Введение к работе
Актуальность. Применение противоопухолевой химиотерапии ограничено дозолимитирующими побочными эффектами, что связано с отсутствием специфичности доставки противоопухолевых препаратов в опухоль. В связи с этим актуальными в настоящее время являются два направления достижения избирательности противоопухолевого действия:
- поиск новых лекарственных препаратов, избирательно связывающихся с опухолевыми клетками (мишень-ориентированные, «таргетные» препараты);
- совершенствование лекарственной формы (ЛФ) клинических препаратов, обеспечивающее селективное накопление лекарства в опухоли.
Эти направления реализовались в разработке липосомальных ЛФ противоопухолевых препаратов. Инкапсулирование цитостатиков в липосомы способствует уменьшению побочных эффектов путем экранирования контакта с органами - мишенями токсичности, а также улучшению биодоступности лекарственного вещества (ЛВ) за счет особенностей неоангиогенеза, особенно в солидных опухолях [Баллюзек Ф.В. и соавт., 2008; Барсуков Л.И., 1998; Барышников А.Ю. и соавт., 2000; Давыдов М.И., 2003; Hobbs S.K. et al., 1998]. Этот подход назван пассивной доставкой и реализован в онкологии для некоторых липосомальных противоопухолевых препаратов, в частности, доксорубицина (Докс) (Doxil, Caelyx, Myocet, Липодокс), даунорубицина (DaunoXome), винкристина (VincaXome, Marqibo), цисплатина (Lipoplatin, Липоплат), оксалиплатина (Lipoxal), митоксантрона (LEM) и др., а также интенсивно изучается в эксперименте при доклиническом изучении новых ЛФ [Оборотова Н.А., 2001; Шалимов С.А. и соавт., 2004; Шубина Д.А. и соавт., 2006; Martin F., Boulikas T., 2000].
Для осуществления стратегии направленного транспорта лекарственного агента в настоящее время интенсивно изучаются иммунолипосомальные конструкции (ИК), направленные к опухолеассоциированным поверхностным антигенам или рецепторам на опухолевых клетках. В качестве векторных лигандов лучшими признаны моноклональные антитела (МКА), пептиды или факторы роста, которые избирательно связываются с соответствующей мишенью [Lopes de Menezes D.E., 1998; Maruyama K. et al., 1995; Mastrobattista E. et al., 1999; Park J.W., 2002; Sugano M. et al., 2000]. В РОНЦ
им. Н.Н. Блохина РАМН разрабатываются ИК противоопухолевых препаратов различных классов. В качестве основных мишеней выступают поверхностные антигены CD5, CD20, MUC-1 и HLA-DR, экспрессированные на клетках Т-клеточного лейкоза, В-клеточной лимфомы и злокачественных опухолях эпителиального происхождения [Соколова Д.В. и соавт., 2010; Толчева Е.В., 2007]. На этапах экспериментального изучения противоопухолевой активности ИК необходимы адекватные модели опухолевого роста in vitro (прескрининг) и in vivo (скрининг, углубленное и доклиническое изучение). Адекватной моделью является клеточная линия опухоли человека со ста бильной селективной гиперэкспрессией сигнальных антигенов, к которым специфичны МКА, конъюгированные с ИК. Для in vivo желательна идентичность модели исходной опухоли и способность к росту у иммунодефицитных животных в виде ксенографтов. Такая модель должна иметь также адекватные кинетические параметры (достаточно длительную фазу экспоненциального роста, образование измеряемых опухолевых узлов и т.д.), а также способность к неоваскуляризации для эффективной доставки ЛВ к мишени [Kelland L.R., 2004; Siwak D.R. et al., 2002; Troiani T. et al, 2008]. Данная работа посвящена разработке ИК Докс против MUC-1 и HLA-DR антигенов с улучшенными терапевтическими характеристиками и разработке условий для их экспериментального изучения in vitro и in vivo.
Цель исследования: разработка иммунолипосомальных конструкций доксорубицина и адекватных опухолевых моделей для их доклинического изучения.
Задачи исследования:
1. Получить иммунолипосомальные конструкции с доксорубицином, направленные против MUC-1, HLA-DR антигенов-мишеней.
2. Определить химико-фармацевтические характеристики полученных иммунолипосомальных конструкций.
3. В системе in vitro оценить цитотоксичность и специфичность связывания иммунолипосомальных конструкций с мишенью.
4. Адаптировать к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude клеточные линии рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 человека, экспрессирующих сигнальные антигены-мишени.
5. Охарактеризовать подкожные ксенографты T-47D, SKOV3 и лимфомы Беркитта по основным биологическим характеристикам: гистотип, кинетика роста, ангиогенная активность, экспрессия антигенов-мишеней в процессе пассирования на мышах.
Научная новизна
Впервые:
в РФ получены две ИК против антигенов MUC-1 и HLA-DR известного противоопухолевого антибиотика Докс с высокой степенью включения действующего вещества;
in vitro на антиген-положительных клетках опухолей человека банка клеточных культур РОНЦ показана высокая цитотоксическая активность и иммунологическая специфичность полученных ИК;
адаптирована к росту под кожей у иммунодефицитных мышей Balb/c nude разведения РОНЦ клеточная линия рака молочной железы человека T-47D из Коллекции РОНЦ;
установлены основные биологические характеристики подкожных (п/к) ксенографтов: лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, аденокарциномы яичников SKOV3 и рака молочной железы человека T-47D, экспрессирующих MUC-1, HLA-DR, CD19 антигены-мишени;
выявлен высокий уровень ангиогенной активности полученных ксенографтов по экспрессии основных маркеров неоангиогенеза: VEGF, HIF-1, CD31;
in vivo сформирована панель моделей опухолей человека с высокой экспрессией маркеров опухолей эпителиального происхождения, а также злокачественной лимфомы для экспериментального (доклинического) изучения ИК, направленных против соответствующих мишеней.
Научно-практическая значимость. Получены и охарактеризованы по основным химико-фармацевтическим параметрам две иммунолипосомальные конструкции противоопухолевого антибиотика доксорубицин, направленные против MUC-1 и HLA-DR антигенов-мишеней. Разработаны адекватные опухолевые модели для исследования антипролиферативной активности адресных препаратов против указанных мишеней. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН создан мини-банк культур клеток лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 и соответствующих штаммов в количестве, достаточном для проведения исследований in vivo.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на следующих конференциях:
Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 2008» 3–5 декабря 2008 г.; Rusnanotech 6–8 октября 2009 г., Rusnanotech 2010 1–3 ноября 2010 г., Москва;
Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» 18–19 февраля 2009 г., Москва;
Пятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16–20 марта 2009 г., Москва;
IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 18–19 мая 2010 г., Нижний Новгород.
, Тюмень;
На межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 30 сентября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 2 глав с описанием результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (165 источников). Диссертация иллюстрирована 44 рисунками и 5 таблицами.
