Содержание к диссертации
Оглавление 2
Список основных сокращений 5
I Введение 7
II Обзор литературы 12
II.1.1 Белки семейства Ras. Общие сведения 12
П. 1.2 Строение белков семейства Ras 14
II. 1.3 Мутации генов ras 15
П. 1.4 Функциональные области белков Ras 16
П. 1.5 Ras и его мембранные транслокации 17
II. 1.6 Регуляция активности Ras. 18
П. 1.6.1 GAP - негативные регуляторы Ras белков 18
П. 1.6.2 GEF- положительные регуляторы Ras белков 21
П.2 Ras зависимые пути передачи сигнала 23
П.2.1 Общая характеристика Ras-ассоциированных сигнальных путей.,.23
11.2.2 Эффекторы Ras 25
11.2.2.1 Протеин киназа Rafl 26
П.2.2.2РІЗК 29
П.2.2.3 Другие эффекторы Ras 30
II.3 Ral белки 33
ЇІ.3.1 Общие сведения 33
И.3.2 Белки, взаимодействующие с Ral 34
11.3.3 Регуляция активности Ral 35
П.3,3.1 Ras зависимая активация Ral 35
11.3.3.2 Ras-независимая активация Ral 37
П.3.4 Ral зависимые пути передачи сигнала 38
П.3.4.1 Эффекторы Ral з
113.5 Ral А и RalB 43
11.3.6 Основные направления действия Ral - зависимых сигналов 45
П.3.6.1 Участие белков Ral в сортировке везикул 45
IL3.6.2 Базолатеральная доставка мембранных белков в поляризованных клетках 46
II.3.6.3 Нейросекреция 47
П.3.6.4Эндоцитоз 49
П.3.6.5 Белки Ral и морфология клетки 51
IL3.6.6 Белки Ral и экспрессия генов 52
П.3.6.7 Ral белки, пролиферация клеток и онкогенная трансформации
III Материалы и методы 60
Растворы и среды 60
Эукариотические клеточные линии, 62
Культивирование бактериальных клеток 63
Трансформация 63
Выделение плазмидной ДНК 64
Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 65
Трансфекция эукариотических клеток 65
Трансфекция вирусных векторов 66
Инфицирование клеток вирусом 67
Анализ метастатической активности in vivo 67
Анализ экспериментальной метастатической активности (ЭМА) 68
Анализ спонтанной метастатической активности (СМА) 68
Анализ туморогенности клеток 68
Приготовление клеточного лизата 69
Вестерн-блот гибридизация 69
Определение уровня активности RalA 70
Анализ уровня продукции ММР 71
Анализ динамики роста клеток 71
Определение интенсивности катаболизации перекиси вородода in vitro .,72
Определение ЛД50 перикиси водорода для исследуемых клеточных линий
Определение скорости зарастания раны (wound healing assay) 73
Определение инвазивных характеристик клеток 74
Определение способности образовывать колонии 75
Статистическая обработка результатов 75
IV Результаты 76
Ha-Ras зависимая модуляция метастатической активности RSV трансформированных фибробластов хомяка 77
Супрессия метастатической активности клеток введением доминантно негативной мутантной формы RalA 81
RalA зависимая индукция метастазирования 88
Характеристика полученных культур In Vitro 91
Динамика роста клеток 91
Анализ способности клеток образовывать колонии .92
Анализ подвижности клеток 93
Анализ инвазивных характеристик клеток 96
Анализ продукции секретируемых матриксных металлопротеаз 98
Определение интенсивности катаболизации перекиси in vitro 101
Определение устойчивости клеток к перекиси водорода 103
Характеристика экспрессии различных белков в исследуемых клеточных линиях 105
Экспрессия S100A4 105
Экспрессия паксилина и фосфо-паксилина 107
Экспрессия Erkl/Erk2 Ill
Экспрессия ЦиклинаБІ 113
V Обсуждение результатов 115
Список литературы 1
Введение к работе
Метастазирование - одно из опаснейших свойств злокачественных опухолей, являющееся основной причиной смертности от онкологических заболеваний.
Способность клетки к метастазированию - это результат отбора в популяции опухолевых клеток в процессе опухолевой прогрессии. Клетки должны приобрести способность выжить в условиях гипоксии, прорасти опухолевую массу, кровеносные и/или лимфатические сосуды, выйти в кровеносное русло, избежать гибели от иммунного ответа, прикрепиться к ткани во вторичном очаге и сформировать вторичный опухолевый узел.
На сегодняшний день имеется огромное количество данных о молекулярных механизмах отдельных составляющих этого процесса, однако они в значительной степени противоречивы. В этой связи особенно актуальным представляется использование биологических моделей, позволяющих изучать метастазирование как комплексный физиологический феномен in vivo.
Эти модели должны обладать свойством, позволящим при экспериментальном изменении какого-либо параметра опухолевой клетки (обработка различными химическими ингибиторами или стимуляторами, введение определенных генетических конструкций) оценить суммарное влияние на метастатический фенотип in vivo. Таким образом, на таких моделях возможно изучение как отдельных составляющих процесса метастазирования с помощью соответствующих тестов, так и целостного процесса. Одним из способов моделирования метастатического процесса является введение дополнительных генетических агентов. Такие агенты изменяют передачу внутриклеточных сигналов и влияют на функциональное состояние клетки. Сравнение молекулярно-биологических различий таких линий является одним из способов идентификации новых генетических маркеров метастазирования.
Одной из таких экспериментальных моделей является система линий трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Эта модель уникальна тем, что включает в себя клеточные линии одинакового происхождения, но отличающиеся по метастатической активности in vivo. Она была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н Блохина РАМН. Данная экспериментальная модель состоит из линий эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro вирусом саркомы Рауса (RSV). Клетки этих линий обладают типично трансформированным фенотипом и различаются по ряду биологических характеристик, в том числе и по уровню метастатической активности. Все полученные линии имели типично трансформированный фенотип и были высокотуморогенны для сингенных животных. При внутривенном введении взрослым хомякам клетки всех линий демонстировали высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА). Значительные отличия были обнаружены при исследовании спонтанной метастатической активности полученных линий (СМА). Следует отметить, что тест ЭМА представляет собой анализ способности трансформированных клеток, введенных в кровеносную систему, образовывать метастатические узелки в легких. При помощи же теста СМА оценивают метастазирование клеток опухолевой массы, сформировавшейся после введения анализируемых клеток животному подкожно. Таким образом, тест ЭМА отражает уровень выживаемости клеток в условиях противоопухолевой активности организма, тогда как тест СМА - это анализ способности клеток первичной опухоли инвазировать через стенки сосудов организма и образовывать очаги вторичного опухолевого роста. СМА - чрезвычайно важный показатель, так как условия теста наиболее близки к условиям естественного образования метсатазов и в большей степени отражают процесс истинного метастазирования опухолевых клеток. Таким образом, имеющаяся в нашем распоряжении модель дает возможность изучать характер влияния на метастазирование различных генетических агентов.
Онкогены семейства Ras, имея возможность широкого воздействия на передачу самых разнообразных клеточных сигналов, могут модулировать процессы, связанные с опухолевой прогрессией и метастазированием (Chambers A.F. Tuck А. В. 1993).
Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей, при этом в большинстве опухолей обнаружены мутации только в одном из генов семейства ras (Almoguera С. et al, 1988).
В настоящее время накопилось большое число работ, посвященных роли Ha-Ras в злокачественной трансформации клеток. Однако механизм его влияния на метастазирование до сих пор не ясен.
Более того, конкретные механизмы и роль отдельных эффекторов Ha-Ras в метастазировании варьируют в зависимости от используемых моделей. Получение разных результатов в разных моделях может зависеть от тканеспецифичности, видоспецифичности используемых моделей, а также от того, какой именно ген Ras использовался для модуляции метастазирования.
Ранее на использованной нами модели было показано, что введение активированного онкогена N-Ras не оказывает принципиального влияния на метастатический потенциал трансформированных фибробластов хомяка {Topol L.Z. et al, 1993).
Вместе с тем, согласно литературным данным, среди представителей семейства Ras на метастазирование в наибольшей мере влияет Ha-Ras (Maruyama С. et al., 2001; Moon A. et al, 2000; Schlatter B. et al, 1992).
Поэтому в данной работе мы решили воспользоваться именно этим онкогеном для модуляции метастатического потенциала. Целью данной работы является анализ влияния Ha-ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов сирийского хомяка и идентификация сигнальных путей, осуществляющих это влияние.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Трансфекция низкометастазирующих RS V-трансформированных фибробластов сирийского хомяка мутантними вариантами активированного Ha-ras: (Ha-rasV12, Ha-rasV12G37, На-rasV12S35, Ha-rasVl2C40) и сравнительный анализ метастатической активности полученных трансфектантов.
2. Трансфекция активной формы RalA в спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Трансфекция доминантно негативной формы RalA в высокометастазирующие спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Сравнительный анализ метастатической активности полученных линий.
4. Сравнительный анализ молекулярно-биологических характеристик полученных линий: подвижности клеток, скорости пролиферации, способности к инвазии in vitro и колониеобразования,
5. Определение в полученой панели клеточных линий экспрессии белков S100А4, фосфо-паксилина, Erkl/Erk2, Циклина Dl.
6. Определение уровеня секреции металлопротеаз в исследуемых клеточных линиях.
7. Определение устойчивости к перекиси водорода и способности катаболизировать перекись водорода исследуемых клеточных линий. В результате исследований впервые показано, что активация онкогена Ha-ras существенно увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка, при этом основной вклад вносит Ha-ras/Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.
Показано, что в клетках сирийского хомяка, активация Raf киназы не приводит к увеличению метастатической активности.
Было показано, что экспрессия конститутивно активной формы RalA достоверно увеличивает метастатическую активность как RSV-трансформированных, так и спонтанно трансформированных линий эмбриональных фибробластов хомяка.
Впервые показано, что приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением количества активной формы RalA.
Показано отсутствие зависимости между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротиеназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенной активной формы RalA приводит к снижению уровня экспрессии исследуемых металлопротиеназ.
Показано, что метастатическая активность клеток коррелирует с устойчивостью клеток к перикиси водорода.
Таким образом, получена уникальная модельная система клеточных культур, несущих различные экзогенные последовательности и отличающиеся метастатическим фенотипом. Дальнейшие эксперименты с полученными линиями позволят пролить свет на механизм реализации На-Ras- и RalA- опосредованной модуляции метастазирования в клетках RSV-трансформированных и спонтанно трансформированных фибробластов сирийского хомяка.
