Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Исторические данные и результаты крупных исследований по немедленной однократной внутрипузырнои инстилляции различных цитостатиков 12
1.2 Основные положения в проведение адъювантной химиотерапии у больных НМИ РМП разных групп риска 17
1.3 Различные варианты схем и режимов ВПХТ 19
1.4 Способы повышения эффективности ВПХТ 23
1.5 Физические факторы воздействия и сочетания физико-химических методов при НМИ РМП 30
1.5.1 ФДТ поверхностного РМП 30
1.5.2 НИЛИ в онкологии 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Доклиническое изучение безопасности сочетанного применения ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ на модели животных 41
2.2 Изучение накопления митомицина С в опухоли и нормальной слизистой мочевого пузыря при различных вариантах лечения (ВПХТ; ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ) 45
2.3 Применение методик ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ у больных НМИ РМП 49
2.3.1 Общая характеристика больных 49
2.3.2 Характеристика больных в группе ВПХТ 54
2.3.3 Характеристика больных в группе ФДТ+ВПХТ 58
2.3.4 Характеристика больных в группе НИЛИ+ВПХТ 62
2.3.5 Сравнительная характеристика больных 67
2.4 Характеристика методов обследования и лечения 73
2.4.1 Характеристика методов предоперационного обследования больных и последующего динамического наблюдения 73
2.4.2 Характеристика больных в группе ВПХТ 77
2.4.3 Методика лечения больных группы ФДТ+ВПХТ 80
2.4.4 Методика лечения больных группы НИЛИ+ВПХТ 84
2.5 Статистическая обработка данных 85
Глава 3. Результаты исследования 86
3.1 Результаты доклинического изучения безопасности сочетанного применения ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ на модели животных 86
3.2 Результаты распределения митомицина С в тканях 88
3.2.1 Группа ФДТ+ВПХТ 88
3.2.2 Группа НИЛИ+ВПХТ 90
3.2.3 Сравнение результатов концентрации митомицина С в тканях при различных вариантах лечения 94
3.3 Оценка безрецидивной выживаемости 96
3.3.1 Группа ВПХТ 96
3.3.1.1 Влияние факторов прогноза на показатели безрецидивной выживаемости 97
3.3.2 Группа ФДТ+ВПХТ 99
3.3.3 Группа НИЛИ+ВПХТ 99
3.4 Результаты оценки токсических реакций 100
3.4.1 Группа ВПХТ 100
3.4.2 Группа ФДТ+ВПХТ 100
3.4.3 ГруппаНИЛИ+ВПХТ 101
3.4.4 Частота возникновения токсических реакций в зависимости от вида проводимой терапии 102
Глава 4. Обсуждение результатов 104
Выводы: 114
Практические рекомендации: 115
Приложение 1. Факторы риска рецидива и прогрессирования поверхностного РМП 116
Приложение 2. Вероятность возникновения рецидива и прогрессирования в зависимости от факторов риска 117
Приложение 3. Схема риск-адаптированной терапии НМИ РМП 118
Список литературы: 119
- Способы повышения эффективности ВПХТ
- Изучение накопления митомицина С в опухоли и нормальной слизистой мочевого пузыря при различных вариантах лечения (ВПХТ; ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ)
- Методика лечения больных группы ФДТ+ВПХТ
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность темы
Рак мочевого пузыря (РМП) является актуальной проблемой онкоурологии. Это связано, прежде всего, с высокими показателями заболеваемости и смертности от данной патологии. Ежегодно в мире регистрируют до 200 тыс. новых случаев РМП. В России в 2009 году выявлено 13260 новых случаев РМП, стандартизованный показатель заболеваемости составил 12,18 на 100 тыс. мужского населения. У женщин в 2009 году отмечено 2828 случаев РМП, стандартизованный показатель заболеваемости составил 1,82 на 100 тыс. женского населения (Чиссов В. И. с соавт., 2010 г).
Немышечно-инвазивный (ИМИ) (поверхностный) РМП
характеризуется непрерывно прогрессирующим течением, частым рецидивированием. Так, рецидив наблюдается в 30 % случаев при наличии одиночной опухоли и достигает 90 % при мультифокальном поражении мочевого пузыря, причем множественные опухоли выявляют у 30 % больных (Lindemann К et al, 2008). Прогрессирование опухоли и развитие мышечно-инвазивного РМП наблюдается в 15 % случаев при Та и в 33 % - при ТІ. В зависимости от размера опухоли, прогрессирование наблюдается в 10 % случаев при опухолях < 3 см и в 35 % при размерах опухоли > 3 см (Botteman MF et al, 2003; EAU Guidelines, 2011). В связи с высокой частотой возникновения рецидивов и прогрессирования поверхностного РМП, лечение данной патологии зачастую является сложной задачей.
При лечении поверхностного РМП успешно используется трансуретральная резекция мочевого пузыря (ТУР). Однако вероятность возникновения рецидива после выполнения только ТУР достаточно высока и в среднем составляет 51%, при этом примерно 50% рецидивов возникают в течение 1-го года наблюдения (Мартов А.Г. и соавт., 2001; Lamm et al, 2008). Основными методами адъювантного лечения (профилактики) НМИ РМП являются внутрипузырная химиотерапия (ВПХТ), иммунотерапия, фотодинамическая терапия (ФДТ), позволяющие уменьшить количество
рецидивов в среднем на 20% (Русаков И.Г. и соавт., 2003, Oosterlinck W et al, 2004).
На сегодняшний день ФДТ поверхностного РМП в клиниках мира используется как вторая линия терапии при неэффективности лечения различными внутрипузырными агентами, чаще всего БЦЖ терапии. Использование метода в такой ситуации позволяет достичь выживаемости без рецидива при максимальном сроке наблюдения более 2 лет в среднем у каждого второго больного (Berger АР et al, 2003).
Перспективным является сочетанное использование ФДТ с ВПХТ. При такой комбинации, по мнению ряда авторов, может быть увеличена биодоступность опухолевых клеток к различных химиотерапевтическим агентам (van der Heijden AG et al, 2003; Lottner С et al, 2004; Svatek RS et al, 2009). Так, например, в клинических исследованиях по оценке эффективности комбинированной терапии с применением ФДТ и митомицина С у больных поверхностным рецидивным РМП после проведенного лечения (ТУР, внутрипузырная химио- или иммунотерапия) за 2 года последующего наблюдения рецидивы заболевания отмечены только у 35% больных (French AJ et al, 2004 Skyrme RJ et al, 2005). Сочетание ВПХТ с гипертермией/ электродиффузией по данным многих авторов достоверно увеличивает эффективность терапии цитостатиками, снижая количество рецидивов на 20-25%, по сравнению со стандартной химиотерапией, однако это сопряжено с увеличением побочных реакций (Brausi М et al, 1998; Colombo R et al, 2003; Di Stasi SM et al, 2006). Стоит отметить, что подобные исследования в большинстве случаев являются экспериментальными и не отображают четких рекомендаций в применении того или иного метода.
Таким образом, вопрос об эффективности сочетанного применения ВПХТ с различными факторами физического воздействия (ФДТ, электродиффузия, гипертермия, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ)) остается актуальным и не решенным. В связи с этим разработка і поиск новых методов лечения НМИ РМП, а также профилактики рецидив; заболевания являются актуальной проблемой современной онкоурологии.
Цель исследования
Повысить эффективность лечения больных немышечно-инвазивным РМП промежуточного риска развития рецидива опухоли при использовании комбинации методов адъювантного лечения (ФДТ+ВПХТ или НИЛИ+ВПХТ) и стандартной ТУР.
Задачи исследования
-
Разработать методы комбинированного адъювантного лечения на основании оценки характера местных токсических реакций и определить возможность применения в клинике на модели животных при проведении ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
-
Изучить распределение химиопрепарата и его концентрацию в опухолевой ткани и нормальной слизистой оболочке мочевого пузыря при различных вариантах лечения: ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
-
Разработать методы комбинированного адъювантного лечения больных НМИ РМП с использованием ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
-
Оценить эффективность разработанных методов комбинированного адъювантного лечения при использовании ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ у больных НМИ РМП промежуточного риска;
-
Оценить характер и частоту осложнений, общих и местных токсических реакций у больных НМИ РМП после проведенного комбинированного адъювантного лечения.
Научная новизна
Впервые в Российской Федерации разработана и внедрена в клиническую практику методика ВПХТ с применением НИЛИ и ФДТ. Применение данных методов у больных поверхностным РМП способствует более адекватному перераспределению химиопрепарата, при котором накопление больших количеств цитостатика происходит в опухолевой ткани.
На основе анализа экспериментальной работы, проведенной на модели животных, продемонстрирована эффективность и безопасность новых методов ВПХТ с использованием НИЛИ и ФДТ.
Проведено сравнение эффективности ВПХТ в стандартном режиме, а также в комбинации с ФДТ и НИЛИ на сопоставимых группах пациентов.
Практическая значимость
Проведение НИЛИ в комбинации с ВПХТ приводит к перераспределению накопления цитостатика в нормальных и опухолевых тканях слизистой мочевого пузыря, что сопровождается увеличением содержания химиопрепарата в опухоли, потенцируя более выраженное противоопухолевое действие препарата без увеличения риска развития осложнений проводимого лечения.
Внедрение в клиническую практику методики ВПХТ с использованием НИЛИ и ФДТ позволит повысить эффективность внутрипузырной цитотоксической терапии и увеличить продолжительность безрецидивного периода у больных НМИ РМП после выполненной стандартной ТУР.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Не смотря на улучшение показателей безрецидивной выживаемости
при применении стандартной ВПХТ после ТУР, риск возникновения рецидива
после проведенного лечения остается высоким.
-
Использование метода ВПХТ в комбинации с НИЛИ приводит к адекватному перераспределению цитостатика в тканях, при котором более высокие концентрации химиопрепарата отмечаются в опухолевой ткани.
-
В группах комбинированного лечения с использованием ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ не отмечено ни одного случая рецидива за медиану периода наблюдения 16 мес, что свидетельствует о высокой эффективности данных методов у больных поверхностным РМП промежуточного риска.
4. Токсичность и частота развития побочных эффектов при применении методов комбинированного лечения минимальна, что свидетельствует об их безопасности при применении в клинической практике.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на международном конгрессе по фотодинамической терапии (Хорватия, 2008), международном научно-образовательном форуме «Онкохирургия 2010» (Москва, 2010), Немецко-Российском симпозиуме «Новые возможности фотодинамической терапии в лечение онкологических больных» (Германия, Мюнхен, 2010), 8 международном симпозиуме «Фотодинамическая терапия и фото диагностика в клинической практике» (Италия, Бриксен, 2010).
Апробация диссертации состоялась на межотделенческой конференции ФГУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздравсоцразвития России 10 февраля 2011г.
Внедрение результатов в клиническую практику
Результаты исследования внедрены в лечение больных НМИ РМП отделения онкоурологии МНИОИ им. П. А. Герцена.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, среди них 2 статьи в центральной печати и 4 тезиса в материалах научных конференций и съездов. По теме диссертации получен патент «Способ лечения злокачественных опухолей мочевого пузыря» №2405601 от 10.12.2010г.
Объем и структура диссертации
Способы повышения эффективности ВПХТ
В последнее время в онкоурологической практике достаточно большое внимание уделяется методам повышения эффективности внутрипузырной химиотерапии [61]. По мнению Wientjes и соавт., дилюция препарата в остаточной моче или чрезмерная выработка мочи в период экспозиции, неустойчивость некоторых химиотерапевтических препаратов при низком уровне рН, неадекватная экспозиция, ограничение проникновения препарата в стенку мочевого пузыря — все это может привести к неполному и неустойчивому ответу на внутрипузырную химиотерапию [164].
Дилюция химиопрепарата возникает вследствие избыточной экскреции мочи, либо при проведении инсталляции при наполненном мочевом пузыре. Так, в работе Аи и соавт. показано, что эффективность ВПХТ существенно снижается при введении цитостатика в не опорожненный мочевой пузырь [29]. Также показано, что отказ от употребления жидкости за 6 часов до проведения инстилляции снижает дилюцию препарата до 20% за счет сокращения диуреза. Применение антидиуретического гормона десмопрессина 0,2 мг перорально за 1 час до инстилляции еще более эффективно, чем отказ от употребления жидкости. Увеличивая реабсорбцию и, как следствие, повышая концентрацию мочи и уменьшая её объём, десмопрессин вызывает увеличение средней концентрации химиопрепарата до 38%. Однако из-за наличия побочных эффектов, прием препарата должен строго контролироваться. Его можно применять при отсутствии сердечной недостаточности и гипонатриемии. Необходимо ограничить прием жидкости за 1 час до и 8 часов после применения десмопрессина, чтобы избежать задержки жидкости в организме [46]. Эта простая методика рекомендуется Европейской Ассоциацией Урологов [117].
Ряд исследований показал, что стабильность химиопрепарата, его поглощение клетками, а также глубина проникновения напрямую зависят от кислотности мочи. Эти показатели увеличиваются при ощелачивании мочи путем перорального приема гидрокарбоната натрия. Необходимая доза составляет 1,5 г на ночь, утром и за 30 минут до каждой инстилляции. Этого достаточно, чтобы достичь оптимальной концентрации мочи рН 7 [29,61,162].
С целью улучшения проникновения препарата в стенку мочевого пузыря путем увеличения её проницаемости в нескольких исследованиях продемонстрирована эффективность применения системы для направленного электрофореза химиопрепаратов (EMDA system) [66,147]. Механизм действия EMDA основан на ионофорезе и электро-осмотическом феномене, позволяющем усиливать транспорт препарата через биологические мембраны в 6-9 раз и значительно увеличивать эффективность внутрипузырных инсталляций цитостатиков по сравнению с пассивной диффузией [47,55,66,138].
В исследовании М. Brausi и соавт. на модели маркерных опухолей эффективность электрохимиотерапии митомицином (20 минут) была равна эффективности внутрипузырных инстилляций митомицина с экспозицией 2 часа. Частота возникновения рецидива была выше в группе митомицина и составила 60%, при электрохимиотерапии - 33%. Безрецидивный период в группах электродиффузии и митомицина составил 14,5 и 10 месяцев соответственно. Авторы делают вывод, что снижение частоты рецидивов и более продолжительный безрецидивный период, наблюдаемый в группе пациентов EMDA и химиотерапии, можно объяснять большим проникновением митомицина вглубь стенки мочевого пузыря под воздействием электрического тока. Поскольку электрофорез увеличивает транспорт химипрепарата по сравнению с пассивной диффузией, становится возможным развитие системных побочных эффектов. Однако в этом исследовании не наблюдалось существенных местных токсических реакций и изменений в анализе крови в двух группах пациентов [39].
В работе Di Stasi с соавт. проведена сравнительная оценка эффективности комбинированной внутрипузырной иммунотерапии вакциной БЦЖ с последующей электродиффузией митомицина и стандартной БЦЖ-терапии. В исследование включено 212 больных НМИ РМП промежуточного и высокого риска. Больных рандомизировали на 2 группы: пациенты контрольной группы (п=105) получали внутрипузырную инстилляций вакцины БЦЖ в дозе 81 мг раз в неделю в течение 6 недель, длительность экспозиции составила 120 минут. Больным исследуемой группы (п=107) проводили внутрипузырные инстилляций вакцины БЦЖ в дозе 81 мг раз в неделю в течение 2 недель с последующей инстилляцией митомицина в дозе 40 мг посредством электродиффузии (сила тока 20 мА на протяжении 30 минут) раз в неделю в качестве полного курса, общей продолжительностью до 3 курсов. Медиана наблюдения составила 88 месяцев. Безрецидивный период у больных в группе комбинированного лечения составил 69 месяцев, в контрольной группе — 21 месяц, таким образом, преимущество терапии в группе комбинированного лечения с применением электродиффузии митомицина составило 48 месяцев (р=0,0012). Частота развития рецидива заболевания в опытной группе также была достоверно меньше, чем в контрольной группе (41,9% и 57,9% соответственно). Прогрессирование заболевания отмечено у 9,3 % больных основной группы и у 21,9 % контрольной (р=0,004). Частота побочных эффектов не различалась в обеих группах больных [54].
Альтернативным способом улучшения проницаемости слизистой оболочки мочевого пузыря является микроволновая гипертермия (МВГТ). Методика гипертермии заключается во внутрипузырном введении химипрепарата, нагретого до 42 - 44 С, что, в свою очередь, требует применения анальгезии. По данным ряда исследований МВГТ позволяет увеличить эффективность инсталлируемых препаратов, повышая показатели безрецидивной выживаемости на 30 - 50% [48,108,121].
В исследовании Leib и соавт. включено 33 больных НМИ РМП умеренного и высокого риска. После выполненной ТУР, больных рандомизировали на две группы: в первой, в качестве адъювантного лечения, проводили 8 инстилляций митомицина 40мг еженедельно и 4 - ежемесячно, во второй группе, к такой же схеме внутрипузырных введений, была добавлена гипертермия. За 2-х летний период наблюдения в группе комбинированного лечения только у одного больного был выявлен рецидив против 7 больных контрольной группы. Токсические проявления были минимальными в обоих вариантах лечения [95].
В работе van der Heijden и соавт. проведена оценка эффективности адъювантного комбинированного лечения у больных рецидивным РМП промежуточного и высокого риска. В исследовании участвовало 90 пациентов, при этом у 41 ранее была проведена иммунотерапия вакциной БЦЖ без эффекта. Режим лечения включал 6-8 курсов ВПХТ еженедельно и 4-6 -ежемесячно в сочетании с МВГТ. Анализ полученных данных проводился по методу Каплан Майер. Установлено, что через год после лечения у 14,3%, а через два года у 24,6% больных был выявлен рецидив заболевания. Авторы делают вывод, что сочетанное использование МВГТ и ВПХТ может применяться в качестве адъювантного лечения у больных НМИ РМП умеренного и высокого риска, особенно в качестве второй линии терапии, при неэффективности БЦЖ [153].
Одним из перспективных направлений в повышении эффективности ВПХТ является комбинированное применение различных химиотерапевтических агентов и сочетание химиотерапии с иммунотерапией вакциной БЦЖ. В работе Rintala и соавт. проведен анализ эффективности комбинированной терапии митомицином и вакциной БЦЖ. Анализ результатов исследования показал, что комбинированная терапия достоверно увеличивает безрецидивную выживаемость больных поверхностным РМП с плохим прогнозом (CIS, T1G3). В группе хорошего прогноза (ТаIGI) статистически значимых различий безрецидивной выживаемости между комбинированным лечением и монотерапией не получено [128].
В то же время исследование Kaasinen и соавт. показало, что комбинированная терапия (митомицин + БЦЖ) не обладает преимуществом в предотвращении возникновения рецидива заболевания. За период наблюдения 56 мес. безрецидивная выживаемость в группе больных, получавших монотерапию вакциной БЦЖ, была достоверно выше (р=0,03), чем в группе комбинированной терапии. Тем не менее, частота побочных эффектов была ниже в опытной группе [82]. Токсические проявления 30 мг митомицина С и 81 мг вакцины БЦЖ в совместном использовании оценил в своей работе Solsona и соавт. По данным авторов такая схема внутрипузырных инстилляций является очень токсичной, в виду чего, количество митомицина доллшо быть снижено до 10мг. Но и такой режим комбинированного лечения, по своей токсичности превосходил стандартную (81мг) дозировку БЦЖ, 7,8% и 7,3% соответственно. При этом за медиану наблюдения 22,4мес, безрецидивная выживаемость была значительно выше в группе БЦЖ и митомицина (р=0,03). В заключении авторы делают вывод, что вариант комбинированного лечения может использоваться только у больных НМИ РМП высокого риска, однако требуются дальнейшие наблюдения [136].
Изучение накопления митомицина С в опухоли и нормальной слизистой мочевого пузыря при различных вариантах лечения (ВПХТ; ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ)
До начала клинического исследования, совместно с факультетом аналитической химии МГУ им. М.В. Ломоносова, проведена исследовательская работа по изучению концентрации митомицина С в нормальной слизистой и опухолевой ткани мочевого пузыря при различных вариантах лечения: ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ. В исследовании участвовало 27 больных ИМИ РМП, не получавших ранее никакого противоопухолевого лечения. По окончанию исследования всем 27 больным выполнено стандартное лечение: ТУР мочевого пузыря с немедленной однократной инстилляцией химиопрепарата.
Исследование проводилось в 2 этапа: на первом - всем больным обеих доклинических групп внутрипузырно вводили митомицин в дозе 40мг с экспозицией 1 час. Далее выполняли биопсию нормальной слизистой и опухолевой ткани мочевого пузыря для определения концентрации митомицина С методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На втором этапе (через 7 дней) - 14 больным проводили сеанс ФДТ с Аласенсом (п. 2.3.3), а 13 пациентам - сеанс НИЛИ (п. 2.3.4) с облучением всех стенок мочевого пузыря. Сразу после облучения, в обоих случаях, выполнялась внутрипузырная инстилляция 50мл раствора митомицина с экспозицией 1 час. У каждого больного групп ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ проводили биопсию неизмененной слизистой и опухоли мочевого пузыря для определения концентрации митомицина методом ВЭЖХ. Биоптаты помещали в пластиковую пробирку, содержащую 1 мл физиологического раствора.
Хроматографические эксперименты выполняли на приборном комплексе «Agilent 1100» (США), включающем бинарный градиентный насос, автосэмплер, термостат колонки, квадрупольный масс-спектрометрический детектор серии SL, снабженный источником электрораспылительной ионизации и компьютерную систему для сбора и обработки данных.
Разделение проводили на хроматографической колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 (США). Пробы взвешивали на аналитических весах OHAUS Explorer Pro с точностью 0,0001 г. Для гомогенизации проб использовали гомогенизатор SilentCrusher, снабженный насадкой типа 3F фирмы «Heidolph» (Германия) и ультразвуковую баню «Сапфир» (Россия). Перед вводом в хроматограф пробы центрифугировали на центрифуге Elmi СМ-50 (Латвия) при скорости вращения 18000 об/мин. Для отбора точных объемов жидкостей использовали дозаторы переменного объема 10-100 и 100-1000 мкл, фирмы «HTL» (Польша). Для приготовления растворов известной концентрации использовали Митомицин С, а также ацетонитрил, марки HPLC (High performance liquid chromatography), «Panreac» (Испания). Растворы готовили на деионизованной воде сопротивлением не менее 18,2 Мом.
Для градуировки использовали образец ткани не содержащей митомицин. Образец массой около 50 мг гомогенизировали с 0,5 мл физиологического раствора, в гомогенат вносили необходимое количество стандартного раствора митомицина и добавляли деионизованную воду в таком количестве, чтобы суммарный объем жидкости (физиологического раствора, стандартного раствора митомицина и воды) был равен 1 мл. Далее гомогенат помещали на 5 минут на ультразвуковую баню. Смесь центрифугировали в течение минуты, отбирали надосадочную жидкость и вводили в хроматограф.
В качестве подвижной фазы выбраны смеси воды и ацетонитрила в различных соотношениях, так как обычно при использовании таких смесей удается добиться наибольшей эффективности и симметричности хроматографического пика. Увеличение доли ацетонитрила ведет к уменьшению времени удерживания митомицина (рисунок 2.3, см.стр. 47).
Определение митомицина в нормальной слизистой и опухоли проводили в два этапа. На первом этапе отбирали физиологический раствор, в котором находился образец ткани. Измеряли объем отобранной жидкости и вводили в хроматограф. Второй этап - определяли содержание митомицина непосредственно в ткани. Для этого пробирку с тканью взвешивали на аналитических весах, затем добавляли 0,5 мл экстрагента и помещали на 2 мин на ультразвуковую баню. Обнаружено, что наилучшим экстрагентом является вода, так как при ее использовании удается добиться наиболее полной экстракции из-за наибольшего разбухания образца ткани. Ультразвуковую баню использовали для интенсификации процесса экстракции, т.е. сокращения времени пробоподготовки, и увеличении степени извлечения митомицина из ткани. Температуру воды в бане поддерживали на уровне 40С во избежание разложения митомицина. Далее полученный раствор с осадком центрифугировали (16000 об/мин) в течение 2 мин и отобранную надосадочную жидкость вводили в хроматограф. После этого содержимое пробирки удаляли, выдерживали пустую пробирку в течение 2 ч в сушильном шкафу при температуре 150С и взвешивали пустую пробирку на аналитических весах. Массу ткани находили по разности полученных величин. Затем суммировали концентрации митомицина, полученные на первом и втором этапах и пересчитывали содержание данного вещества на 1 г ткани.
В оптимальных условиях была построена градуировочная зависимость площади пика от концентрации митомицина. Для построения зависимости использовали экстракты из контрольного, т.е. не содержащего митомицин образца ткани, с добавлением известного количества митомицина.
Таким образом, метод ВЭЖХ, позволяющий количественно оценить содержание препарата в биологических тканях, был использован для определения митомицина в реальных образцах биологической ткани.
Методика лечения больных группы ФДТ+ВПХТ
Всем больным исследуемой группы ФДТ+ВПХТ на первом этапе лечения проводили ТУР по общепринятой методике с немедленной однократной инстилляцией митомицина С в дозе 40 мг на 50 мл 0,9% изотонического р-ра хлорида натрия. Через неделю после операции проводили адъювантное сочетанное лечение: сеанс ФДТ с препаратом Аласенс, сразу после облучения внутрипузырное введение препарата митомицин С. Лечение включало 6 адъювантных курсов ФДТ+ВПХТ. Интервал между проводимыми курсами составлял 7 дней. Все послеоперационные манипуляции проводились в амбулаторных условиях (рисунок 2.34).
Материально-техническое обеспечение для проведения сеанса ФДТ и ВПХТ (пункты 1-5 - Германия; 6,7,9 - Россия; 8 - Япония):
1 - медицинский монитор настольная модель, цветовая система PAL/NTSC, максимальное разрешение 1024 х 768 (XGA) SDI, размер экрана 17" (рис. 2.29);
2 - блок управления камерой TELECAM SL II, цветовая система PAL/NTSC, со встроенным модулем обработки изображения и выходом DV (рис. 2.29);
3 - источник света XENON NOVA (рис. 2.29);
4 - универсальная роликовая помпа, для ирригации ENDOMAT комплект по Hamou (рис. 2.29);
5 - цистоуретрофиброскоп (гибкий), угол обзора 1100, размером 15,5Шр (рисунок 2.35);
6 - лазерная установка с длиной волны 630 нм и мощностью не менее 1,5 Вт (ООО «Биоспек») (рисунок 2.36);
7 - световод для фотодинамической терапии со сферическим диффузором длиной 5 мм для внутриполостного облучения (ООО «Биоспек») (рисунок 2.37);
8 - митомицин-С Киова — химиопрепарат для приготовления инъекционного раствора в количестве 40мг;
9 - Аласенс - препарат для флюоресцентной диагностики и ФДТ (НИОПИК);
10 - кресло цистоскопическое.
В день проведения сеанса ФДТ и ВПХТ, непосредственно за 1,5-2 часа до облучения внутрипузырно вводили 3% раствор Аласенса, предварительно разведенного в 50мл 5% гидрокарбоната натрия. Перед началом ФДТ раствор Аласенса эвакуировали.
С целью обезболивания в уретру вводили анестетик с 2% лидокаином на гелевой основе. Экспозиция составляла 5-7мин. Далее в полость мочевого пузыря проводили гибкий цистоуретрофиброскоп. Через аспирационный канал фиброскопа вводили 100мл 0,9% NaCl. Проводили оценку состояния всех стенок мочевого пузыря по степени выраженности местно-тканевых реакций. По каналу фиброскопа в полость мочевого пузыря проводили оптическое волокно и располагали в центре мочевого пузыря с целью диффузного облучения всех стенок. Режимы ФДТ:
1. мощность лазера- 1500мВт,
2. плотность энергии — 25 Дж/см2,
3. плотность мощности — 14мВт/см2,
4. время - 29,2 мин,
5. общая энергия — 2628 Дж.
По окончанию ФДТ удаляли оптическое волокно и опорожняли мочевой пузырь, при этом фиброскоп оставался в уретре. Через аспирационный канал вводили 50мл раствора митомицина С. Такой метод однократного использования цистоуретрофиброскопа при всех манипуляциях, был выгоден как для больного, так и с экономической позиции. Он позволял меньше травмировать уретру и полностью исключил необходимость использования уретрального катетера. Внутрипузырная экспозиция митомицина составляла 1 час. Сеансы ФДТ+ВПХТ проводили один раз в неделю, в течение 6 недель. По окончанию всех курсов больной оставался под динамическим наблюдением (п. 2.4.1). Все манипуляции после ТУР проводились в амбулаторных условиях.
Обсуждение результатов
РМП является одной из главных проблем современной онкологии. Это связано, прежде всего, с высокими показателями заболеваемости и смертности от данной патологии. К примеру в России в 2009 году зарегистрировано 13260 новых случаев РМП. Прирост заболеваемости РМП за год составил 14,85 %. Летальность на первом году с момента установления диагноза - 23,1 %. Для сравнения в Германии в 2009 г. диагностировано 27 тыс. больных РМП, а число умерших ежегодно составляет около 5 тыс. НМИ РМП выявляют у 74 % заболевших, причем у 67 % больных из данной группы при морфологическом исследовании верифицируют Та стадию, а у 33 % - ТІ или CIS. В России РМП I-II стадии выявлен в 61,3 % случаев, III — у 23,9% больных, IV-y 10,8% пациентов [26,56,96].
«Золотым стандартом» в лечение НМИ РМП уже многие годы является использование ТУР мочевого пузыря с немедленной однократной инстилляцией химиопрепарата всем больным, вне зависимости от группы риска. Однако вероятность возникновения рецидива после такого варианта лечения достаточно высока и в среднем составляет 51%, при этом примерно 50% рецидивов возникают в течение 1-го года наблюдения [11,92]. Существует ряд методов направленных на профилактику рецидива НМИ РМП. Внутрипузырные химио- и иммунотерапии, по сравнению с только ТУР, улучшают показатели безрецидивной выживаемости в среднем на 14% и 20% соответственно. Таким образом, поиск новых вариантов профилактики рецидива и прогрессирования является актуальным в онкоурологии[92,143].
При неэффективности лечения различными внутрипузырными агентами, чаще всего БЦЖ терапии, используется метод ФДТ поверхностного РМП как вторая линия терапии. Использование данного варианта лечения позволяет достичь безрецидивной выживаемости в среднем у каждого второго больного при максимальном сроке наблюдения более 2 лет [34].
В последнее время в онкоурологической практике достаточно большое внимание уделяется методам повышения эффективности ВПХТ. Однако исследования, направленные на изучение комбинированного применения ВПХТ с гипертермией, электродиффузией и ФДТ являются экспериментальными и не отображают четких рекомендаций в применении того или иного метода.
Целью настоящего исследования являлась разработка метода с целью повышения эффективности лечения больных НМИ РМП промежуточного риска развития рецидива опухоли при использовании комбинации методов адъювантного лечения (ФДТ+ВПХТ или НИЛИ+ВПХТ) и стандартной ТУР.
Для достижения поставленной цели сформулированы задачи исследования:
1. Разработать методы комбинированного адъювантного лечения на основании оценки характера местных токсических реакций и определить возможность применения в клинике на модели животных при проведении ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
2. Изучить распределение химиопрепарата и его концентрацию в опухолевой ткани и нормальной слизистой оболочке мочевого пузыря при различных вариантах лечения: ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
3. Разработать методы комбинированного адъювантного лечения больных НМИ РМП с использованием ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ;
4. Оценить эффективность разработанных методов комбинированного адъювантного лечения при использовании ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ у больных НМИ РМП промежуточного риска;
5. Оценить характер и частоту осложнений, общих и местных токсических реакций у больных НМИ РМП после проведенного комбинированного адъювантного лечения.
Доклиническое изучение безопасности сочетанного применения ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ на модели животных
Для определения токсичности применяемых методов адъювантного лечения был проведен протокол доклинического изучения безопасности сочетанного применения ФДТ с препаратом «Аласенс» и химиотерапии с препаратом митомицин С, а также низкоинтенсивного лазерного воздействия.
В качестве модели исследования токсических реакций выбрали кроликов самцов породы «Шиншилла». .
Результаты проведенной экспериментальной части исследования показали характерные изменения в полости мочевого пузыря при комбинированных методах воздействия по сравнению с монохимиотерапией. Более выраженный эффект наблюдался в группе ФДТ+ВПХТ, где на фоне фиброза подслизистого слоя наблюдался фиброз мышечного слоя. Тем не менее, сморщивание мочевого пузыря отмечено не было ни в одном из случаев. Проведя анализ гистологических заключений, был сделан вывод, что дальнейшее применение новых вариантов сочетанного использования ФДТ, НИЛИ и ВПХТ в клинической практике возможно.
Определение количества химиопрепарата в опухолевой ткани и в слизистой оболочке мочевого пузыря
Вторым этапом проведенной работы было исследование по изучению концентрации митомицина С в нормальной слизистой оболочке и опухолевой ткани мочевого пузыря при использовании ВПХТ, ФДТ+ВПХТ и НИЛИ+ВПХТ. В исследовании участвовало 27 больных НМИ РМП, промежуточного риска, не получавших ранее никакого противоопухолевого лечения. По окончанию исследования всем больным выполнен ТУР мочевого пузыря с немедленной однократной инстилляцией химиопрепарата.
Медиана распределения митомицина Су 14 больных группы ФДТ+ВПХТ в нормальной слизистой составила - 160,5 (33-420) мкг/г, в опухолевой ткани - 100,5 (20-198) мкг/г (р = 0,066). Медиана распределения митомицина С после ФДТ с Аласенсом в нормальной слизистой - 33,5 (9-220) мкг/г, в опухолевой ткани - 42 (10-353) мкг/г (р = 0,7). Полученные данные могут свидетельствовать о возможном перераспределении концентрации митомицина С в опухолевой ткани и нормальной слизистой после проведения сеанса ФДТ. При этом отмечается снижение содержания митомицина С как в опухолевой ткани, так и в нормальной слизистой, что по-видимому связано с цитопатическим механизмом действия ФДТ [18,20].
Медиана распределения митомицина С у 13 больных экспериментальной группы НИЛИ+ВПХТ в нормальной слизистой и опухолевой ткани достоверно различалась и составила соответственно 211 (38-380) мкг/г и 101 (57-158) мкг/г (р = 0,0009). Сеанс НИЛИ+ ВПХТ способствовал перераспределению накопления митомицина в неизмененной слизистой мочевого пузыря и опухолевой ткани. Так, медиана концентрации митомицина С после НИЛИ в неизмененом уротелии составила - 67 (4-202) мкг/г, в опухоли - 128 (1-453) мкг/г (р = 0,03). Таким образом полученные данные свидетельствуют о том, что проведение сеанса НИЛИ+ВПХТ способствует достоверному снижению концентрации митомицина в нормальной слизистой и наоборот, приводит к увеличению содержания химиопрепарата в опухоли. Вероятно это объясняется тем, что при использовании НИЛИ, проницаемость мембраны клетки повышается, происходит активация химических реакций, что в свою очередь может быть опосредованно изменению структуры цитоплазматической мембраны при поглощении излучения фотоакцепторными молекулами. Таким образом, биодоступность клетки возрастает, усиливая транспорт используемых цитостатиков в клетку. Это позволяет сделать вывод о возможном повышении эффективности ВПХТ с использованием данного метода [5,6,23].
Характеристика больных
В исследование включено 104 больных НМИ РМП промежуточной группы риска. У всех больных диагноз РМП верифицирован гистологически при биопсии опухоли после цистоскопического исследования или после выполненного оперативного вмешательства (ТУР). Контрольную группу составили 54 (52%) больных, которым выполнена ТУР, немедленная однократная инсталляция химиопрепарата и 6 курсов адъювантной ВПХТ. В одну исследуемую группу включено 25 (24%) пациентов, перенесших ТУР, немедленную однократную инстилляцию химиопрепарата и 6 сеансов адъювантной ФДТ+ВПХТ, в другую - 25 (24%) больных, которым выполнена ТУР, немедленная однократная инстилляция химиопрепарата и 6 сеансов НИЛИ+ВПХТ в адъювантном режиме.
