Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Особенности патогенеза и прогноза злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия, плоскоклеточных карцином головы и шеи 19
1.1.1. Рак почки, особенности патогенеза и прогноза 20
1.1.2. Рак мочевого пузыря, особенности патогенеза и прогноза 23
1.1.3. Рак эндометрия, особенности патогенеза и прогноза 26
1.1.4. Плоскоклеточные карциномы головы и шеи, особенности патогенеза и прогноза 28
1.2. Внутриклеточные протеасомная и кальпаиновая протеолитические системы, их взаимосвязь 30
1.2.1. Протеасомная система 31
1.2.2. Кальпаиновая система 34
1.2.3. Взаимосвязь систем деградации белков в клетке 36
1.2.4. Роль протеасомной системы в молекулярном патогенезе злокачественных новообразований 37
1.2.5. Роль кальпаинов в развитии злокачественных новообразований...41
1.3. Транскрипционные и ростовые факторы, их роль в развитии злокачественных новообразований 43
1.3.1. Транскрипционный фактор NF-кВ, его роль в онкогенезе 44
1.3.2. Транскрипционный фактор HIF, его связь с развитием онкологических заболеваний 46
1.3.3. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), его роль в патогенезе онкологических заболеваний 49
1.3.4. Система инсулиноподобных факторов роста и металлопротеиназа РАРР-А, их роль в патогенезе онкологических заболеваний 56
1.4. Регуляция содержания транскрипционных и ростовых факторов внутриклеточными протеиназами при раке почки, мочевого пузыря, раке
эндометрия и плоскоклеточных карциномах головы и шеи 53
Заключение к обзору литературы 58
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 61
2.1. Материал исследования 61
2.1.1. Клиническая характеристика больных раком почки 61
2.1.2. Клиническая характеристика больных раком мочевого пузыря 63
2.1.3. Клиническая характеристика больных раком эндометрия 65
2.1.4. Клиническая характеристика больных плоскоклеточными карциномами области головы и шеи 66
2.2. Методы исследования 67
2.2.1. Определение тотальной активности протеасом и активности пулов протеасом 67
2.2.2. Определение активности кальпаинов 68
2.2.3. Определение субъединичного состава протеасом методом Вестерн-блоттинг 69
2.2.4. Определение содержания транскрипционных факторов HIF-la и NF-кВ (р50 и р65 форм) 70
2.2.5. Определение содержания ростовых факторов VEGF, ИФР-І, ИФР-И, белков связывающих ИФР IGFBP-3, IGFBP-4 и металлопротеиназы РАРР-А 71
2.2.6. Определение содержания белка по методу Лоури 72
2.2.7. Статистическая обработка результатов 73
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 75
3.1. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии рака почки, в регуляции содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF 75 3.1.1. Активность протеасом, их субъединичный состав в ткани рака почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания...75
3.1.2. Активность кальпаинов в ткани рака почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 81
3.1.3. Взаимосвязь между активностями внутриклеточных протеиназ в ткани рака почки 83
3.1.4. Экспрессия транскрипционного фактора NF-кВ В ткани рака почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 85
3.1.5. Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 и ростового фактора VEGF при раке почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 87
3.1.6. Взаимосвязь между экспрессией транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-la и ростового фактора VEGF при раке почки 89
3.1.7. Протеолитическая регуляция содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке почки 90
3.1.8. Прогностическая значимость определения показателей внутриклеточного протеолиза, экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке почки 93
3.1.9. Создание прогностической модели развития гематогенных метастазов при раке почки 101
3.2. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии рака мочевого пузыря, в регуляции содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF 103
3.2.1. Активность протеасом и их субъединичный состав в ткани рака мочевого пузыря, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 103
3.2.2. Активность кальпаинов в ткани рака мочевого пузыря, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания НО
3.2.3. Взаимосвязь между активностями внутриклеточных протеиназ в ткани рака мочевого пузыря 112
3.2.4. Экспрессия транскрипционного фактора NF-KB В ткани переходноклеточного рака мочевого пузыря, связь с клинико- морфологическими параметрами заболевания 113
3.2.5. Экспрессия транскрипционного фактора HIF-lot и ростового фактора VEGF при раке мочевого пузыря, связь с клинико- морфологическими параметрами заболевания 117
3.2.6. Взаимосвязи между экспрессиями транскрипционных факторов NF- KB р65, NF-KB р50, HIF-lot и ростового фактора VEGF при раке мочевого пузыря 120
3.2.7. Протеолитическая регуляция содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке мочевого пузыря 121
3.2.8. Прогностическая значимость определения показателей внутриклеточного протеолиза, экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке мочевого пузыря 125
3.3. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии рака эндометрия, в регуляции содержания транскрипционных факторов, ростового фактора VEGF и компонентов инсулиноподобных факторов роста 132
3.3.1. Активность протеасом, их субъединичный состав в ткани рака эндометрия, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания и рецепторным статусом опухоли 132
3.3.2. Активность кальпаинов при раке эндометрия, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 145
3.3.3. Взаимосвязь между активностями внутриклеточных протеиназ в ткани рака эндометрия 147
3.3.4. Экспрессия транскрипционного фактора NF-кВ в ткани рака эндометрия, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания и рецепторным статусом опухоли 148
3.3.5. Экспрессия транскрипционного фактора FQF-1 и ростового фактора VEGF в ткани рака эндометрия, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания и рецепторным статусом опухоли 154
3.3.6. Содержания инсулиноподобных факторов роста, их связывающих белков и металлопротеиназы РАРР-А в ткани рака эндометрия 158
3.3.8. Взаимосвязь между экспрессиями транскрипционных и ростовых факторов в ткани рака эндометрия 159
3.3.7. Протеолитическая регуляция содержания транскрипционных и ростовых факторов в ткани рака эндометрия 161
3.3.9. Прогностическая значимость определения показателей внутриклеточного протеолиза, экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке эндометрия 168
3.4. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии плоскоклеточных карцином головы и шеи, в регуляции содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF 174
3.4.1. Активность протеасом, их субъединичный состав в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, связь с клинико- морфологическими параметрами заболевания 174
3.4.2. Активность кальпаинов в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 183
3.4.3. Взаимосвязь между активностями внутриклеточных протеиназ в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи 186
3.4.4. Экспрессия транскрипционного фактора NF-кВ в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, связь с клинико- морфологическими параметрами заболевания 187
3.4.5. Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 и ростового фактора VEGF в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания 191
3.4.6. Взаимосвязь между экспрессиями транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи 193
3.4.7. Протеолитическая регуляция содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи 194
3.4.8. Прогностическая значимость определения показателей
внутриклеточного протеолиза, экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи 198
3.4.9. Создание прогностической модели развития лимфогенных метастазов при плоскоклеточных карциномах головы и шеи 206
ГЛАВА 4. Обсуждение 210
4.1. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака почки 211
4.2. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака мочевого пузыря 218
4.3. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака эндометрия 223
4.4. Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе плоскоклеточных карцином головы и шеи 233
Заключение 239
Выводы 244
Го актические рекомендации 247
Список литературы
- Внутриклеточные протеасомная и кальпаиновая протеолитические системы, их взаимосвязь
- Клиническая характеристика больных плоскоклеточными карциномами области головы и шеи
- Роль внутриклеточных протеиназ в развитии рака мочевого пузыря, в регуляции содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF
- Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака эндометрия
Введение к работе
Актуальность темы. Онкологические заболевания являются важной медико-социальной проблемой современной России. В настоящее время отмечен неуклонный рост заболеваемости данной патологией среди лиц трудоспособного возраста, приводящий к ранней инвалидизации и увеличению уровня смертности среди них. Достаточно высокий удельный вес в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России занимают плоскоклеточные опухоли головы и шеи (4,4%), рак тела матки (3,8%), почки (3,6), мочевого пузыря (2,7%). Злокачественные новообразования тела матки (7,1%) занимают второе место в структуре онкологической патологии женских репродуктивных органов, уступая лишь опухолям молочной железы [Чиссов В.И., 2012].
Рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, преобладание распространенных форм данной патологии ставит перед фундаментальной онкологией новые задачи по поиску оптимальных маркеров опухолевого роста, прогрессирования заболевания, а также значимых прогностических показателей. Одним из перспективных подходов является изучение систем внутриклеточного протеолиза [Yamasaki L. et al, 2004; Lah T.T. et al, 2006]. Существуют данные, которые показывают, что протеолиз обеспечивает такие важные процессы, определяющие опухолевый рост как пролиферативная активность, апоптоз, регуляция неоангиогенеза, функционирование иммунной системы и индукция лекарственной резистентности [Lah T.T. et al, 2006; Dahlmann B., 2007; Sharova N., 2011].
Основными компонентами внутриклеточного протеолиза являются протеасомная и кальпаиновая системы [Немова Н.Н, 2010; Шарова Н.П., 2011; Frisan T., 1998; Almond J.B., 2002; Arlt A., 2009]. Нарушение в функционировании протеасомного комплекса имеет большое значение в развитии онкологических заболеваний различных локализаций, в частности, толстой кишки, легких, молочной железы и др. [Erlanson M., 2001; Hayashi H., 2001; Li J.Q., 2001; Barnes C. J., 2005; Ducoux-Petit M et al., 2008; Pan J., 2010]. Однако эти факты, в основном, носят экспериментальный характер и получены на культурах клеток. В экспериментальных условиях показана апоптотическая гибель раковых клеток эндометрия при применении ингибитора протеасом - бортезомиба [Dolcet X., 2006]. Изучение тканей опухолей показало, что прогрессирование злокачественных новообразований почки и мочевого пузыря тесно связано с изменением состояния протеасом и уровня убиквитинированных белков [Dahlmann B., 2007]. Активность протеасом в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, ее связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания не изучена.
Системы внутриклеточного протеолиза находятся в тесной связи друг с другом. Предполагается, что кальпаины способствуют изменению структуры белков, что делает их восприимчивыми для дальнейшего протеасомного расщепления [Jang J.S., 1999]. Выявлена заместительная роль кальпаинов в процессах протеолиза белков в клетке в отсутствии необходимого количества протеасом, а также при угнетении их ферментативной активности [Smith I.J., 2007; Sorimashi, 2011]. Разрушение и модификация белков при помощи внутриклеточных протеиназ имеет огромное значение в жизнедеятельности клетки. Их субстратами выступают многие регуляторные белки, среди которых наиболее важны транскрипционные и ростовые факторы, их рецепторы и белки сигнальных систем.
В настоящее время, несмотря на изучение роли внутриклеточных систем протеолиза в развитии патологических состояний, отсутствуют данные об их особенностях при развитии злокачественных новообразований различного происхождения. Имеются единичные сведения о связи ростовых и транскрипционных факторов с внутриклеточным протеолизом [Su Y., 2006; An J., 2007]. В целом, аспект протеолитической регуляции экспрессии ростовых и транскрипционных факторов, которые определяют возникновение и прогрессирование злокачественных опухолей, не исследован. Учитывая важную роль внутриклеточных протеолитических систем и регулируемых ими ростовых и транскрипционных факторов в патогенезе рака, важным практическим приложением работы является разработка новых молекулярных маркеров прогноза течения онкологических заболеваний.
Цель исследования. Изучение роли внутриклеточных протеиназ в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи с определением их прогностической значимости.
Задачи исследования:
-
Изучить химотрипсинподобную активность протеасом, их субъединичный состав и активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия, плоскоклеточными карциномами головы и шеи, сопоставить изучаемые показатели с соответствующими значениями неизмененных тканей.
-
Изучить экспрессию транскрипционных факторов NF-kB (р50 и р65), HIF-1a и содержания ростового фактора VEGF в тканях опухолей почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи.
-
Определить экспрессию инсулиноподобных факторов роста (ИФР-I, ИФР-II), их связывающих белков и металлопротеиназы PAPP-A в ткани рака эндометрия.
-
Изучить взаимосвязи активности внутриклеточных протеиназ с экспрессией ростовых и транскрипционных факторов в тканях злокачественных новообразований для выяснения патогенетических механизмов опухолевой прогрессии.
-
Оценить взаимосвязь изучаемых молекулярных показателей с клинико-морфологическими параметрами заболевания у больных злокачественными новообразованиями.
-
Оценить прогностическую значимость компонентов внутриклеточных протеолитических систем у изучаемого контингента больных.
-
Разработать математические модели прогноза риска развития гематогенных метастазов у больных раком почки и лимфогенных метастазов у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.
Научная новизна
Впервые исследована химотрипсинподобная активность протеасом, их субъединичный состав, а также активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточным раком головы и шеи. Выявлено тканеспецифичное изменение активности, субъединичного состава протеасом и активности кальпаинов в опухолях различных локализаций, а именно, повышение активности протеасом и кальпаинов в опухолях мочевого пузыря, в плоскоклеточных карциномах головы и шеи по сравнению с окружающей условно нормальной тканью, повышение активности протеасом в тканях рака эндометрия и снижение этих показателей в ткани рака почки. Изменения активности протеасом связаны с изменением экспрессии субъединиц протеасом.
Получены принципиально новые сведения о зависимости изучаемых показателей от клинико-морфологических параметров заболевания. Показано, что развитие гематогенных метастазов у больных раком почки связано со снижением активности протеасом и возрастанием активности кальпаинов в первичной опухоли, что сопровождается увеличением содержания ядерных факторов NF-kB p65, HIF-1 и ростового фактора VEGF. У больных раком мочевого пузыря увеличение глубины инвазии опухоли приводит к повышению активности 26S протеасом, кальпаинов, а также к снижению экспрессии транскрипционного фактора NF-kBр50. При мере увеличения стадии рака эндометрия наблюдалось повышение активности 20S протеасом и кальпаинов. Рецепторный статус опухоли эндометрия ассоциирован с активностью протеасом, а также с экспрессией транскрипционного фактора NF-kBp50. У больных ПКГШ с увеличением стадии заболевания наблюдается повышение активности протеасом и кальпаинов, которое сопровождается изменением содержания транскрипционного фактора NF-kB р50.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты расширяют представления о роли протеасомной и кальпаиновой систем в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи. Показано, что в исследованных опухолевых тканях активность протеасом и кальпаинов коррелирует с экспрессией транскрипционных факторов NF-kB и HIF-1, что подтверждает возможность регуляции этих биологически важных молекул системами внутриклеточного протеолиза. В опухолях эндометрия другим важным протеолитическим регулятором содержания факторов роста ИФР-I, VEGF и ядерного фактора HIF-1 является металлопротеиназа PAPP-A.
Выявлена прогностическая значимость определения активности протеасом для оценки безметастатической и общей выживаемости больных раком почки, а также общей выживаемости больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Безметастатическая выживаемость больных опухолями головы и шеи ассоциирована с экспрессией транскрипционных факторов NF-kB p65, NF-kB p50 и HIF-1a. На основании полученных данных методом многомерной статистики построена модель прогнозирования развития гематогенных метастазов рака почки и лимфогенных метастазов плоскоклеточных карцином головы и шеи.
Положения, выносимые на защиту
-
Химотрипсинподобная активность протеасом и кальпаинов в опухолях мочевого пузыря и плоскоклеточных раков головы и шеи значительно превышает соответствующий показатель в условно нормальной нетрансформированной окружающей опухоль ткани, для пациенток с опухолями эндометрия характерно увеличение только активности протеасом. У больных раком почки активность внутриклеточных протеиназ снижена. Повышение активности протеасом тесно связано с их субъединичным составом, а именно, с увеличением содержания иммунных и 20S активированных форм.
-
Об участии протеасом и кальпаинов в регуляции транскрипционных и ростовых факторов свидетельствуют взаимосвязи между активностью протеасом, их пулов, активностью кальпаинов и экспрессией транскрипционных факторов NF-kB, HIF-1a и ростового фактора VEGF у больных раком почки, мочевого пузыря и с ростовым фактором ИФР-I у пациенток с опухолями эндометрия. Кроме того, в опухолях эндометрия показана ассоциация между экспрессией металлопротеиназы РАРР-А и содержанием HIF-1a и ИФР-I.
-
Активность протеасом ассоциируется с безрецидивной выживаемостью больных раком мочевого пузыря, безметастатической выживаемостью больных раком почки, а также общей выживаемостью пациентов с опухолями почки и плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Возникновение локорегионарных рецидивов при раке эндометрия зависит от субъединичного состава протеасом. Экспрессия транскрипционных факторов NF-kB p65, NF-kB p50 и HIF-1a связана с прогнозом рецидивирования рака мочевого пузыря и безметастатической выживаемостью больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены и обсуждены на Российских научно-практических конференциях с международным участием, г. Барнаул, 2007-2009; конференции молодых специалистов - онкологов Уральского федерального округа, г. Челябинск: 2008г.; III-VIII конференциях молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева г. Томск, 2008-2013; III Конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», г. Сочи, 2009 г; Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития», г. Томск, 2009г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г. Казань 2009 г.; VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Душанбе, 2010 г.; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011 г.; 8-й конференции по фундаментальной онкологии, ФГБУ НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург, 2012г.; 11-й Всероссийской конференции молодых ученых, г. Москва, 2011г.; 17th International meeting of the European society of gynaecological oncology (ESGO) Milan, Italy, 2011г.; Седьмом съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Астана, 2012г.;
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 08-04-00616, а также Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (Государственный контракт №П320). По итогам исследования оформлено 1 ноу-хау «Новая мишень таргетной терапии злокачественных новообразований различных локализаций» (ноу-хау №2 от 01.10.2012).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 45 печатных работах, в том числе 22 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в обучении студентов и клинических ординаторов при изучении вопросов, посвященных патогенетическим аспектам, диагностике и лечения онкологических заболеваний различных локализаций на кафедре онкологии ГБОУ «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 308 страницах и иллюстрирована 24 рисунками и 93 таблицами. Библиография включает 351 литературных источников, из которых 21 отечественных и 334 иностранных.
Личный вклад автора. Анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели, задач, выбор методов исследования, его проведение, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.
Внутриклеточные протеасомная и кальпаиновая протеолитические системы, их взаимосвязь
Заболеваемость раком почки в настоящее время неуклонно растет, что связано как с улучшением диагностики новообразований данного органа, так и с ростом истинной заболеваемости [176]. Ежегодно в мире регистрируется около 230 тыс. новых случаев рака почки (РП) и более 100 тыс. летальных исходов. В России показатели заболеваемости данным видом опухоли возросли с 1998 по 2008 г. с 9,0 до 12,2 на 100 тыс. населения. Среднегодовой темп прироста РП составляет 1,62% и занимает третье место по данному критерию среди всех новообразований после опухолей головного мозга и меланомы кожи [10]. Заболевание характеризуется отсутствием ранних симптомов, поздней клинической манифестацией и резистентностью к лучевой и химиотерапии. Основной причиной летальности при опухолях почки являются отдаленные метастазы, механизм развития которых исследован недостаточно.
Большинство опухолей почки представлено светлоклеточным почечноклеточным раком. В канцерогенезе светлоклеточных карцином наиболее характерным событием является инактивация гена VHL (von Hippel-Lindau syndrome). Ген VHL (von Hippel-Lindau) кодирует белок VHL -один из компонентов ЕЗ лигазы [133, 320], которая в условиях нормы присоединяет убиквитины к транскрипционному фактору HIF-la и способствует его дальнейшей деградации в протеасомах [331]. Дефектная убиквитин ЕЗ лигаза не связывается с транскрипционным фактором, который, в свою очередь, не подвергается расщеплению и накапливается в клетках, результатом чего является рост продукции ангиогенных факторов, среди которых основное значение имеет ростовой фактор VEGF [150, 177, 328, 196].
Для почечноклеточного рака в настоящее время определены следующие прогностические факторы как TNM стадия, ECOG статус (Estern Cooperative Oncology Group), градация по Фурману, гистологический тип опухоли, уровень гемоглобина и активность лактатдегидрогеназы [257]. Однако на данный момент времени с развитием таргетнои терапии рака почки существует ряд дополнительных показателей, эффективность которых еще не определена. К ним относятся HIF-зависимые факторы (HIF-1 - nuclear hypoxia inducible factor, CAIX - carbonic Anhydrase IX, VEGF/VEGFR), факторы клеточной адгезии (кадхерин Е), маркеры пролиферации (Кі-67, МСМ-2; р27, циклины), сигнальные молекулы mOR пути (PTEN, Akt), белки, связанные с апоптозом (р53, bcl-2) [224]. В оценке прогноза для рака почки характерно комплексное применение молекулярных и клинико-морфологических показателей. Kim et al. (2004) применял молекулярные показатели в комбинации с существующими прогностическими факторами [332]. В результате проведенного исследования была сформирована прогностическая модель, включающая следующие молекулярные и клинические показатели как CAIX, р53, TNM, статус ECOG. Однако эффективность ее применения до сих пор не оценена.
Активация ангиогенеза имеет большое значение для светлоклеточного почечноклеточного рака. К значимым факторам ангиогенеза для данной патологии относят плотность микрососудов в опухоли. Известно, что его « выраженность отражает интенсивность процесса метастазирования и связана с экспрессией транскрипционного фактора, активируемого гипоксией (HIF-1) и ростового фактора VEGF [139]. Ряд исследователей показывают, что увеличение экспрессии ядерного фактора HIF-1 сочетается с ростом уровня VEGF в ткани рака почки, коррелирует с размером опухоли, TNM стадией и прогнозом заболевания [111, 309].
Способность опухолевых клеток к росту и распространению в организме связана с разрушением экстраклеточного матрикса матриксными металлопротеиназами. В исследованиях Miyta Y. показано, что совместное исследование количества микрососудов в ткани рака и уровня экспрессии матриксной металлопротеиназы-2 позволяет оценить размеры опухоли [105]. Данный факт указывает на сложный характер процессов роста и развития опухоли, несомненными участниками которых являются белки внеклеточного матрикса.
Накопление ядерного фактора HIF-1 в опухоли является мощным стимулом для активации неоангигенеза. Кроме ростового фактора VEGF к ним относят трансформирующий фактор роста (TGF-a), основной фактор роста фибробластов (bFGF), а также рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) и др [47]. Известно, что содержание EFGR и TGF-a в почечноклеточных опухолях повышено, отмечена их связь с размером опухоли [240]. Экспрессия bFGF и его рецептора также связана со стадией заболевания и развитием метастазирования [159]. Кроме того, известна роль других белковых маркеров в развитии данной патологии. Так плацентарный фактор роста и тромбоспондин, по данным Matsumoto К., являются независимыми прогностическими факторами при развитии светлоклеточных почечноклеточных карцином [256]. Среди маркеров клеточного цикла значение для развития рака почки имеют белки р27 и циклин D1. Дефицит белка р27 найден в большинстве опухолей почки и может быть использован в качестве независимого фактора прогноза выживаемости больных [202].
В последние годы наблюдается накопление знаний и представлений о патогенезе рака почки. Развитие таргетной терапии и попытка ее широкого применения в современной онкологии позволяет выделить новые факторы развития заболевания [114]. Высокая частота выявления метастатического рака почки предрасполагает к поиску новых дополнительных маркеров прогноза заболевания, выживаемости больных, что в конечном итоге имеет своей целью применение индивидуального подхода в лечении данной категории больных.
Клиническая характеристика больных плоскоклеточными карциномами области головы и шеи
Выявлены положительные ассоциации между тотальной активностью протеасом, 26 S и 20 S пулов протеасом с содержанием LMP2 субъединицы протеасом. Активность 26S пула ферментов коррелировала с экспрессией активаторной частицы РА283.
В результате проведенного анализа обнаружена связь низкой активности протеасом и их пулов в ткани опухоли почки с недостаточной продукцией LMP2 субъединиц протеасом. Несмотря на то, что сила корреляционных связей была слабой (коэффициенты корреляции были равны 0,25; 0,26; 0,40), мы предположили, что активность протеасом при раке почки определяется уровнем экспрессии этой субъединицы, а также содержанием РА28 активаторного комплекса, продукция которого подвергается значительным изменением на разных этапах заболевания.
Таким образом, сниженная активность протеасом в опухоли коррелирует со структурными изменениями в составе протеасом. Увеличение общего количества ферментов сочетается с низким уровнем иммунной субъединицы LMP2 и активаторной частицы РА28 в их составе. При увеличении размеров опухоли наблюдаются волнообразные изменения экспрессии РА28Р и Rpt6 субъединиц протеасом. Наличие гематогенных метастазов опухоли почки сочетается с еще более выраженным снижением тотальной активности протеасом в первичной опухоли.
Активность кальпаинов в ткани рака почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания
Кальпаины играют важную роль в развитии опухолевых заболеваний. При раке почки обнаружено снижение активности этих ферментов в опухоли в 1,3 раза по сравнению с неизмененной тканью (таблица 6). Таблица 6 - Общая активность кальпаинов при раке почки, Me (Q1-Q3) п Общая активность кальпаинов 10 Ед/мг белка Неизмененная ткань п=31 49,1(31,3-78,7) Опухолевая ткань п=31 37,5 (18,6-74,0) Примечание: - значимость различий по сравнению с гистологически неизмененной тканью, р 0,05; На следующем этапе исследования была изучена зависимость активности кальпаинов от клинико-морфологических параметров заболевания (таблица 7). Выявлено изменение активности кальпаинов в опухоли, которое зависело от размера опухоли и наличия отдаленного метастазирования. Таблица 7 - Зависимость активности кальпаинов ткани опухоли почки от клинико-морфологических параметров заболевания Клинико-морфологические параметры п Активность кальпаинов в опухолевой ткани, 1000 Ед/мг белка - значимость различий по сравнению с группой больных со стадией Ti.3N0. 1М0; р 0,05; Обращает на себя внимание снижение активности кальпаинов при увеличении размеров первичной опухоли почки. Активность изучаемых энзимов падала в трансформированных тканях в группах больных с размером опухоли T3N0.iMo.i, T4N1M1 в 2,5; 4,0 раза, соответственно, по сравнению с пациентами со стадией заболевания TiN0M0.
Активность кальпаинов в опухоли имела противоположные изменения при локализованной и распространенной формах заболевания. У больных со стадией T2-4N1M1 активность ферментов была повышена в 1,3 раза по сравнению с больными с неметастазирующими опухолями (T1.3N0M0).
Таким образом, в ткани опухоли почки активность кальпаинов снижена. Выявленные изменения констатированы на ранних стадиях заболевания и при маленьких размерах опухоли. Рост опухоли приводит к снижению активности ферментов в трансформированных тканях.
Развитие отдаленного метастазирования со значительным увеличением активности кальпаинов в опухоли, вероятно, связано с реорганизацией актинового цитоскелета и увеличением подвижности опухолевых клеток. Известно, что регуляция этого процесса в тканях РП происходит при участии кальпаинов.
Взаимосвязь между активностями внутриклеточных протеиназ при раке почки Методом непараметрического корреляционного анализа были изучены зависимости между изучаемыми протеиназами и их пулами при РП с определением силы и значимости связи. В таблице 8 представлены данные о наличии корреляционных связей между активностью изучаемых внутриклеточных протеиназ. В ткани опухоли почки тотальная активность протеасом, активность 26S и 20S пулов протеасом взаимосвязаны друг с другом. В свою очередь активность кальпаинов также коррелировала как с активностью общего пула протеасом, так и с активностью 26S и 20S пулов.
Полученные данные свидетельствуют о наличии сопряженности между внутриклеточными протеолитическими системами при раке почки и подтверждают наличие тесной взаимосвязи между ними при развитии и прогрессировании опухоли. Активность протеасом и кальпаинов играет важную роль в возникновении отдаленных метастазов рака почки, что, вероятно, связано с формированием новых сосудов и регуляцией содержания онкогенов, белков-онкосупрессоров и компонентов сигнальных систем.
На следующем этапе работы была исследована связь основных внутриклеточных протеолитических системам с содержанием транскрипционных и ростовых факторов. 3.1.4.Экспрессия транскрипционного фактора NF-кВ В ткани рака почки, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания Пролиферация опухолевых клеток находится под контролем транскрипционного фактора NF-кВ, его экспрессия в опухолевой ткани светлоклеточного рака почки представлена в таблице 9. Изучено содержание NF-кВ р65, NF-кВ р50 и их соотношение, представленное в виде коэффициента NF-кВ р65/р50. Поскольку активной формой является димер NF-кВ р65 с р50, то в ткани опухоли почки выявлено преобладание активных форм фактора, о чем свидетельствует коэффициент NF-кВ р65/ р50, равный U.
Клинико-морфологические параметры заболевания отражают тяжесть патологического процесса и опосредованы содержанием важных факторов транскрипции, к числу которых относят NF-кВ (таблица 10). Выявлено отсутствие значимых различий в экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ р65 у больных с разным размером опухоли почки. В то же время, отмечен значительный рост продукции фактора NF-кВ р65 (в 3,2 раза) у больных с отдаленными метастазами заболевания по сравнению с локализованной формой рака почки. Содержание NF-кВ р50 субъединицы фактора при этом практически не изменялось. Преобладание активных форм фактора, связанное с повышенным содержанием NF-кВ р65, способствовало росту коэффициента коэффициент NF-кВ р65/ р50 в 5 раз у больных со стадией
Роль внутриклеточных протеиназ в развитии рака мочевого пузыря, в регуляции содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF
Экспрессия ядерного фактора NF-KBp65 практически не изменялась у больных при прогрессировании патологического процесса с 1а до II стадии. Обнаружено снижение продукции транскрипционного фактора NF-KB р50 в 4,5 раза и увеличение коэффициента NF-KB р65/ р50 в 2,2 раза у больных со II стадией заболевания по сравнению с 1а. Экспрессия ядерных факторов NF-кВ р65 и NF-кВ р50 повышалась с увеличением уровня гистологической организации опухоли. Так, в умеренно дифференцированных раках наблюдалась тенденция увеличения содержания NF-кВ р65 в 1,9 раза, а также статистически значимое повышение продукции ядерного фактора NF-кВ р50 в 2,6 и снижение коэффициента NF-кВ р65/р50 в 1,5 раза по сравнению низко дифференцированными опухолями. При высоко дифференцированном раке наблюдалось дальнейшее увеличение экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ р65, что было больше в 2,2 раза по сравнению с опухолями низкой степени дифференцировки. Наличие метаболического синдрома у больных с РЭ не оказывало влияния на содержание изучаемых ядерных факторов.
При изучении экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ В тканях РЭ в зависимости от рецепторного статуса выявлено, что в ER позитивных опухолях содержание ядерного фактора NF-кВ р50 снижалось в 1,5 раза по сравнению с ER негативными (таблица 56). При этом содержание фактора NF-кВ р65 практически не зависело от наличия ER рецепторов в опухоли. Данные изменения в уровнях изучаемых факторов связаны с увеличением коэффициента NF-кВ р65/ р50 на 0,9 условных единиц в группе больных с ER позитивными раками. Степень экспрессии ER в опухоли не влияла на уровень продукции транскрипционного фактора NF-кВ. Подобные изменения были выявлены в PR позитивных и негативных опухолях. В PR позитивных опухолях наблюдалось снижение содержания транскрипционного фактора NF-кВ р50 в 1,5 раза по сравнению с PR негативными. позитивными опухолями с низкой степенью экспрессии, р 005
Обнаружено увеличение экспрессии фактора NF-кВ р65 в опухолях, экспрессирующих PR, в 1,8 раза по сравнению с PR негативными. Выявленные изменения продукции изучаемого ядерного фактора способствовали увеличению коэффициента NF-кВ р65/ р50 в 2,1 раза в PR позитивных опухолях по сравнению с PR негативными. Степень экспрессии PR в позитивных опухолях была связана с экспрессией транскрипционного фактора NF-кВ. В группе больных с умеренной степенью экспрессии рецепторов PR в опухоли происходило снижение экспрессии NF-кВ р65 и NF-кВ р50 в 2,6 и 6,0 раза, соответственно, по сравнению с группой больных с низкой степенью экспрессии PR. Коэффициент NF-кВ р65/р50 при возрастании степени экспрессии PR с низкой до умеренной увеличивался в 5,6 раз. Стоит отметить, что в группе больных с выраженной степенью экспрессии PR различий экспрессии транскрипционных факторов NF-KBp65, NF-кВ р50 и соотношения NF-кВ р65/ р50 по сравнению с больными с низкой степенью экспрессии не выявлено.
Для изучения анализа связи степени экспрессии рецепторов ER и PR с уровнем продукции транскрипционных факторов NF-кВ р65 и NF-кВ р50 в опухоли был проведен непараметрический дисперсионный анализ. Была подтверждена связь содержания ядерного фактора NF-кВ р50 и коэффициента NF-кВ р65/ р50 со степенью экспрессии PR рецепторов (таблица 57). Прогрессирование РЭ и увеличение стадии заболевания связано со снижением экспрессии транскрипционного фактора NF-KBp50. В опухолях эндометрия снижение степени дифференцировки приводит к снижению содержания транскрипционных факторов NF-KBp50 и NF-KBp65 и ассоциировано с увеличением количества его активированных форм.
В ER и PR позитивных опухолях наблюдается уменьшение продукции NF-KBp50 на фоне незначительных изменений содержания ядерного фактора NF-KBp65 и сопровождается увеличением коэффициента NF-кВ р65/ р50. Увеличение количества PR рецепторов приводит к снижению обоих форм транскрипционного фактора.
Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 и ростового фактора VEGF в ткани рака эндометрия, связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания и рецепторным статусом опухоли
Развитие новых сосудов тесно связано с формированием инвазивного характера роста в опухолях эндометрии. В группе больных данной онкопатологией были изучены показатели экспрессии транскрипционного фактора HIF-la и содержания ростового фактора VEGF (таблица 58).
Большой интерес представляет изучение закономерностей экспрессии фактора транскрипции, активируемого гипоксией, и фактора роста сосудов у больных в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания (таблица 59). При разделении больных на группы с учетом стадии заболевания выявлено, что у больных с lb стадией заболевания экспрессия HIF-la и содержание VEGF увеличивались в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, по сравнению с группой больных с 1а стадией. Дальнейшее прогрессирование заболевания протекало на фоне снижения экспрессии ядерного фактора HIF-1, что сопровождалось еще большим увеличением содержания фактора роста сосудистого эндотелия. Так, у больных со II стадией заболевания экспрессия HIF- 1а снижалась в 1,9 раза по сравнению с больными с 1а стадией, а уровень продукции VEGF в этом случае повышался в 1,7 раза по сравнению с пациентками с 1а стадией. Уровень гистологической организации опухоли не влиял на содержание транскрипционного фактора HIF-1 и продукцию ростового фактора VEGF в опухоли эндометрия.
Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака эндометрия
Связи между активностью протеасом, кальпаинов и экспрессиями транскрипционных факторов NF-KB р50, NF-KB р65, HIF-la и содержанием VEGF в ткани ПКГШ представлены в таблице 87. Показано существование ассоциаций между тотальной активностью протеасом и экспрессией ядерного фактора NF-KB р65, а также между активностью 20S протеасом и содержанием транскрипционных факторов NF-кВ р50, NF-кВ р65. Известно, что 26S протеасомы участвуют в активации данного транскрипционного фактора. Возможно, в ткани ПКГШ активация фактора NF-кВ происходит при участии 20S протеасом.
Также показана, связь между активностью 20S протеасом и экспрессией ядерного фактора HIF-la в опухоли, которая была менее значимой (р=0,07). Активность кальпаинов в ткани ПКГШ не оказывала значимого влияния на содержание изучаемых показателей.
В ткани ПКГШ выявлено участие протеасом в регуляции содержания транскрипционного фактора NF-кВ, ЧТО связано с посттрансляционной модификацией полипептида р105 - предшественника NF-KBp50.
Также большое значение в этом процессе уделяется разрушению ингибитора 1кВ, что приводит к активации транскрипционного фактора NF-кВ. Вероятно, протеолитическая регуляция неоангиогенеза в ткани ПКГШ менее выражена. Роль кальпаинов в протеолизе изучаемых транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF для плоскоклеточных раков не выявлена.
Для анализа зависимости содержания изучаемых транскрипционных факторов от активности внутриклеточных протеиназ была рассчитана множественная нелинейная регрессия, результатом которой явилось создание коэффициентов регрессии и построение уравнения нелинейной квадратичной регрессии (таблица 88, 89).
Для оценки адекватности построенного уравнения и коэффициентов регрессии был проведен анализ остатков. Из-за малого числа наблюдений распределение остатков не вполне соответствует нормальному.
Примечание: Beta -стандартизованный коэффициент регрессии; В -нестандартизованный коэффициент регрессии; Std. Err. - ошибка стандартизованного и нестандартизованного коэффициента регрессии; р -уровень значимости;
Таблица 89 - Коэффициенты регрессии зависимости содержания транскрипционного фактора NF-кВ р65 от активности внутриклеточных протеиназ при ПКГШ
Таким образом, построено адекватное нелинейное квадратичное уравнение зависимости содержания транскрипционных факторов NF-кВ р50 и NF-кВ р65 от активности внутриклеточных протеиназ. В ткани ПКГШ рост тотальной активности протеасом (Beta=3,69) и снижение активности 20S пула протеасом (Beta= -0,55) влияет на увеличение экспрессии NF-кВ р65. Полученные величины коэффициентов регрессии свидетельствуют о преимущественном значении тотального пула протеасом, объединяющем эффекты обоих пулов ферментов, на содержание транскрипционного фактора NF-кВ р65. В свою очередь, в ткани ПКГШ 20S протеасомы стимулируют экспрессию NF-кВ р50 (Beta= 1,7). Данная ассоциация была также выявлена по результатам непараметрического корреляционного анализа и является отражением особенностей функционирования внутриклеточных протеиназ в условиях онкогенеза.
Прогностическая значимость определения показателей внутриклеточного протеолиза, экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи
Прогнозирование исходов онкологических заболеваний является важной задачей в практической онкологии. Склонность к раннему метастазированию данного вида рака во многом определяет его неблагоприятный прогноз. В этом разделе был проведен анализ прогностической значимости определения активности протеасом, их субъединичного состава и активности кальпаинов при ПКГШ с помощью теста Гехана-Вилкоксона и log рангового критерия для оценки безрецидивной, безметастатической и общей выживаемости. В качестве порогового значения для разделения больных на подгруппы служили средние значения показателей. Показатели выживаемости оценивали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера.
Как следует из таблицы 90, наибольшую информативную ценность для общей выживаемости больных имели показатели активности протеасом. Следует отметить, что состав исследуемых групп больных в зависимости от порогового уровня показателей сопоставим по стадиям онкологического процесса. Имеющие различия в группах статистически не значимы, что позволило провести анализ выживаемости больных с учетом выбранного уровня показателей в ткани опухоли (таблица 91).
На основании проведенного анализа был выявлена связь общей выживаемости с тотальной активностью протеасом и активность пула 26S. Так, общая выживаемость больных значимо выше у больных с уровнями тотальной активности протеасом более 59,9-1000 Ед/мг белка и активности 26S протеасом более 20-1000 Ед/мг белка (рисунок 15, 16).
Была также исследована прогностическая значимость определения экспрессии транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-1 и ростового фактора VEGF в оценке безрецидивной, безметастатической и общей выживаемости больных с помощью теста Гехана-Вилкоксона и log рангового критерия (таблица 92). В качестве пороговых значений изучаемых показателей были использованы средние значения показателей.
В таблице 93 представлено распределение больных с ГПСГШ в зависимости от порогового уровня показателей экспрессии транскрипционных факторов, ростового фактора VEGF и стадиям онкологического процесса. Группы были сопоставимы по стадиям, имеющие различия в группах были не значимы, что позволило провести анализ выживаемости больных.
