Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы диагностики поверхностного рака мочевого пузыря (обзор литературы) 15
1.1. Современные методы диагностики . поверхностного РМП 15
1.2. Аутофлуоресцентная диагностика поверхностного РМП 18
1.3. Экзогенная флуоресценция в диагностике РМП 21
1.4. 5-АЛК индуцированная флуоресцентная диагностика поверхностного РМП 23
1.5. ФД РМП с фотосенсибилизаторами нового
поколения 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Общая характеристика больных 34
2.2. Флуоресцентная цистоскопия: аппаратура и расходные материалы 37
2.3. Аппаратура для проведения локальной флуоресцентной спектроскопии 38
2.4. Методика расчетов спектрально-флуоресцентных диагностических параметров 41
2.5. Препарат Аласенс и методика проведения исследования 42
2.6. Методика исследования лазер-индуцированной
ау то флуоресценции у больных поверхностным РМП 43
2.7. Методика проведения флуоресцентной цистоскопии и локальной флуоресцентной спектроскопии 45
Глава 3. Исследование лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормальной слизистой и очагов поверхностного рака мочевого пузыря 52
3.1. Результаты исследования аутофлуоресценции нормальной слизистой и очагов поверхностного рака мочевого пузыря 52
3.2. Сравнительный анализ спектров аутофлуоресценции нормальной слизистой и очагов РМП 61
3.3. Обсуждение полученных результатов 63
Глава 4. Изучение эффективности метода флуоресцентной цистоскопии и локальной флуоресцентной спектроскопии в диагностике поверхностного рака мочевого пузыря 68
4.1. Оценка диагностической значимости флуоресцентных параметров в опухоли и в нормальной слизистой оболочке МП у больных поверхностным РМП 68
4.2. Определение пороговых значений величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра в опухоли и в нормально слизистой оболочке МП у больных поверхностным РМП 84
4.3. Оценка диагностической значимости результатов флуоресцентной цистоскопии и локальной флуоресцентной спектроскопии у больных поверхностным РМП 86
4.4. Переносимость больными диагностической процедуры, осложнения исследования 88
4.5. Показания к проведению флуоресцентной цистоскопии с локальной флуоресцентной спектроскопией у больных поверхностным РМП 90
4.6. Обсуждение полученных результатов 91
Заключение 96
Выводы 102
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
- Современные методы диагностики . поверхностного РМП
- Флуоресцентная цистоскопия: аппаратура и расходные материалы
- Результаты исследования аутофлуоресценции нормальной слизистой и очагов поверхностного рака мочевого пузыря
- Оценка диагностической значимости флуоресцентных параметров в опухоли и в нормальной слизистой оболочке МП у больных поверхностным РМП
Введение к работе
Актуальность исследования
Рак мочевого пузыря (РМП) составляет 70% всех опухолей мочевого тракта и около 4% всех онкологических заболеваний. С 1996г. прирост показателя заболеваемости данной патологией составил 22,57% [Чиссов В.И., 2008]. В 2006 году заболеваемость злокачественными опухолями мочевого пузыря (МП) составила 8,93 человека на 100 тысяч населения. Ежегодно в нашей стране регистрируется 13022 больных с впервые в жизни установленным диагнозом РМП. На момент установления диагноза более чем у 2/3 больных (70-85%) выявляется поверхностный РМП, то есть рак с инвазией не глубже слизистого слоя - Та, Tis, ТІ [Матвеев Б.П., 2001].
Для РМП характерно частое рецидивирование. Процент рецидивов при наблюдении за больными в сроки до 10-15 лет после проведенного лечения составляет 50-95% [Матвеев Б.П., 2001, Русаков И.Г., 2003]. Основным методом лечения поверхностного РМП остается трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря. Рецидивирование заболевания после ТУР обусловлено мультицентричностью поражения слизистой мочевого пузыря, наличием не выявленных до операции очагов cr in situ, и возможностью имплантации опухолевых клеток во время ТУР [Кудашев Б.В., 2001].
Таким образом, основной проблемой является мультицентричный рост уротелиальных карцином. Современные методы диагностики (обычная цистоскопия в белом свете, множественные слепые биопсии, цитология мочи) не позволяют выявить все поверхностные плоские опухолевые очаги слизистой мочевого пузыря.
С целью определения адекватной тактики лечения РМП в течение этого заболевания выделяют основные и дополнительные факторы прогноза. Основными факторами прогноза при поверхностном РМП являются степень дифференцировки опухоли, количество опухолей к моменту лечения, размер опухолевого экзофита, Т-категория, время до возникновения рецидива после
ТУР. Опухоли с благоприятным прогнозом - это единичная опухоль Та, высокой степени дифференцировки менее 3 см в диаметре с отсутствием рецидива после ТУР в течение одного года.
К дополнительным факторам прогноза относятся наличие очагов cr in situ, инвазия лимфатических щелей, плоидность ДНК, уровень опухолевых белков (рецептор эпидермального фактора роста, компоненты соединительной ткани, базальной мембраны, десмосомальный гликопротеин, рецептор трансферрина), цитогенетические факторы (р53, c-myc, c-erb, В-2).
На этапе диагностики поверхностного РМП ставятся следующие вопросы: определение глубины инвазии, выявление очагов cr in situ, комплексное определение факторов прогноза. Для решения этих задач в большинстве клиник нашей страны используют рутинную цистоскопию с гистологическим исследованием и ультразвуковое трансректальное (трансвагинальное) исследование, что, как правило, не позволяет выявить сг in situ, а опухолям Та и ТІ не дает достаточно полной количественной и прогностической характеристик, в ряде случаев не позволяет определить истинные границы опухолевого поражения. Неадекватная оценка опухолевого поражения слизистой МП при использовании обычной цистоскопии в белом свете приводит к частым рецидивам после ТУР и продолженному росту опухоли ввиду нерадикально проведенного лечения, что, в свою очередь, ведет к прогрессированию опухолевого процесса.
В последнее десятилетие, как в нашей стране, так и за рубежом широко изучались возможности флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей основных локализаций, в том числе при РМП [Чиссов В.И., 2003, Baert, 1993, Dugan, 1991, Nseyo, 1999]. Однако применение экзогенных фотосенсибилизаторов для самостоятельного флуоресцентного диагностического исследования в онкологии не получило широкого распространения. Это связано с низкой (1.5 - 2) флуоресцентной контрастностью опухоли на фоне неизмененной слизистой после внутривенного введения таких фотосенсибилизаторов, как
Фотофрин, Фотогем, Фотосенс, а также повышенной фоточувствительностью кожи и необходимостью соблюдения ограниченного светового режима от 4 до 6 недель.
В настоящее время наибольшие перспективы в выявлении поверхностных опухолей МП связаны с применением 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК). 5-АЛК является эндогенным соединением, одним из промежуточных продуктов синтеза гема. Ее избыточное введение в организм (или в ткани отдельных органов) приводит к ингибированию последнего этапа синтеза гема и накоплению его предшественника - эндогенного протопорфирина IX (ПШХ) [Penq, 1997]. При внутрипузырном введении экзогенной 5-АЛК в клетках переходноклеточного РМП синтезируется в 10 раз большее количество ПШХ, чем в нормальной слизистой МП [Datta et al., 1998]. Поскольку ПШХ интенсивно флуоресцирует в красной области спектра, результатом его накопления в опухолевых клетках является возможность выявления очагов РМП по флуоресценции 5-АЛК-индуцированного ПШХ. Данный феномен составляет основу метода 5-АЛК индуцированной фотодинамической диагностики (ФДД) РМП [Stepp et al., 1999].
Как показали зарубежные клинические исследования, чувствительность метода ФДД достигает более 90%, что намного превышает максимальную чувствительность рутинной цистоскопии (до 50%) [Zaak et al., 2001]. Однако высокая чувствительность метода сопровождается существенно более низкой специфичностью (50-65%), что снижает его диагностическую точность.
Для повышения точности и специфичности метода ФДД разрабатываются различные подходы. Так, было исследовано сочетание 5-АЛК индуцированных флуоресцентных и аутофлуоресцентных изображений очагов РМП [Frimberger et al., 2001]. Для контроля 5-АЛК индуцированной флуоресценции был использован спектрально-флуоресцентный анализ биоптатов ex vivo [Кудашев , 2001].
В России для целей ФДД в ГНЦ РФ «НИОПИК» по оригинальной технологии была синтезирована стандартная субстанция 5-АЛК и на ее основе совместно с МНИОИ им. П.А. Герцена разработан лекарственный препарат «Аласенс».
Цель исследования
Повышение эффективности диагностики поверхностного рака мочевого пузыря с препаратом аласенс на различных этапах хирургического и комплексного лечения больных поверхностным РМП.
Задачи исследования
1. Разработать метод комплексного флуоресцентного исследования
слизистой мочевого пузыря с использованием препарата аласенс,
включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию и
локальную флуоресцентную спектроскопию (ЛФС), с целью диагностики
поверхностного РМП и его рецидивов на этапах хирургического и
комплексного лечения.
2. Исследовать методом ЛФС лазер-индуцированную
аутофлуоресценцию нормальной слизистой оболочки и очагов РМП и
оценить возможности аутофлуоресцентной диагностики (АФД)
поверхностного РМП.
3. Изучить методом ЛФС распределение 5-АЛК-индуцированного
ПГПХ после внутрипузырного введения препарата аласенс и определить
величины пороговых значений спектрально-флуоресцентных
диагностических параметров, характеризующих нормальную слизистую,
очаги воспаления и очаги поверхностного РМП, с учетом локальной
интенсивности аутофлуоресценции.
4. Оценить эффективность разработанного метода комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря, включающего цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию и ЛФС, в первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП с определением его специфичности и чувствительности.
5. Разработать показания к проведению комплексной флуоресцентной цистоскопии с ЛФС у больных поверхностным РМП.
Научная новизна исследования
1. Впервые проведено исследование лазер-индуцированной
аутофлуоресценции очагов поверхностного РМП при возбуждении в синей
(442 нм) и зеленой (532 нм) областях спектра, показавшее резкое падение
интенсивности аутофлуоресценции в опухолевом очаге, что вносит
существенный вклад в раскрытие механизмов аутофлуоресцентной
диагностики РМП и может быть использовано в развитии метода
фотодинамической диагностики.
Впервые для ФДД с препаратом аласенс очагов поверхностного РМП применен метод ЛФС, позволяющий объективизировать данные флуоресцентного цистоскопического исследования.
Впервые для ФДД с препаратом аласенс очагов поверхностного РМП был использован алгоритм расчета спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, учитывающий как локальную интенсивность аутофлуоресценции слизистой оболочки МП, так и интенсивность 5-АЛК-индуцированного ППIX.
4. Впервые изучена корреляция результатов ЛФС с данными
морфологического исследования. Определены пороговые значения
спектрально-флуоресцентных диагностических параметров,
характеризующих нормальную слизистую, очаги воспаления и очаги поверхностного РМП после внутрипузырного введения аласенса.
5. Разработан метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию с in vivo ЛФС, в первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП, а также ранних рецидивов поверхностного РМП. Разработаны показания к применению данного метода диагностики у больных поверхностным РМП.
Практическая значимость работы
Разработанный метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой МП, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную ,f цистоскопию с ЛФС после внутрипузырного введения отечественного препарата аласенс, позволил увеличить эффективность первичной и уточняющей диагностики поверхностного РМП, а также ранних рецидивов поверхностного РМП на различных этапах хирургического и комплексного лечения.
Выявлена корреляция результатов ЛФС с данными морфологического исследования. Определены пороговые значения спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, характеризующих нормальную слизистую мочевого пузыря, очаги воспаления слизистой и очаги поверхностного РМП.
Проведенные исследования показали, что количественная оценка флуоресценции, по разработанному алгоритму с учетом локальной интенсивности аутофлуоресценции уротелия, повышает специфичность ФДД поверхностного РМП с препаратом аласенс.
Мониторинг величины спектрально-флуоресцентного
диагностического параметра в очагах визуальной 5-АЛК-индуцированной флуоресценции объективизирует данные флуоресцентной цистоскопии и
повышает эффективность флуоресцентного диагностического исследования, что позволяет минимизировать число ложно-положительных результатов и уменьшить количество необходимых биопсий.
Положения, выносимые на защиту
1. Применение метода ЛФС в очагах визуальной флуоресценции ПГПХ
после внутрипузырного введения препарата аласенс у больных
поверхностным РМП позволило объективизировать результаты
флуоресцентной цистоскопии и получить количественную оценку
флуоресценции слизистой оболочки МП.
2. Разработанный метод комплексного флуоресцентного исследования
слизистой мочевого пузыря, включающий цистоскопию в белом свете,
флуоресцентную цистоскопию с in vivo локальной флуоресцентной
спектроскопией после внутрипузырного введения отечественного препарата
аласенс, позволил повысить специфичность флуоресцентной цистоскопии в
первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП, а также его
ранних рецидивов.
3. Выявленные в результате исследования резкие различия в
интенсивности лазер-индуцированной аутофлуоресценции между
нормальной слизистой оболочкой МП и очагами поверхностного РМП
(р<0,001) позволили получить дополнительную диагностическую
информацию при количественной оценке локальной интенсивности
флуоресценции слизистой оболочки МП при ФДД с препаратом аласенс.
4. Изучение корреляции данных ЛФС с данными морфологического
исследования биоптатов выявило уровни пороговых значений спектрально-
флуоресцентных диагностических параметров, характерных для
флуоресценции in vivo неизмененной слизистой оболочки МП, очагов
воспаления и очагов поверхностного РМП после внутрипузырного введения
препарата аласенс, что позволило повысить эффективность
дифференциальной диагностики опухолевых и неопухолевых изменений слизистой оболочки МП.
Реализация результатов исследования
По теме предлагаемого научного исследования опубликовано: 10 научных работ (3 из них - в журналах рекомендуемых ВАК РФ).
Результаты диссертационной работы включены в программу преподавания онкоурологии на кафедре онкологии ФППО им И.М.Сеченова, внедрены в клиническую практику отделения урологии клинического госпиталя ГУВД г. Москвы.
Апробация работы
Основные материалы диссертации представлены на Российских и международных конференциях: 5-м Всероссийском съезде онкологов (Высокие технологии в онкологии) (Казань, 2000); Международной научной конференции «Современные методы фото динамической (флуоресцентной) диагностики и фотодинамической терапии» (Обнинск, 2001); на съезде онкологов (Минск, 2004), на 11 Международном Конгрессе Ассоциации фотодинамической терапии (Шанхай, 2007), на международной конференции по применению лазеров (ICONO/LAT 2007 , Минск, 2007), на международной конференции «Биофотоника 2007» (Нижний Новгород, 2007), на международном конгрессе по онкохирургии — устный и постерный доклад (Краснодар, 2008), на конференции по флуоресцентной диагностике и фотодинамической терапии (Москва, 2008).
Объем диссертации
Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста. Список литературы содержит 80 научных источников, из них 16 -российский авторов и 64 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 23 рисунками.
Современные методы диагностики . поверхностного РМП
Частое рецидивирование поверхностного рака мочевого пузыря после первичного лечения (50-91%) определяет актуальность его адекватной диагностики. Возникновение рецидивов обусловлено мультицентричностью опухолевых зачатков - хорошо видимые при обычной цистоскопии экзофитные опухоли и мелкие папиллярные образования, присутствием недиагностируемых участков carcinoma in situ, и возможностью имплантации опухолевых клеток во время трансуретральной резекции [6, 8, 11].
При реализации рецидива в 25% случаев отмечена опухолевая прогрессия, что проявляется увеличением глубины инвазии опухоли и снижением степени дифференцировки опухоли, появлением очагов cr in situ [8].
Во многом возникновение рецидивов объясняется тем, что поверхностный рак мочевого пузыря характеризуется множественностью опухолевых зачатков слизистой оболочки МП.
Наибольшую проблему в диагностике рака мочевого пузыря представляет интраэпитэлиальная опухоль - cr in situ, которая является плоской опухолью, растущей внутри эпителия мочевого пузыря и склонной к инверсии в инфильтративную опухоль. В 80% рецидивов диагностируется cr in situ с наклонностью к выраженному инфильтративному росту. Опухолевые клетки располагаются между неизмененными, оттесняя их вверх над основанием базальной мембраны, и в процессе своего развития замещают весь уротелий. Это позволяет очагам cr in situ проявлять себя как неспецифический воспалительный процесс слизистой оболочки МП. Cr in situ в большинстве случаев (до 90%) сопровождает рост экзофитных опухолевых образований, но в процессе своего роста становится доминирующей патологией с высокой степенью риска прогрессирования. Неинвазивные экзофитные опухолевые образования могут продолжительное время выступать как своеобразный фон, не меняя свою дифференцировку и не увеличивая глубину инвазии.
Дисплазии уротелия по своей биологии развития сходны с cr in situ, отличаясь от нее отсутствием увеличения митозов и клеточных слоев.
Диагностика cr in situ при обычной рутинной цистоскопии в белом свете с использованием «слепой» биопсии дает случайный результат. Установлено, что при отрицательном эффекте таких биопсий с последующим гистологическим исследованием в 40% случаев рецидив после проведенного первичного лечения реализуется в течение последующих 3-х лет. Многоцентровые исследования результатов профилактики рецидивов с использование БЦЖ-вакцины и митомицина-С показывают неэффективность дополнительных выборочных биопсий в прогнозировании течения рака мочевого пузыря, кроме тех случаев, когда диагностировалась cr in situ или дисплазия. Вышесказанное подчеркивает низкую чувствительность рутинной биопсии при обычной цистоскопии в белом свете и говорит о малой информативности данного метода в диагностике интраэпителиальных опухолевых образований.
Ценность цитологического исследования мочи связана с диагностическим анализом клеток со всей площади уротелия в результате его десквамации. Высокая селективность обнаружения связана с низкой адгезией клеток в низкодифференцированных опухолевых тканях. В тоже время с повышением дифференцировки злокачественной опухоли и в случае дисплазии чувствительность метода значимо снижается. Метод основан на исследовании клеток поверхностного слоя уротелия в суточной моче, что не позволяет диагностировать опухолевые клетки, располагающиеся вблизи базальной мембраны и интраэпителиально.
На этапе диагностики наряду с традиционными методами, такими как уретроцистоскопия с биопсией, различные модификации ультразвукового исследования, компьютерной и спиральной томографии в последнее время большое значение имеет оценка уровня опухолевых маркеров серологические и уринологические маркеры: UBC-тест, Cefra 21-1, ВТА, TPS, NMP-22, раково-эмбриональный антиген, которые применяются, как правило, как дополнительные методы исследования у больных поверхностным раком мочевого пузыря [2, 4, 25].
На основании больших клинических исследований показана диагностическая ценность опухолевых маркеров на этапах наблюдения за пациентами после проведенного лечения, выявлена зависимость уровня маркеров от стадии опухолевого процесса в мочевом пузыре, от степени дифференцировки опухоли [9, 63].
Сравнительное изучение цитологического исследования мочи с тестом на антиген опухоли мочевого пузыря (ВТА) не дали высокой чувствительности этих методов - 28% и 32% - при диагностике поверхностного рака мочевого пузыря. Чувствительность в случае cr in situ приближалась к 56%.
Чувствительность другого распространенного уринологического опухолевого маркера UBC при поверхностном РМП составляет 82%, причем в первичной и уточняющей диагностике его ценность намного выше, чем для мониторинга и в прогностическом отношении (86,2% и 78,0% соответственно). Специфичность метода, по данным МНИОИ им. П.А.Герцена, составляет 81,3%. Сравнительное изучение цитологического исследования мочи и определение уровня UBC в моче позволило выявить, что чувствительность методов при уровне инвазии опухоли Та составила 26,6% и 60,7%, соответственно, при уровне инвазии опухоли ТІ - 40,0% и 53,8 - 69,2%, соответственно [9].
Флуоресцентная цистоскопия: аппаратура и расходные материалы
В исследовании использована аппаратура для флуоресцентной цистоскопии производства Карл Шторц GmbH (Tuttingem, Germany).
Эта аппаратура включает в себя: нелазерный (ламповый) источник возбуждения флуоресценции, специальный цистоскоп со встроенными фильтрами для наблюдения флуоресцентного изображения, видеокамеру и монитор. Осветительная система оснащена специальным фильтром с характеристиками пропускания, соответствующими максимуму возбуждения аутофлуоресценции тканей и флуоресценции протопорфирина IX, т.е. позволяет возбуждать флуоресценцию в синем диапазоне спектра (390 -460 нм). Встроенная в эндоскопический аппарат система фильтров имеет широкую полосу пропускания излучения в видимом диапазоне спектра, начиная от 450 нм. Таким образом, аппаратура позволяет наблюдать изображение в свете аутофлуоресценции (зеленая часть спектра), в свете отраженного от ткани (синего) возбуждающего излучения и в режиме цветового контрастирования (в свете 5-АЛК индуцированной флуоресценции протопорфирина IX).
Режим цветового контрастирования оптимизирован для наблюдения изображения в свете 5-АЛК индуцированной флуоресценции протопорфирина IX. Данный режим контрастирования сбалансирован таким образом, что позволяет: 1. Лучше ориентироваться в участках ложноотрицательной флуоресценции 2. Подавлять неспецифическую красную флуоресценцию нормальной слизистой МП 3. Лучше различать опухолевые и нормальные ткани 4. Избежать зависимости от геометрии измерений 5. Уменьшить влияние поглощения излучения за счет гемоглобина, содержащего в тканях.
Для проведения ЛФС применялась компьютеризованная спектрально-флуоресцентная диагностическая установка «Спектр-Кластер» (Per. номер 29/05020401/3958-02) (ООО «Кластер», ИОФ РАН, Москва) [Чиссов В.И. и соавт., 2001].
Данная установка включает в себя: волоконно-оптическое устройство доставки лазерного излучения и сбора флуоресцентного излучения; спектрометр; персональный компьютер, специализированное программное
Для доставки возбуждающего лазерного излучения к ткани и регистрируемого излучения флуоресценции - к фотоприемнику применялся совместимый со стандартными эндоскопами Y-образный кольцевой волоконно-оптический диагностический катетер. Один из концов катетера представляет собой одиночное волокно, идущее от лазера к ткани. Другой конец катетера - пучок приходящих от ткани к спектрографу волокон. На третьем конце катетера, располагаемом непосредственно у поверхности ткани, собираются все волокна, причем волокна доставки излучения флуоресценции размещены вокруг центрального волокна, по которому поступает возбуждающее лазерное излучение. Излучение возбуждающего лазера через волоконно-оптический кабель подводилось к поверхности уротелия и вызывало его флуоресценцию. Излучение флуоресценции, собираемое многожильным оптическим кабелем, направлялось в спектрограф и разлагалось на спектры, которые регистрировались многоканальным фотоприемником и отображались на экране дисплея, а также сохранялись в памяти компьютера.
Для целей ФД рекомендуется использовать источники лазерного излучения с длинами волн генерации, соответствующими максимумам полос поглощения молекулы фотосенсибилизатора. Наиболее сильно флуоресценция производных порфирина, к которым относится протопорфирин IX, возбуждается в синей области спектра в районе полосы Соре (400 нм). Данные препараты также имеют полосу поглощения на 532 нм, в зеленой области спектра. Поэтому в исследовании было использовано две длины лазерного возбуждения флуоресценции и, соответственно, два лазерных источника: He-Cd лазер с длиной волны генерации в синей области спектра (442 нм) и твердотельный DPPS лазер с длиной волны генерации в зеленой области (532 нм).
Чтобы не вызывать необратимых фотодинамических повреждений слизистой оболочки МП, плотность энергии локального лазерного облучения в процессе одного исследования должна быть менее 1 Дж/см" . Поэтому средняя мощность лазерного излучения, возбуждающего флуоресценцию, в данном исследовании была строго стабилизирована и не превышала 5 мВт. Время записи одного спектра составляет несколько милисекунд, а время, которое диагностический катетер находился в контакте с поверхностью уротелия при записи 20-30 спектров, составляло порядка нескольких секунд. Таким образом, за время проведения спектрально-флуоресцентных измерений доза облучения составляла много меньше пороговой дозы фотодинамического воздействия.
Установка «Спектр-Кластер» позволяет регистрировать спектры флуоресценции биологических тканей в широком спектральном диапазоне: от 400 до 1000 нм. Для регистрации отраженного от ткани сигнала возбуждающего лазерного излучения в одном масштабе с сигналом флуоресценции, интенсивность которого на 4 порядка меньше, в установке предусмотрена система фильтрации на три спектральные области. Поэтому при возбуждении с длиной волны 442 нм регистрируется спектр флуоресценции в диапазоне 460-1000 нм, при возбуждении с длиной волны 532 нм - в диапазоне 550-1000 нм.
Результаты исследования аутофлуоресценции нормальной слизистой и очагов поверхностного рака мочевого пузыря
При возбуждении в синей и зеленой областях спектра нормальный уротелий интенсивно флуоресцирует, регистрируемые спектры АФ имеют максимумы в районе 500 -520 нм и 580-600 нм соответственно (см. рис. 7, 8). При сканировании пятна возбуждающего лазерного излучения вдоль поверхности МП интенсивность спектров АФ в различных точках уротелия меняется. На рис. 7 представлены типичные спектры АФ, измеренные при возбуждении 532 нм в различных точках здорового уротелия в пределах площадки размером до 2 см2.
Поскольку мы оценивали различия в интенсивности лазер-индуцированной АФ нормального и патологического уротелия, необходимо оценить как погрешность точечных измерений спектров АФ, так и обсудить причины вариабельности интенсивности АФ. Колебания интенсивности АФ могут быть вызваны как биологическим разбросом, так и физическими причинами. Локальная интенсивность АФ зависит от локальной плотности кровеносных сосудов, которая вносит основной вклад в поглощение возбуждающего и флуоресцирующего излучения нефлуоресцирующим (окси)гемоглобином. Что касается физических причин, то это, прежде всего, зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала от мощности возбуждающего лазерного излучения и от геометрии измерений.
Как отмечалось в главе 2, в наших исследованиях использовались стабилизированные лазерные источники с постоянной выходной мощностью излучения. Кроме того, проводился дополнительный контроль мощности с конца волоконно-оптического катетера по флуоресценции стандартного образца. Что касается геометрии измерений, то основными факторами, влияющими на интенсивность регистрируемого спектра, являются расстояние и угол между поверхностью уротелия и торцом волоконно-оптического катетера. Для минимизации влияния взаимного расположения торца катетера и поверхности ткани все измерения проводили в контакте, при максимально перпендикулярном расположении катетера относительно достоверно регистрировалось резкое падение интенсивности АФ относительно патологически неизмененных участков уротелия. Можно видеть, что падение интенсивности АФ сопровождалось также резким уменьшением интенсивности отраженного от ткани сигнала возбуждаюшего лазерного возбуждения на 442 нм и 532 нм {см. рис. 9,10). 400 SO0 600 700 800 длина волны, нм
Рис. 9 . Спектры АФ, измеренные в двух точках здорового уротелия с максимальной (1) и минимальной (2) интенсивностью АФ и в двух точках (3,4) очага морфологически подтвержденного ГЖР РМП, измеренные при лазерном возбуждении в синей области спектра (442 нм). нормальный уротелии
При сканировании пятна возбуждающего лазерного излучения вдоль поверхности очага РМП интенсивность спектров аутофлуоресценции в различных точках опухолевого поражения оставалась на крайне низком уровне. Разброс АФ между различными точками опухолевого очага не превышал 50 % (см. табл. 6).
У 10 пациентов с морфологически подтвержденным РМП в очагах флуоресценции достоверно регистрировалось резкое падение интенсивности в максимуме спектров АФ: I (опухоль) на 500 нм при возбуждении 442 нм и I (опухоль) на 600 нм при возбуждении 532 нм. Различия между интенсивностью АФ нормальной слизистой и опухолями мочевого пузыря составляли в данной группе пациентов от 5 до 20 раз, что достоверно превышало биологический разброс и ошибку измерений локальных спектров АФ. Резкое падение интенсивности АФ наблюдалось также в очагах тяжелой дисплазии. У 2-х пациентов с положительным результатом биопсии не было выявлено достоверных различий в интенсивности АФ между нормальной слизистой и опухолью. Также не было выявлено очагов резкого падения интенсивности АФ у 6 пациентов с отрицательным результатом биопсии. Интенсивность АФ очагов метаплазии, фолликулярного цистита, воспаления была сравнима с интенсивностью флуоресценции нормального уротелия.
Оценка диагностической значимости флуоресцентных параметров в опухоли и в нормальной слизистой оболочке МП у больных поверхностным РМП
Как отмечалось ранее, величина спектрально-флуоресцентного параметра Df в участке нормальной слизистой оболочки без введения аласенса составляет 0.3 ± 0.1 при возбуждении на 442 нм и 1.0 ± 0.2 при возбуждении на 532 нм. После инстилляции аласенса величина параметра практически остается на прежнем уровне: Df(HOpMa)= 0.4 ±0.1 (442 нм) и Df (норма)= 1-3 ± 0.4 (532 нм), что подтверждают результаты других авторов о том, что при инстилляции 5-АЛК протопорфирин IX не индуцируется в нормальной слизистой оболочке МП [Zaak et al., 2001]. Во флуоресцентном изображении нормальный уротелий визуализируется по аутофлуоресценции в зеленой области спектра без признаков диффузной красной флуоресценции (см. рис. 12, 13, 15).
Через 2-3 часа после инстилляции аласенса в очагах воспаления слизистой оболочки МП, диспластических изменений и в опухолевых очагах происходит индукция протопорфирина IX. Об этом свидетельствует появление на фоне зеленой аутофлуоресценции нормального уротелия очаговой красной флуоресценции аласенс-индуцированного протопорфирина IX, которая спектрально регистрируется с характерными максимумами в красной области спектра на 635 и 750 нм. Распределение индуцированного протопорфирина IX по поверхности патологических очагов неоднородно, что отражается в диффузном характере распределения индуцированной красной флуоресценции. Это подтверждается и при анализе изображений и по данным ЛФС (см. рис. 12-17, табл. 7, 8). Можно видеть, что флуоресцентная визуализация очагов поверхностного РМП варьирует в цветовом восприятии от желтой до красной, ее интенсивность субъективно можно описать в различных оттенках от «слабой» до «сильной».
Проведение объективных количественных измерений флуоресценции уротелия методом ЛФС показало, что наибольшая локальная интенсивность флуоресценции Аласенс-индуцированного протопорфирина IX и наибольшие значения величины Df наблюдаются в морфологически подтвержденных очагах уротелиальных карцином.
Как показали наши исследования, индуцированный флуоресцентный контраст Кф очагов ПКР относительно нормального уротелия зависит от длины волны возбуждения и его величина составляет от 10 до 35 (в среднем 15) при возбуждении в синей области спектра, а при возбуждении в зеленой области несколько снижается и варьируется от 2 до 20 (в среднем 6) (см. табл. 7, 8).
В ходе флуоресцентной цистоскопии регистрировалась неспецифическая красная флуоресценция очагов воспаления слизистой оболочки МП, начальной и умеренной дисплазии эпителия слизистой оболочки МП (рис. 18-20). Проведение ЛФС в этих очагах показало незначительное возрастание величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра Df. Оценки флуоресцентного контраста Кф этих очагов также показывают, что он значительно ниже, чем очагов ПКР и не превышает 4 (442 нм) и 2.5 (532 нм) (см. табл. 7, 8).
Необходимо подчеркнуть, что используемый в исследовании алгоритм расчета диагностических параметров включал, помимо интенсивности флуоресценции аласенс-индуцированного ПШХ, локальную интенсивность АФ. Поэтому величина флуоресцентного контраста Кф отражает не только аласенс-индуцированный контраст, который наблюдается визуально, но и эндогенный аутофлуоресцентный контраст, который не визуализируется в ходе флуоресцентной цистоскопии, но регистрируется при измерении спектров флуоресценции в широком спектральном диапазоне (рис.5,6). Таким образом, учитывались оба феномена: падение интенсивности АФ в очаге поверхностного РМП и избирательное накопление ПШХ в клетках уротелиальных карцином. Это позволило выявить в ходе исследования 53 скрытых очага, которые визуализировались по слабой красноватой флуоресценции, но локально в этих зонах регистрировались большие значения величины Df. Морфологически в этих очагах была подтверждена тяжелая дисплазии (3%), cr in situ (95%) и ПКР (2%). а) б)
в) Рис. 13 . Цистоскопия в белом свете (а), флуоресцентная цистоскопия (б) и ЛФС МП. Диагноз - сг in situ МП. Участок нормальной слизистой оболочки флуоресцирует в зеленой области (АФ), величина Dt-(n0pMa)= 0,4. CIS визуализируется по красной флуоресценции аласенс-индуцированного протопорфирина IX, величина параметра Df (рак j = 15.6. Флуоресцентный контраст Кф = 30. В спектре нормального уротелия доминирует аутофлуоресценция с максимумом на 510 нм, пик флуоресценции 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX на 635 нм отсутствует. В спектре, измеренном в очаге ПКР МП, интенсивность АФ крайне низка, присутствует интенсивный пик индуцированной флуоресценции протопорфирина IX с максимумами на 635 и 705 нм.
![Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс]](/i/i/4431/177751.png "Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс] Козлов Андрей Александрович")