Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Клинические характеристики нейробластомы 16
1.2. Стратификация больных нейробластомой на группы риска 17
1.3. Молекулярно-генетические факторы, не включенные в схемы стратификации 29
1.4. Молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации прогностических биологических маркеров 33
1.5. Выявление поражения КМ и оценка минимальной остаточной болезни при нейробластоме 35
1.6. Прогностическое значение выявления инициального поражения КМ и мониторинга минимальной остаточной болезни... 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Характеристика пациентов, включенных в исследование 45
2.2. Исследование генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов... 46
2.3. Исследование прогностической значимости генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов 57
2.4. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов 58
2.5. Сравнение применения ПЦР-РВ и проточной цитометрии для выявления поражения КМ и оценки МОБ 61
2.6. Исследование поражения КМ и оценка МОБ с помощью молекулярного маркера, основанного на анализе метилирования геномной ДНК з
2.7. Исследование прогностической значимости инициального поражения КМ и оценки МОБ у больных нейробластомой 64
2.8. Качественная и количественная оценка РНК, используемой для выявления поражения КМ и оценки МОБ 66
2.9. Статистическая обработка данных 71
ГЛАВА 3. Исследование генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов 72
3.1. Результаты определения количества копий гена MYCNn аберраций короткого плеча хромосомы 2 72
3.2. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 1 83
3.3. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 3 92
3.4. Результаты определения аберраций хромосомы 4 96
3.5. Результаты определения аберраций хромосомы 7 100
3.6. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 9 105
3.7. Результаты определения аберраций хромосомы 11 112
3.8. Результаты определения аберраций хромосомы 12 119
3.9. Результаты определения аберраций хромосомы 14 124
3.10. Результаты определения аберраций хромосомы 17 129
3.11. Результаты определения генетических аберраций в парах первичная опухоль-рецидив (прогрессия) 137
ГЛАВА 4. Исследование молекулярно-генетических маркеров для выявления инициального поражения костного мозга и оценки минимальной остаточной болезни 140
4.1. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов 140
4.2. Прогностическое значение выявления поражения КМ и МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов 151
4.3. Выявление контаминации препаратов АГСК и МОБ на момент проведения лейкафереза на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов 157
4.4. Сравнение результатов выявления поражения КМ при помощи экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии 159
4.5. Исследование поражения КМ и оценка МОБ на основании выявления метилированной формы гена RASSFla и определение
его прогностической значимости 162
4.6. Сопоставление результатов выявления поражения КМ с помощью метилированной формы гена RASSFla с определением экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрией 165
Заключение 170
Выводы 180
Практические рекомендации 182
Перспективы дальнейшей разработки темы 182
Список литературы 1
- Молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации прогностических биологических маркеров
- Исследование прогностической значимости генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов
- Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 3
- Прогностическое значение выявления поражения КМ и МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов
Молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации прогностических биологических маркеров
В протоколе кооперативной группы детской онкологии (COG, Children s Oncology Group, США) в основе определения группы риска помимо стадии заболевания лежат возраст пациента на момент постановки диагноза, наличие амплификации гена MYCN, гистологическое строение опухоли (согласно классификации H.Shimada) и плоидность опухолевых клеток (имеет значение только для определения риска у пациентов IVS стадии). Единственный молекулярно-генетический фактор, используемый в данной схеме стратификации, амплификация гена MYCN не является решающим. Пациенты с I или II (младше 1 года) стадией нейробластомы, имеющие амплификацию MYCN относятся к группе низкого риска [158,204].
Европейская группа по изучению нейробластомы (SIOPEN, International Society of Pediatric Oncology European Neuroblastoma Group, Европейский Союз) для определения риска у больных нейробластомой предлагает использовать такие параметры, как стадию заболевания (INSS), возраст и количество копий гена MYCN. При этом в случае наличия амплификации MYCN пациент сразу попадает в группу высокого риска [107]. Система стратификации больных нейробластомой на группы риска - INRG объединила различные клинические, морфологические и молекулярно-биологические характеристики. К первым относятся распространенность опухоли и возраст больного на момент постановки диагноза. Ко вторым - гистологическая категория и степень дифференцировки опухолевых клеток согласно классификации H.Shimada. К третьим - наличие амплификации гена MYCN и делеции длинного плеча хромосомы 11. Наличие аберраций длинного плеча хромосомы 11 учитывается при локорегионарном распространении опухоли с наличием факторов риска, выявляемых при использовании визуализационных методов исследования (стадия L2 по системе INRG), а также при диссеминированной опухоли с поражением кожи, печени и/или костного мозга у больных не старше 18 месяцев (стадия MS, INRG). Кроме того, при диссеминированной нейробластоме (стадия М, INRG) у детей младше 18 месяцев имеет значение плоидность опухолевых клеток [54].
Таким образом, из большого количества аберраций структуры и числа хромосом в клетках нейробластомы, выявляемых методами молекулярной биологии, три включены в различные протоколы для стратификации пациентов на группы риска: амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1 (1р) и делеция длинного плеча хромосомы 11 (llq). Патогенетическая роль данных аномалий, также как их прогностическая значимость, различна.
Амплификация гена MYCN выявляется в 20-25% случаев нейробластомы [32,154], однако в ряде популяций частота ее выявления несколько ниже - около 16% [188]. Амплификация MYCN часто сочетается с другими прогностически неблагоприятными факторами (диплоидный набор хромосом, неблагоприятная гистологическая категория, делеция 1р36) [32,154]. При этом опухоль характеризуется незрелым фенотипом, высокой скоростью пролиферации клеток, быстрым локорегионарным распространением и ранним появлением отдаленных метастазов.
Ген MYCN экспрессируется во втором триместре беременности в клетках терминального слоя головного мозга и примордиальной коры. Матричная РНК MYCN была выявлена во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток примитивной сетчатки, а также, в значительно меньшей степени, в легких плода и плаценте [85]. В постнатальном онтогенезе экспрессия гена MYCN в норме отсутствует.
Матричная РНК гена MYCN связывается с белком ELAVL4, что увеличивает ее стабильность и способствует увеличению скорости пролиферации клеток [119]. МикроРНК mir34a, напротив, специфически инактивирует мРНК MYCN [199]. Кодирующая последовательность ДНК данной микроРНК локализуются в локусе 1р36, который может подвергаться делеции в клетках нейробластомы. Экспериментальные данные показали, что искусственное введение mir34a в клетки с исходно высоким уровнем экспрессии MYCN (клеточные линии IMR32 и LAN5) значительно снижает его, уменьшает скорость пролиферации, индуцирует апоптоз клеток. При наличии делеции короткого плеча хромосомы 1 обнаружено снижение экспрессии mir34a и увеличение уровня МРНКМГСЩ199].
Ген MYCN, локализуется на коротком плече хромосомы 2 (локус 2р24.1). Гены DDX1, NAG и ALK, картированные в данном или смежных локусах, также могут вовлекаться в амплификацию [119,198]. Данный феномен получил название коамплификации. Отмечено, что продукт гена DDX1, являясь АТФ-зависимой РНК-хеликазой, принимает участие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. При коамплификации гена DDX1 увеличивается его экспрессия, что может быть связано с повышенной агрессивностью нейробластомы [119]. A.Weber et al., напротив, указывают на более благоприятный прогноз у пациентов с диссеминированной нейробластомой, имеющих амплификацию MYCN, при наличии коамплификации DDX1 [198]. Прогностическое и патогенетическое значение коамплификации генов MYCN и NAG, NSE1, LPIN1 или ALK остается предметом дискуссий [79,80,167,198].
Делеция короткого плеча хромосомы 1 встречается в 30-40% случаев нейробластомы и часто сочетается с амплификацией гена MYCN. При возникновении данной аберрации происходит потеря гетерозиготности в локусе 1р36 [75]. В зависимости от локализации были выделены интерстициальная (внутрихромосомная) и терминальная (потеря теломерного региона с прилежащими участками) делеции. K.Ohtsu et al. показали, что при наличии терминальной делеции опухоль имела злокачественный фенотип, а общая выживаемость пациентов составила 33,3%. Крайне неблагоприятным фактором было признано сочетание терминальной делеции 1р и амплификации MYCN. В то же время, между группами больных с интерстициальной делецией и отсутствием делеции 1р выживаемость достоверно не отличалась и составила 100% и 90,7% соответственно. При этом размер удаленного участка не имел прогностического значения в случае интерстициальной делеции, тогда как потеря даже небольших терминальных фрагментов хромосомы 1 (локус ІрЗб.З) приводила к развитию рецидива и отдаленных метастазов [135].
Прогностическое значение делеции короткого плеча хромосомы 1 может объясняться двумя патогенетическими механизмами. Первый заключается в наличии в локусе ІрЗб.З гена CHD5, который является геном-супрессором опухолевого роста. Его продукт относится к группе SWI/SNF белков, которые обладают хеликазной активностью и способностью к АТФ-зависимому разрушению нуклеосом, что приводит к усилению транскрипции регулируемых ими генов. Экспрессия гена CHD5 обнаруживается только в клетках головного мозга и надпочечников [186]. A.Bagchi et. al установили, что ген CHD5 вовлечен в регуляцию процессов пролиферации клеток и апоптоза через сигнальный путь pl9(ARF)/p53 [21].
Исследование прогностической значимости генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов
Использование интактной РНК является основой для получения адекватных результатов при исследовании экспрессии генов методами ПНР или с использованием биологических чипов. В настоящее время для качественной и количественной оценки РНК используются несколько методик, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки [114]. Измерение поглощения ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм на УФ-спектрофотометре не предполагает дополнительных стадий после выделения РНК и отличается относительно высокой воспроизводимостью данных. Однако недостатком этого метода является искажение результатов при контаминации геномной ДНК или фенолом, которые также поглощают свет в аналогичном с РНК диапазоне длины волны. Методики, основанные на использовании интеркалирующих флуоресцентных красителей, таких как Ribogreen, характеризуются относительно высокой чувствительностью и специфичностью в отношении РНК, но воспроизводимость результатов из-за длительных манипуляций с исследуемыми образцами РНК невысока [114,131].
Биоанализатор Agilent 2100 (Agilent, Германия) и наборы RNA LabChip (Caliper Technologies, США) являются инструментом для количественной и качественной оценки РНК. Принцип работы биоанализатора основан на разделении флуоресцентно меченых образцов РНК методом капиллярного электрофореза с одновременной детекцией интенсивности флуоресценции [105]. В ходе измерения определяются такие показатели, как концентрация РНК в образце, соотношение между 18S и 28S субъединицами рибосомальной РНК и показатель целостности РНК (RNA integrity number -RIN) [105,143].
Деградация РНК является процессом постепенным, в ходе которого происходит нарастание числа короткоцепочечных фрагментов, что отражается на электрофореграмме в виде прогредиентного уменьшения соотношения рибосомальных пиков 18S к 28S и увеличения фонового сигнала между рибосомальными пиками и нижним маркером. Программное обеспечение биоанализатора вычисляет соотношение между рибосомальными субъединицами 18S и 28S, которое является одним из критериев степени деградации РНК. Параллельно с этим рассчитывается RIN, который классифицируется по шкале от 1 до 10, где 1 - соответствует максимально деградированному профилю, а 10 - полностью интактному [77,105,114,131,143,151]. Применение частично или полностью разрушенной РНК может привести к искажению результатов, поэтому важно оценивать качество РНК, вносимой в реакцию обратной транскрипции и, в дальнейшем, в ПНР.
В качестве исходного материала использовались 496 образцов КМ, полученных от 174 пациентов и 124 образца периферической крови (ПК) от 124 пациентов, находившихся на лечении в Отделе детской онкологии и гематологии ОДКБ№1 (Екатеринбург), а также других лечебно-профилактических учреждениях Российской Федерации. Исследовались образцы больных с различными онкологическими и онкогематологическими заболеваниями, а также пациенты без злокачественных новообразований. Распределение количества пациентов и образцов по нозологическим формам представлено в таблице 7.
Взятие материала для проведения молекулярно-генетического исследования (ПК и аспираты КМ) осуществлялось в вакуумные пробирки, в которых в качестве антикоагулянта использовалась калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (К3ЭДТА). Срок доставки материала в лабораторию варьировал от 0 до 24 часов. Ядросодержащие клетки КМ и ПК выделяли путем двукратного лизиса эритроцитов в 0,84% растворе хлорида аммония. Количество лейкоцитов подсчитывалось на гематологическом счетчике КХ-21 (Sysmex, Япония). Общую РНК выделяли из 2х106 ядросодержащих клеток КМ или ПК по методу Хомчинского с использованием TRI-reagent (MRC, США). На последнем этапе выделения РНК образцы обрабатывалась ДНКазой I (Fermentas, США). Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре SmartSpec (Bio-Rad, США), а также с использованием комплекта реагентов RNA 6000 Nano Reagents (Agilent, Литва) и чипов RNA LabChip 6000 Nano (Caliper Technologies, США) на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, Германия) согласно инструкции производителя. Анализ электрофореграмм проводился при помощи программного обеспечения Agilent 2100 Expert. РНК высокого качества имеет следующие характеристики: 1. Четкие и высокие пики 18S и 28S; 2. Отсутствие дополнительных пиков между рибосомальными пиками; 3. Ровная базовая линия; 4 Соотношение между пиками 18S и 28S более 2. При разрушении РНК происходит смещение 18S и 28S пиков влево (в сторону меньшего времени), отмечаются осцилляции базовой линии, снижается высота пиков рибосомальной РНК, увеличивается сигнал в области малых РНК.
После оценки качества на микроструйных биочипах 1 мкг РНК переводили в кДНК в присутствии MMLV обратной транскриптазы (ЦНИИЭ, Россия) и смеси случайных пентадекамеров или наномеров (Синтол, Россия). Комплементарная ДНК в количестве эквивалентном 100 нг РНК использовалась в качестве матрицы для проведения ПЦР-РВ с использованием ДиаТак-полимеразы (ЦНИИЭ, Россия). Все образцы тестировались в двух повторах. Определяли экспрессию гена ABL. Исходя из рекомендаций Europe Against Cancer, при оценке экспрессии гена ABL в качестве значения, взятого для разделения на образцы удовлетворительного и неудовлетворительного качества, был принят пороговый цикл равный 30 [77]. В том случае, если величина порогового цикла превышала 30, образец расценивался как имеющий неудовлетворительное качество выделения РНК, исходя из чего делался вывод о критическом уровне деградации РНК.
При анализе результатов исследования не было получено достоверных различий при оценке образцов КМ и ПК. Медиана RIN в образцах КМ составила 7,1 (диапазон 2,2-8,6), в ПК - 6,9 (диапазон 2,5-8,0) (р=0,087). Также не выявлено статистически достоверных различий при сравнении показателя целостности РНК в группах пациентов с различными нозологическими формами. Так, в образцах пациентов с нейробластомой медиана RIN составила 7,0 (диапазон 2,3-8,5), с опухолями семейства саркомы Юинга - 7,1 (диапазон 2,7-7,8), с ОЛЛ - 6,8 (диапазон 2,1-7,0), с ОМЛ - 6,6 (диапазон 2,4-7,2), с ХМЛ - 6,8 (диапазон 3,0-7,4), в образцах пациентов без злокачественных новообразований 7,0 (диапазон 2,4-8,3), р=0,356.
Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 3
Таким образом, деления короткого плеча хромосомы 1 была выявлена у 33 пациентов, при этом у одного больного она определялась только с помощью ПЦР, а еще у одного - только с помощью FISH. Качественная сходимость методов MLPA и ПЦР составила 95,8%, a MLPA и FISH - 95,5%. Только в одном случае выявленная деления являлась интерстициальной. Гомозиготное состояние локусов, анализируемых методом VNTR, является ограничением для применения данного метода. У двух пациентов гомозиготное состояние двух терминально расположенных минисателлитных локусов (D1S76 и D1S80) не позволило выявить делению 1р, обнаруженную только с помощью MLPA.
Частота выявления делеции 1р не зависела от стадии нейробластомы и гистологического варианта строения опухоли. Она была обнаружена в трех образцах доброкачественной ганглионевромы. В то же время у пациентов старше 12 месяцев деления 1р выявлялась достоверно чаще. Показатели БСВ и OB пациентов при наличии делеции 1р были значительно ниже, чем при ее отсутствии, что подтверждает значение данной аберрации как независимого неблагоприятного фактора. Прогностическое значение данной аберрации сохраняется в группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS.
Наличие делеции 1р приобретает важное клиническое значение для стратификации пациентов в случае отсутствия амплификации MYCN, что было выявлено у 15 пациентов. Величины БСВ и ОВ у таких пациентов были достоверно ниже по сравнению с больными, у которых делеция 1р и амплификация гена MYCNобнаружены не были.
Данные выживаемости больных свидетельствуют о неблагоприятном прогностическом значении амплификации гена MYCN к делеции короткого плеча хромосомы 1, что согласуется с данными литературы [19,42,54,121,123]. Этим обусловлена необходимость своевременного и корректного определения данных аберраций до начала лечения для выбора оптимальной интенсивности терапии. Наиболее широко используемая в нашей стране схема программной химиотерапии нейробластомы NB2004 классифицирует больных с наличием амплификации MYCN как пациентов группы высокого риска вне зависимости от стадии заболевания и возраста. Наличие делеции 1р учитывается при стратификации больных локализованной нейробластомой (II, III стадии) и увеличивает риск у данных пациентов с низкого до среднего.
Исследования аберраций хромосом 1 и 2, проведенные с помощью ПЦР, MLPA и FISH дали возможность сравнить диагностические возможности данных молекулярно-биологических методик. Проанализированные методы, служащие для выявления амплификации MYCN и делеции 1р, продемонстрировали ряд достоинств и недостатков. Методики, основанные на технологии ПЦР, просты в использовании, они позволяют быстро (в течение 3-4 часов) и точно определить наличие аберраций, результаты обладают высокой воспроизводимостью. Однако метод ПЦР не позволяет выявить увеличения количества копий гена MYCN, не достигающего порога амплификации. Определение делеции 1р с помощью ПЦР требует наличия ДНК, выделенной из неопухолевого материала того же пациента. Метод FISH на сегодняшний день признан «золотым стандартом» для диагностики аберраций, ассоциированных с изменением числа копий отдельных регионов. Он также дает возможность получить точный результат за короткое время наряду с оценкой плоидности опухолевых клеток. Для анализа как методом FISH, так и ПЦР может быть применена ткань опухоли, фиксированная в формалине и залитая в парафиновый блок, что имеет значение для ретроспективного анализа архивных образцов, а также облегчает транспортировку материала для исследования из других городов.
Метод MLPA позволяет одновременно определять большое количество аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных регионов, включая делецию 1р и различные варианты изменения количества копий MYCN. Так же, как и ПЦР, данный метод требует использования небольшого количества опухолевой ДНК - не более 100 нг. Результаты, полученные с помощью MLPA, обладают высокой воспроизводимостью. В то же время, метод MLPA может быть применен в рутинной клинической практике ограниченно, так как исследование единичного образца данным методом не имеет диагностической значимости. Решающее значение приобретает расчет ВС сигнала для каждого зонда в анализируемом образце к усредненной величине сигнала аналогичного зонда в референсных образцах. Это требует включения в одну постановку нескольких исследуемых и референсных образцов. Кроме того, использование материала из парафинового блока возможно, но крайне нежелательно из-за высокой степени фрагментации выделенной ДНК. По полученным данным, только 13 из 20 включенных образцов были приемлемы для анализа.
Для выявления делеции короткого плеча хромосомы 3 методом MLPA используются зонды, специфичные к регионам Зр12-3р25, при этом патогенетическое значение имеют аберрации региона Зр21. Делеция Зр была выявлена у 30 из 108 обследованных больных (27,8%) и локализовалась в регионе Зр21 у 25 пациентов (23,1%), у 5 больных (4,6%) захватывала регионы Зр21-3р25. У одного пациента (0,9%) была выявлена моносомия 3. В клеточных линиях IMR-32, Kelly и SH-SY5Y аберраций хромосомы 3 выявлено не было. Значения ВС при наличии либо отсутствии делеции короткого плеча хромосомы 3 приведены на рисунке 13 и в таблице 16.
Прогностическое значение выявления поражения КМ и МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов
Определение инициального поражения КМ необходимо для корректного стадирования заболевания, а выявление остаточных опухолевых клеток в процессе лечения характеризует ответ опухоли на проводимую терапию [61,125]. При этом поражение КМ, выявляемое как при первичной диагностике нейробластомы, так и в процессе лечения, имеет негативное прогностическое значение [61,90,170]. В настоящее время отсутствует единый стандартизованный подход к определению поражения КМ с использованием высокочувствительных методов и в рутинной клинической практике стандартное цитологическое исследование занимает ведущее место. Однако аналитическая чувствительность данного метода невысока [33,47,48]. Соответственно, поиск чувствительного и специфичного метода выявления поражения КМ и оценки МОБ остается актуальным.
Экспрессия генов, выбранных в качестве маркеров поражения КМ, определялась с помощью ПЦР-РВ. Матричная РНК генов РНОХ2В, ТН, GD2 и ELA VL4 была выявлена во всех образцах исследованных клеточных линий нейробластомы. Ген GD2 был гомогенно экспрессирован в обеих клеточных линиях, в то время как экспрессия РНОХ2В и ELA VL4 была достоверно ниже в культуре клеток Kelly, а экспрессия ТН - в клетках IMR-32. Значения нормализованной величины экспрессии генов приведены в таблице 33.
При анализе серийных разведений РНК, выделенной из клеток IMR-32, а также смеси РНК, выделенной из 10 образцов ткани нейробластомы, в РНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров аналитическая чувствительность определения экспрессии генов РНОХ2В, ТН, GD2 и ELA VL4 достигала 1 х 10"6
Ни в одном из 26 образцов КМ пациентов без онкологических заболеваний экспрессия РНОХ2В и ТН не была выявлена. Матричная РНК ELAVL4 обнаружена в 20 образцах из 26 (76,9%), a GD2-B 15 из 26 образцов (57,7%).
Среди исследованного 331 образца КМ больных нейробластомой было выявлено 107 (32,3%) образцов, удовлетворяющих критериям позитивности (обнаружение опухолевых клеток в цитологических препаратах КМ или наличие экспрессии гена РНОХ2В). Из них 31 был получен на момент диагностики, 59 - во время терапии и 17 - при диагностике рецидива. Количество позитивных образцов, экспрессирующих исследуемые маркеры, представлено в таблице 34.
Частоту выявления экспрессии исследуемых генов в позитивных образцах сравнивали с таковой в негативных образцах больных нейробластомой, а также в образцах пациентов контрольной группы (без онкологических заболеваний). Результаты качественного сравнения представлены в таблице 35.
Таким образом, экспрессия генов РНОХ2Ви ТНв позитивных образцах определялась достоверно чаще, чем в негативных и контрольных, тогда как частота обнаружения экспрессии ELA VL4 и GD2 в позитивных, негативных и контрольных образцах достоверно не отличалась. Различий в частоте выявления экспрессии РНОХ2В, ТН, ELAVL4 и GD2 между негативными и контрольными образцами также выявлено не было (р=0,999, р=0,988, р=0,643 и р=0,277 соответственно).
Количественно сравнивали образцы, в которых определялась экспрессия исследуемых маркеров (рисунок 34). Было выявлено, что экспрессия ТН в позитивных образцах была выше, чем в негативных
Нормализованная величина экспрессии исследуемых маркеров (горизонтальная линия соответствует медиане) в позитивных и негативных образцах КМ больных нейробластомой, клеточных линиях IMR-32 и Kelly, а также образцах КМ пациентов без нейробластомы (контрольная группа).
В двух образцах КМ, в которых при цитологическом исследовании определялись опухолевые клетки, и отсутствовала экспрессия РНОХ2В, была выявлена экспрессия ТН. Подробная информация о данных образцах представлена в таблице 38. Обнаружение экспрессии гена ТН при отсутствии экспрессии РНОХ2В может свидетельствовать о целесообразности сочетанного использования двух маркеров для корректного выявления поражения КМ.
С целью оценки специфичности анализируемых маркеров для выявления поражения КМ при нейробластоме была исследована их экспрессия в КМ пациентов с различными солидными опухолями. Из 75 проанализированных образцов КМ пациентов с меланомой, ретинобластомой, рабдомиосаркомой, феохромоцитомой, эпендимомой и саркомой Юинга/ПНЭО 31 был признан позитивным, 37 - негативными, 7 образцов КМ классифицированы не были. Экспрессия гена РНОХ2В была выявлена только в одном образце КМ от пациента с меланомой. Ген ТН был экспрессирован в 1 из 3 образцов при меланоме, во всех трех образцах при злокачественной феохромоцитоме, в 1 из 33 образцов при саркоме Юинга/ПНЭО, а также во всех позитивных образцах при альвеолярной рабдомиосаркоме. Наличие экспрессии генов РНОХ2В и ТН в клетках меланомы объясняется общим с нейробластомой гистогенезом опухоли из производных нервного гребня [27,133]. Выявление высокой экспрессии гена ТН в клетках злокачественной феохромоцитомы связано с его участием в продукции катехоламинов. Экспрессия гена ELAVL4, превосходящая ПУ, была обнаружена в образцах КМ больных меланомой, саркомой Юинга/ПНЭО и альвеолярной рабдомиосаркомой, GD2 - также при ретинобластоме. В случае саркомы Юинга/ПНЭО и альвеолярной рабдомиосаркомы экспрессия генов ELAVL4 и GD2, превосходящая ПУ, определялась только в позитивных образцах КМ (таблица 40). Полученные результаты свидетельствуют о наибольшей специфичности гена РНОХ2В для клеток нейробластомы.
Похожие диссертации на Прогностическое значение молекулярно-генетических маркеров у пациентов с нейробластомой
