние тканей донорского сердца является причиной 15-20% смертей при выполнении операции трансплантации [32]. Кроме того, в мире ежедневно проводится около 100 кардиохирургических операций с использованием криосохраненных сердечных структур (аллографтов), банки хранения которых постоянно увеличиваются. Это обусловлено, прежде всего, расширением показаний для их использования при лечении больных с пороками сердца и сосудов. Указанная тенденция требует проведения контроля жизнеспособности сохраненных и восстановленных тканей перед операцией. К сожалению, системы оценки качества аллографтов до настоящего времени нет. Сегодня для оценки жизнеспособности графта в эксперименте используется биопсия и исследование образца различными гистологическими и гистохимическими методами. Так с помощью флуоресцентных зондов проводится оценка редокс потенциала, уровня свободных радикалов в клетках, уровня АТФ, фрагментации ДНК, свидетельствующей о гибели клеток. Однако все перечисленные методы инвазивны для графта и их проведение требует множества дополнительных и часто длительных процедур, что делает эти методы малопривлекательными для реальной практики. В связи с этим разработка новых методов объективной оценки состояния донорских тканей является актуальной и необходимой.
Кроме качества аллографта, не меньшее значение имеет и состояние тканей реципиента. Известно, что многие патологические процессы в сердце различного генеза, сочетаются с минерализацией (кальцинозом) тканей, что особенно актуально для больных пороками сердца. Проведение любых хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженного кальцинозом, может сопровождаться фрагментированием тканей, что, в свою очередь, является предпосылкой такого грозного послеоперационного осложнения, как материальная эмболия. Процесс минерализации клапанов сердца является лимитирующим фактором пластической кардиохирургии. Именно степень минерализации клапанного эндокарда и параклапаниых структур во многом определяет прогноз для лечения и жизни пациентов. Поэтому быстрая и своевременная интраоперационная диагностика фрагментов кальцинированных тканей в полости сердца может способствовать профилактике этого осложнения.
В свете изложенного, перспективным представляется разработка метода быстрой и точной диагностики состояния тканей сердца с использованием методов, основанных на применении лазерного излучения.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность темы диссертации.
Диагностика наличия патологий и жизнеспособности тканей сердца, используемых для пересадки, является очень актуальной проблемой в трансплантологии. К сожалению, в настоящее время нет системы оценки качества трансплантатов. Использование ЛИФ может быть перспективным для разработки методов, которые позволят быстро и надежно определять состояние множества типов биологических тканей, однако для решения данной проблемы в кардиологии он практически не применялся.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы было исследование возможностей лазерной флуоресцентной спектроскопии для определения состояния тканей сердца. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Исследование спектров флуоресценции аминокислот, составляющих животные белки, различных биологических субстанций и здоровых тканей (аорты, клапанов сердца, и.т.д.) при возбуждении ультрафиолетовым излучением эксимерного лазера с А.=248 нм, определение характеристических спектральных полос этих веществ и тканей для данной длины волны возбуждения.
Исследование влияния лазерного облучения Х=248 нм на биологические ткани по динамике изменения их спектров ЛИФ в зависимости от дозы облучения. Определение параметров лазерного излучения, не повреждающего клетки и ткани, но позволяющего судить об их состоянии.
Исследование ЛИФ здоровых и кальцинированных тканей сердца человека для определения потенциала метода применительно к диагностике степени минерализации тканей, а также для выяснения вклада органических и минеральных компонент в спектр.
Исследование зависимости спектральных характеристик тканей сердца от степени их жизнеспособности, обусловленной сроками и условиями хранения. Сравнение результатов, полученных методом ЛИФ с данными рутинной клинической гистологии и гистохимии.
Научная новизна полученных результатов.
Были получены следующие новые научные результаты:
Показано, что под воздействием УФ излучения с длиной волны меньше 280 нм, а именно излучения эксимерного лазера с Л=248 нм, у широкого набора биологических веществ наблюдается флуоресценция. Причем спектры флуоресценции специфичны для каждого вида тканей и веществ. Определены основные флуорофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения. Приведенные данные доказывают перспективность применения ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для идентификации состава биологических тканей, регистрации их состояния и наличия изменений.
Показаны тканеспецифические изменения спектра ЛИФ под воздействием УФ излучения Х=248 нм, используемого для возбуждения ЛИФ. Исследована зависимость скорости происходящих изменений от энергии возбуждающего излучения. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана. Установлена доза, при которой изменения спектра ЛИФ, происходящие в ткани под воздействием лазерного излучения, не превышают разброса данных при измерении.
Обнаружено, что спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцинозом, и макроскопических кальцинозных образований, добытых из резецированных клапанов сердца, отличаются от спектров здоровых тканей. Показано, что изменение спектра ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, обусловлено появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксилапатита.
Обнаружено, что в процессе хранения миокарда свиньи в физиологическом растворе при различных температурах его спектры ЛИФ, возбуждаемые эксимерным лазером с А,= 248 нм и азотным с Х= 337 нм, претерпевают изменения. Скорость спектральных изменений ЛИФ зависит от температуры хранения ткани. Сравнение результатов ЛИФ измерений с данными гистологического анализа с использованием флуоресцентных красителей показало, что наблюдаемые изменения ЛИФ связаны с жизнеспособностью ткани.
Практическая значимость полученных результатов.Достаточно большое отличие спектров минерализованного и нормального клапанов, характеризуемое отношением интенсивности ЛИФ на длинах волн 330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценции на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца. Изменение спектров ЛИФ в процессе хранения тканей может использоваться для малоинвазивного быстрого контроля жизнеспособности трансплантатов непосредственно перед операцией, а также в ее процессе.
На защиту выносятся:
Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ различных биологических субстанций и тканей, показывающие перспективность применения лазера с Л=248 нм для определения их состояния.
Результаты измерения и анализа влияния УФ излучения Х=248 нм на биологические ткани, показывающие малую инвазивность метода ЛИФ при определенных параметрах.
Методика диагностики степени поражения клапана сердца кальцинозом, которая может быть использована при операциях на открытом сердце, например, при лазерной абляции кальцификатов. Преимуществами ЛИФ метода являются скорость и возможность использования в качестве обратной связи при пластической хирургии,
Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ миокарда свиньи в процессе хранения. Обнаружено, что снижение жизнеспособности миокарда вызывает изменения его спектров ЛИФ, что может быть использовано для определения пригодности трансплантатов.
Достоверность результатов.
Полученные с использованием лазера с А,=248 нм спектры вписываются в общую картину формирования спектров ЛИФ наблюдаемую другими исследователями при использовании других длин волн возбуждающего излучения. Частные случаи спектров ЛИФ при возбуждении Х-ЪЪ1 нм, совпадающие по условиям измерений, совпадают с результатами других авторов.
Апробация работы.
Основные результаты докладывались на международных конференциях: по методам аэрофизических исследований ICMAR-96, атомным и молекулярным импульсным лазерам AMPL-99, лазерным технологиям LAT-2002, лазерной метрологии LM-2002, лазерной оптики LO-2003, биотехнологии Progress in the biotechnology and neurobiology - integrative medicine- 2004.
Публикации.
Основные результаты опубликованы в трудах международных конференций [42, 49, 100, 103], рецензируемых журналах [44, 94, 95, 96, 97, 98], патенте [101].
Личный вклад.
Работа выполнена в Институте теоретической и прикладной механики СО РАН в 1996-2003 гг. В процессе работы соискатель подготовил экспериментальные установки, написал соответствующее программное обеспечение для автоматизации, участвовал во всех экспериментах, лично обрабатывал результаты, участвовал в написании публикаций.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, пяти глав, выводов и списка литературы. Диссертация занимает 134 страницы, содержит 54 иллюстрации и список из 105 литературных источников.
