Введение к работе
. Актуальность проблемы.
Современный этап исследований в экспериментальной онкологии и онкогематалогии характеризуется выяснением структурных и метаболических ИЗМеНеНИЙ КрОВеТВОрНЫХ КЛеТОК И МеХаНИЗМОВ ЛЄЙК08Н0Й
трансформации на молекулярно-генетическом уровне.
Рост частоты лимфопролиферативных заболеваний, недостаточная эффективность мер профилактики и ранней диагностики являются основой для разработки этой общебиологической проблемы, решение которой актуально в медицине, биологии и экологии. Выяснение вопросов злокачественной трансформации важно в плане нахождение новых теоретических подходов к пониманию развития лейкозного процесса на различных уровнях дифференцировки нормальных кроветворных клеток и для разработки современных методов диагностики и лечения, которые должны быть направлены на элиминацию лейкозного клона, нормализацию измененных свойств клеток и общего гомеоста-sa.
По существующим представлениям лейкозогенез - многостадийный процесс. Нарушения в клеточном метаболизме, генетической и мембранной системах клеток приводят к изменениям фундаментальных процессов лимфопоэза - пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. В настоящее время не до конца ясны пути и механизмы злокачественной трансформации нормальных кроветворных клеток, стадии дифференцировки, наиболее чувствительные к лейкомогенному фактору, и при этом обшие изменения регуляции кроветворения и иммуногенеза. Развитие лейкозного процесса,возможно, обусловлено дефектностью иммунной системы, нарушениями пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток, поэтому исследование особенностей процесса биосинтеза нуклеиновых кислот, изменений молекулярной структуры и функций мембран популяций лимфоцитов при гемоб-ластозах особенно актуально. Изучение клеточных основ и молекулярных механизмов трансформации при лейкозах человека затруднено многообразием форм заболевания и недостаточным использованием специальных методов исследования отдельных клеточных и субклеточных систем. Достигнутый в настоящее время прогресс в изучении лейкозов связан, в основном,с успехами морфологического, биохимического анализов и тестов иммунологической диагностики для выявления и дифференциации некоторых видов гемобластазов.
Требуют дальнейшего изучения физико-химические и молекулярные нарушения мембран, ядер и других структур лейкозньк клеток для выяснения функционирования популяции в целом при лимфопроли-Феративных заболеваниях. На современном этапе исследования лей-козогенеза первоочередной задачей остается поиск комплекса экспериментальных подходов к характеристике процессов пролиферации и диффервнцировки лимфоидных клеток, разработка методов идентификации и характеристики отдельных суОпопуляций лимфоцитов при возникновении и развитии лейкоза, а также оценка их роли в лей-комогенезе. Для решения этих вопросов необходимо применять наиболее совершенные морфологические, цитологические, физико-химические и другие методики, позволяющие изучать различные функциональные структуры лимфоцитов клеток в норме и при их злокачественной трансформации, использовать достаточно чувствительные методы регистрации минимальных нарушений основных клеточных компонентов на начальных стадиях лейкоза, отличающих трансформирован-ку;:і клетку от ее нормального аналога. В доступной нам литературе обнаружены единичные работы по исследованию корреляции изменений молекулярной структуры ядер и.мембран гемопоэтических клеток при развитии заболевания: часть работ посвящена изучению свойств и особенностей ДНК, РНК, белков' трансформированных лейкозных клеток в модельных опытахГ G. Gall о, 1982, Ф. Хейхоу, 1333,U. Torel 1 у, 1985,В. Г. Пинчук, 1986,3. А. Бутенко, 1984. P. Dormer, 1986), другие исследования проведены на клиническом материале; Y. Tempi ,1974, Д. I. Глузмак, 1982,3. Riceardi ,1933,11. А. Федоров, 1983, Г. И. Ко?инец,1984, D. Quagl і no, 1985, F. Gavosto, 1936,К. И Ганила, 1936, D. Butturi Пі , 1983, M. її БЛИНОВ, 1990).
Для раскрытия механизмов трансформации нормальных гемопоэтических клеток при лимфопролиферативных заболеваниях необходимо комплексное изучение лимфоидной системы и отдельных ее звеньев -'субпопу л^ций лимфоцитов лимфатических узлов и крови, что позволит, возможно, определить изменения лимфоцитов при лейкозах, выяснить особенности биосинтеза нуклеиновых кислот и молекулярные различия липидов цитоплавматических мембран и, в дальнейшем, оценить уровень повреждений на ранних этапах и при прогрессиро-вании лейкоза. Выяснение перечисленных выше вопросов актуально
для более глубокого понимания процессов опухолевой трансформации іслеточной популяции и подтверждения современных представлений о главенствующей роли структурных нарушений генома и особенностях его функционирования в лейкогенезе человека. Учитывая современное состояние проблемы лейкозов,необходимы поиски новых научных направлений на основе экспериментальных исследований и обоснованные предложения для внедрения в практику, так как достижения современной фундаментальной и клинической лейкозологии способствуют поэнанию закономерностей функционирования лимфоидной системы в норме и патологии.
В связи с актуальностью проблемы гемобластозов в нашей стране ГКНТ СССР создана программа для решения научно-технической проблемы 0.69.05 "Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике,лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека,сельскохозяйственных животных и irrnir.N государственной регистрации N 01.86.0126230, частью которой является настоящая работа.
Основная цель работы j комплексная оценка процессов пролиферации и дифференшіроБки клеточной популяции на основе определения метаболических изменений ядра и цитоплазматической мембраны лим фоцитов лимфоузлов и крови на разных стадиях заболевания и в норме.
Для достижения поставленной цели необходимо: Провести морфологическое идентифицирование популяции в целом и групп лимфоцитов лимфоузлов и крови при хроническом димфолей-козе(ХЛЛ)и у здоровьк лиц.
Определить- пролиферативную активность всей популяции и групп лимфоцитов лимфоузлов и крови при ХЛЛ и в норме, -степень диффе-ренцировки лимфоцитов лимфоузлов и крови в различные периоды ХЛЛ в сравнительном аспекте с клетками здоровых доноров.
Установить- особенности биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот на одних и тех же лимфоцитах лимфоузлов и крови, исследуя корре-.
ляцию морфологических изменений и процессов пролиферации и диф-ференцировки в норме и при развитии лейкоза,
- изменение фаз клеточного цикла лимфоцитов при лейкозе по сравнению с их нормальными аналогами, - нестабильность ДНК лимфоцитов крови на начальных стадиях и при прогрессировании лей-козного процесса.
Охарактеризовать- липиды цитоплазматических мембран при ге-мобластозах и у здоровых лиц. - суммарную ненасыщенность жирных кислот липидов лимфоцитов и плазмы крови в норме и при развитии ХЛЛ, ЗЛ ,МБ и особенности изменений ненасыщенности липидов при каждом виде гемобластозов.
Показать взаимозависимые изменения биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот,нестабильности ДНК и липидов лимфоцитов при гемоб-ластозах в корреляции с клинико-гештологическими показателями. НАУЧНАЯ НОВИЗНА В результате применения комплекса методов двухэпатной авто-радиографии,сканирующей микроопектроцитометрии,КФ,Н-ЯМР спектроскопии и других получены новые данные об особенностях биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и деспирализации ДНК,изменениях липидов цитоплазматических мембран и ненасыщенности липидов лимфоцитов и плазмы крови при гемобластозах и в норме.
На примере ХЛЛ дана характеристика взаимосвязей процессов пролиферации и дифференцировки и изменений динамического состояния цитоплазматических мембран лимфоцитов в корреляции со стадиями заболевания.
Получены оригинальные результаты:
-по пролиферативной активности и степени дифференцировки морфологически различных групп лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови доноров и больных в 'различные стадии заболевания;
-по идентичности процентного соотношения групп лимфоцитов лимфоузлов и крови в норме и в различные периоды ХЛЛ;
-по снижению в 8-10 раз,по сравнению с нормой,числа включающих НЗтимидин клеток крови и лимфоузлов и увеличению в 1,5 раза числа клеток,включающих НЗуридин в начальной стадии ХЛЛ;
-по интенсификации биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и выявлению различий интенсивности биосинтеза у лимфоцитов,расположенных в норме-в трех периодах s фазы, а при ХЛЛ- в двух перио-
дах s фазы;
-по установлению лимфоцитов,характеризующихся активацией биосинтеза ядерной РНК и повышенной плоидностью при отсутствии включения НЗтимидина;
-по возникновению гетерогенности лейковных лимфоцитов в связи с изменением продолжительности G1 и S периодов митотического цикла в начале и при прогрессии ХЛЛ. Получены:
-новые данные при ХЛЛ о наличии дефектов в структуре ДНК лимфоцитов крови,количество которых не коррелирует с длительностью заболевания,стадией процесса и возрастом больных;
-сравнительные Н1-ЯМР спектральные характеристики липидов ци-топлазматических мембран при гемобластозах и в норме,а такжеиз-менения ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лимфоцитов крови в начале,при прогрессировании лейкозов.и в норме.Для. каждого вида гемобластозов установлены индивидуальные особенности изменений липидов. Химиотерапия воздействует преимущественно на лимфоциты с нестабильной структурой ДНК и повышенной ненасыщенностью жирных кислот липидов.
Популяция лимфоцитов при ХЛЛ может рассматриваться как система с нарушенными соотношениями процессов пролиферации и диффе-ренцировки. Предложена гипотеза,по которой установленные при ХЛЛ
нарушения процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов и изменения динамического состояния мембран клеток лимфатических узлов и крови обусловлены взаимосвязанными перестройками в ядре/биосинтез нуклеиновых кислот/ и цитоплазматических мембра-нах( липиды-), что приводит к появлению и формированию патологи ческого клона лимфоцитов с определенными функциональными особенностями и свойствами к рециркуляции и долгожительству.
Система комплексного исследования процессов пролиферации и дифференцировки всей популяции и групп лимфоцитов при гемобластозах и в норме на основе определения нарушений основных клеточных структур/ядерные ДНК, РНК, липиды цитоплазматической мембраны/ при использовании современных физико-химических методов.
Гетерогенность популяции лимфоцитов лимфоузлов и крови'по морфологическим критериям, пролиферативной активности и степени дифференцировки при раэвитии лейкоэного процесса.
Особенности процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов лимфатических увлов и крови при ХЛЛ, обусловленные иэмене1-ниями относительной продолжительности фаз клеточного циклаС 61, S,), приводящими к приобретению лимфоцитами свойств рециркулирующих и. долгоживущих.
Увеличение нестабильности ДНК лимфоцитов в начальной стадии и в период клинических проявлений болезни и отсутствие влияния повышенного числа деспирализованных участков ДНК на жиэнеспособ-* ность и пролиферативную активность лимфоцитов.
Изменения Ш-ЯМР спектральных характеристик липидов мемб ран лимфоцитов при гемобластозах и в норме. Увеличение ненасыщенности жирных кислот липидов при гемобластозах и специфичность изменений для каждого вида изученного заболевания и нормы.
Разработан метод оценки процессов, пролиферации и дифференцировки ВСЄЙ ПОПУЛЯЦИИ И ОТДелЬНЫХ ГРУПП ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛЄЙК08Є
и в норме при совместном применении соврмененных морфологических
и физикохимических методов.
Предложен новый подход к характеристике лейковной трансформации лимфоцитов и развития лимфопролиферативного процесса,основанный на комплексной оценке суммарного биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и состояния липидов цитоплазматической мембраны лимфоцитов.
Получены характеристики пролиферативной активности и степени дифференцировки нормальных лимфоцитов лимфоузлов и крови,что является основой для выявления минимальных изменений процессов пролиферации и дифференцировки при лейкове.
Представлены данные о популяции лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови при хроническом лимфолейкозе как системе, в
которой нарушены соотношения процессов пролиферации и дифферен-цировки.
Разработан и предложен практический метод ранней и дифференциальной диагностики ХЛЛ и злокачественных лимфом по изменению Н'-ЯМР спектральных характеристик липидов мембран лимфоцитов крови.
Разработан и предложен практический метод определения ненасыщенности жирных кислот липидов лимфоцитов и плазмы крови в норме и в начальный период заболевания. Получены данные об изменении ненасыщенности липидов при прогрессировании гемобластоэов. Выявлен ные индивидуальные особенности нарушений суммарной ненасыщенности липидов лимфоцитов и плазмы крови при каждом из гемоб-ластозов являются основанием для ранней и дифференциальной диагностики, а также для проведения контроля sa эффективностью лечения.
Совокупность представленных результатов выявляет новый перспективный научный подход - изучение взаимосвязанных изменений метаболических процессов ядра и цитоплазматических мембран лимфоцитов при их лейкоэной трансформации.
-
Издание научно-методических рекомендаций "Проведение биохимических, иммунохимических и радиохимических исследований имму-нокомпетентных клеток, клеточных структур и их компонентов" (В соавторстве с Г. Ф. Коромысловым, А. Л Газдаровым, П, Б. Садаускасом и др.), Москва, 1983 г.
-
Публикация результатов исследования в периодической печати.
-
Доклады на международных и Всесоюзных конференциях.
4. Обучение научных сотрудников на рабочих местах методам дву-
хэтапной авторадиографии,сканирующей микроцитофото-
метрии, озонированию липидов и др. для оценки параметров пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток в норме и при лейкозе.
-
Доклады на школах молодых ученых и практических врачей.
-
Получены акты о научно-практическом применении предложенных методов: из Z-й клиники Всесоюзного научного гематологического
центра ЫЗ СССР, Института биохимии АН Лит. ССР,Всесоюзного института экспериментальной ветеринарииВАСХНИЛ.
АППРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты исследований отражены в 37 работах, опубликованных в периодических . журналах, сборниках научных трудов, Материалах Международных и Национальных Конгрессов, Всесоюзных конференциях,с"е8дов и симпозиумов. Материалы, вошедшие в диссертацию, докладывались и обсуждались: на Весоюз-ных конференциях и Координационных совещаниях Совета по решению научно-технической проблемы 0.69. 05. "Лейкозы человека и животных" ГКНТ СССР,- Рига(1971,1978,1981),Таллин(1975), Тар-ту(1978,1983,1987) .Вильнюс(1979,1982),Белая Перковь(.1982),Моск-ва( 1982,1984), Минск( 1986),Сухуми( 1979,1987,1988); на Международных и Всесоюзных С'ездах по онкологии: 2-й, 3-й, 4-й Национальные БНР, София,1974,Варна,1979,Варна,1985), 2-й Националь-ный( СРР, Бухарест, 1975), 10-й Международные США, Хьюстон, 1970), 3-й, 4-й Национальные СССР,Ташкент,1979,Ленинград,1986); Международных и Всесоюзных С'ездах по гематологии: 1-й, 2-й Националь-ныйГСССР,Баку.1979, Львов,1985),19-й Национальны^ВНР,Будапешт ,1987) ;)Э-й Международный Конгресс по сравнительному изучению лейкозов(СССР,Сухуми,1979),Европейский по цитологии(ВНР, Будапешт, 1988); Международных совещаниях: по лейкозу человека и живот-ных( СССР,Сухуми, 1986),"Вирусология опухолей" (ГДР, Дрезден, 1987); Всесоюзных конференциях: по проблеме лейкозовРи-га(1971,1987), Тарту( 1987),Белая Церковь( 1982),Сухуми( 1988) по иммунологии-Алма-Ата(1981),Таллинн(1982),Самарканд( 1984); по проблеме "Стволовая клетка и опухолевый рост"(Киев,1983); Всесоюзных симпозиумах и совещаниях: по структуре и функции клеточного ядра(Киев,1970),по кинетике клеточных популяций(Красноярск, 1973),по авторадиографии( Москва,1976), по методам количественного анализа в патоморфологии( Полтава, 1977), по проблеме "Взаимодействие опухоли и организма" (Киев,1980),1-й Всесоюзный конгресс4 по биофизике( Москва , 1982), "Биофизика рака'Ч Москва, 1987), "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований^ Москва,1989) /'Механизмы канцеро- и лейкозогенеза'Ч Киев, 1990).
Отдельные разделы работы выполнялись совместно с научными сотрудниками других лабораторий ИХФ АН СССР (Л. А. Сибельдиной,
В. Е. Юшмановым, Г. П. Жижиной, Г. П. Троицкой, Л. С. Евсеенко, Б. С. Ко-гарко, А. А. Конрадовым, Т. И. Позняк, Е.В.Киселевой, Д. М. Лисици-ным), а также научными сотрудниками и врачами различных медицинских учреждений СЮ. Э. Виноградовой, Г. В. Кругловой, 0. С. ІІкробом, А. М. Кулаковой, Б. Б. Фуксом, М. С. Задгенидзе).
