Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Множественная лекарственная резистентность и пути ее реализации в клетке 11
1.2. Pgp, MRP, BCRP - маркеры множественной лекарственной резистентности 13
1.3. Субстратная специфичность Pgp, MRP и BCRP по отношению к цитостатикам 14
1.4. Локализация ABC-транспортеров в клетке и их участие в перераспределении субстратов между ядром и цитоплазмой 17
1.5. Физиологическая функция Pgp, MRP и BCRP 18
1.6. Экспрессия Pgp и MRP в опухолях и соответствующих нормальных тканях человека 20
Глава 2. Материал и методы 33
2.1. Материал 33
2.2. Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров 34
Глава 3. Ингибирование функции АВС-транспортеров в клетках солидных опухолей и нормальных тканей человека при воздействии препаратов платины 41
3.1. Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в
клетках солидных опухолей и нормальных тканей человека 44
3.1.1. Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках немелкоклеточного рака легкого и нормальной ткани легкого 44
3.1.2. Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках опухолей и слизистой толстой кишки 54
3.1.3. Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках опухолей и слизистой желудка 57
3.1.4. Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках опухолей и слизистой пищевода 63
3.1.5. Оценка действия цисплатина на накопление доксорубицина в клетках рака шейки матки 66
3.2. Исследование влияния различных концентраций цисплатина и карбоплатина на накопление доксорубицина в клетках солидных опухолей человека 71
Глава 4. К механизму увеличения внутриклеточного накопления доксорубицима после воздействия препаратов платины 82
4.1. Химическое взаимодействие цисплатина с доксорубицином 83
4.2. Влияние цисплатина на связывание доксорубицина с ДНК 83
4.3. Цисплатин как ингибитор функции ABC-транспортеров. Влияние цисплатина на внутриклеточное распределение доксорубицина 90
4.4. Влияние цисплатина на энергетический баланс клетки 95
Глава 5. Другие возможные пути преодоления множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с функционированием АВС-транспортеров 102
5.1. Длительность инкубации клеток солидных опухолей человека с доксорубицином как модификатор множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с функционированием АВС-транспортеров 102
5.2. Исследование влияния диоксидина на накопление доксорубицина в клетках опухолей и слизистой мочевого пузыря 113
Глава 6. Заключение 126
Выводы 139
Список литературы 140
- Субстратная специфичность Pgp, MRP и BCRP по отношению к цитостатикам
- Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров
- Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках немелкоклеточного рака легкого и нормальной ткани легкого
- Влияние цисплатина на связывание доксорубицина с ДНК
Введение к работе
Современная химиотерапия опухолей занимает важное место среди остальных методов лечения онкологических больных. В настоящее время увеличение эффективности химиотерапевтического лечения происходит за счет внедрения в клиническую практику новых лекарственных препаратов. В тоже время все чаще для выбора оптимального режима лечения прибегают к оценке факторов, позволяющих предсказать возможный ответ на химиотерапию.
Одним из существенных препятствий на пути лечения пациентов с солидными опухолями является их врожденная и приобретенная резистентность к цитостатикам, отличным по структуре и механизму действия. Такую лекарственную устойчивость называют множественной, а препараты называют препаратами из группы множественной лекарственной резистентности (MDR-препаратами). В группу MDR-препаратов относят антрациклины, винкаалколоиды, подофилотоксины, таксаны, актиномицин Д, митоксантрон, амсакрин, триметрексат, митрамицин, митомицин С, камптотецины, то есть большинство широко применяемых в клинике препаратов. В последнее время в эту группу включены и препараты платины.
Целью любого химиотерапевтического лечения является достижение противоопухолевым препаратом своей внутриклеточной мишени и ее повреждение, что, в свою очередь, должно привести клетку к гибели. Для реализации этой цели препарат должен: 1) проникнуть в клетку, 2) сохранить свою активность внутри клетки, 3) повредить внутриклеточную мишень и, что особенно важно, 4) повреждение внутриклеточной мишени препаратом должно привести к блоку клеточного цикла и/или к гибели клетки. Однако клетка со своей стороны может воспрепятствовать оказываемому на нее токсическому воздействию на любом из вышеперечисленных этапов. Так, на первом этапе клетка может препятствовать проникновению в нее цитостатиков путем увеличения экспрессии мембранных транспортных белков, принадлежащих к семейству ABC-транспортеров, выкачивающих токсические агенты из клеток и тем самым снижая внутирклеточную концентрацию цитостатиков. Процесс выкачивания ABC-транспортерами противоопухолевых перепаратов из клеток является энергетически зависимым и осуществляется за счет гидролиза молекул АТФ. К настоящему времени можно считать доказанным участие в выбросе противоопухолевых препаратов из клеток, то есть в регуляции выраженности повреждающего воздействия цитостатиков на клетки, трех ABC-транспортеров - Pgp, MRPhBCRP.
С точки зрения влияния этих транспортных белков на успех химиотерапевтического лечения, на наш взгляд можно с уверенностью утверждать, что перед назначением тех или иных химиотерапевтических режимов необходимо оценивать как функциональную активность, так и внутриклеточную локализацию АВС-транспортеров, которые могут не только препятствовать поступлению противоопухолевых препаратов в клетку, но и ограничивать доступность ядра для цитостатиков. Последнее особенно важно, если учесть, что успех химиотерапии достигается только в результате взаимодействия цитостатиков с их внутриклеточными мишенями, большинство из которых расположены в клеточном ядре.
В связи с этим становится понятным, что важной задачей в направлении
преодоления множественной лекарственной устойчивости, ассоциированный с
функционированием ABC-транспортеров, становится поиск ингибиторов
транспортных белков. Во всем мире поиск ингибиторов множественной лекарственной резистентности осуществляется среди непротивоопухолевых лекарств. Примером могут служить специфические ингибиторы Pgp - верапамил, циклоспорин А и их производные, некоторые стероидные гормоны и антиэстрогены. Выявлена высокая ингибирующая активность всей системы обратного транспорта при воздействии препарата лонидамина, эффективность которого для преодоления множественной лекарственной резистентности подтверждена и при клинических испытаниях.
При этом совершенно неизученным остается вопрос о возможном ингибирующем воздействии на ABC-транспортеры противоопухолевых препаратов. Ранее в нашей лаборатории было показано, что такие противоопухолевые препараты как таксол, таксотер или 5-фторурацил могут ингибировать функцию АВС-транспортеров в клетках солидных опухолей человека (Богуш Т.А. и др., 2003; Богуш Е.А. и др., 2003; Гришанина и др., 2005). Из данных литературы также известно, что такие противоопухолевые препараты как митомицин С, винкаалкалоиды или СРТ-11 (иринотекан) могут ингибировать функцию ABC-транспортеров в культурах клеток (Maitra et ah, 2001; Pereira et al, 1998; Chanvier et al, 2002).
С другой стороны, мы обратили внимание на известный факт, что комбинации препаратов платины (цисплатина и карбоплатина) с некоторыми MDR-препаратами, например, с антрациклинами и таксанами, являются наиболее эффективными при лечении опухолей с фенотипом врожденной или приобретенной лекарственной резистентности. Примером может служить немелкоклеточный рак легкого (Lilenbaum et al, 2002; Jensen et al, 2002; Gatzemeier et al, 1998).
Эти клинические наблюдения позволили предположить, что наряду с собственно противоопухолевой активностью, препараты платины, возможно, способны ингибировать функцию ABC-транспортеров, выбрасывающих MDR-препараты из клеток, и, таким образом, являться так называемыми MDR-модификаторами, позволяющими преодолеть множественную лекарственную резистентность к цитостатикам, используемым в комбинации с ними.
Второй важный аспект в разработке подходов к преодолению множественной лекарственной резистентности, который не описан в литературе и на котором мы остановили свое внимание - это попытка преодолеть фенотип множественной лекарственной резистентности путем увеличения поступления препарата в клетку за счет использования высокотоксичного агента, который оказывал бы грубое повреждающее действие на клетку, в том числе нарушал целостность цитоплазматической мембраны опухолевых клеток. При этом в качестве модели для исследования был выбран поверхностный рак мочевого пузыря, поскольку слизистая мочевого пузыря является физиологически очень устойчивой к действию токсических веществ.
И, наконец, третий аспект, на котором мы остановили свое внимание - это возможность преодоления множественной лекарственной резистентности солидных опухолей человека с помощью физиологических регуляторов активности АВС-транспортеров. Так, в клинике широко применяется инфузионная химиотерапия, которая хорошо себя зарекомендовала как с точки зрения более низкой общей токсичности для пациента по сравнению со струйным введением препаратов, так и с точки зрения эффективности. В ряде случаев высокая эффективность длительной внутривенной инфузии наблюдается даже при клинически регистрируемой устойчивости на предшествующую химиотерапию. Мы предположили, что одним из возможных объяснений этого клинического феномена может быть то, что при увеличении длительности контакта опухолевых клеток с MDR-препаратом, последний может ингибировать функцию ABC-транспортеров, выбрасывающих цитостатики из клеток, и, таким образом, оказывать модифицирующий эффект.
Все вышесказанное обуславливает актуальность, цели и задачи данного исследования.
Целью настоящей работы явился поиск и изучение физиологических и фармакологических регуляторов активности ЛВС-транспортеров.
Задачи исследования
Оценить влияние цисплатина и карбоплатина на фенотип множественной лекарственной резистентности в клетках немелкоклеточного рака легкого и нормальной ткани легкого.
Определить является ли модифицирующий эффект препаратов платины специфичным в отношении клеток немелкоклеточного рака и нормальной ткани легкого, или же будет также наблюдаться в клетках рака толстой кишки, желудка, пищевода и шейки матки и в клетках соответствующих нормальных тканей.
Изучить механизм ингибирования фенотипа множественной лекарственной резистентности при воздействии препаратов платины в экспериментах ex vivo и in vitro.
Оценить влияние длительности инкубации клеток солидных опухолей с доксорубицином на внутриклеточное накопление и перераспределение антрациклина.
Изучить механизм ингибирования фенотипа множественной лекарственной резистентности при увеличении длительности контакта клеток с доксорубицином.
Оценить влияние диоксидина (антисептика с широким спектром действия, повреждающего целостность клеточных мембран) на внутриклеточное накопление доксорубицина в клетках опухолей и слизистой мочевого пузыря.
Изучить механизм увеличения внутриклеточного накопления доксорубицина в клетках опухолей и слизистой мочевого пузыря при воздействии диоксидина.
Научная новизна и практическая значимость
В данной диссертационной работе найдены новые подходы к преодолению фенотипа множественной лекарственной резистентности солидных опухолей за счет использования фармакологических и физиологических регуляторов активности АВС-транспортеров.
Во-первых, выявлена способность препаратов платины (цисплатина и карбоплатина) увеличивать накопление модельного MDR-препарата доксорубицина в клетках немелкоклеточного рака легкого, рака толстой кишки, желудка, пищевода и шейки матки, экспрессирующих фенотип множественной лекарственной резистентности. При этом показана принципиальная возможность препаратов платины не просто увеличивать внутриклеточное накопление доксорубицина, но и влиять на его перераспределение между цитоплазмой и ядром в сторону последнего. Это особенно важно, поскольку мишенями большинства противоопухолевых препаратов являются
ДНК и ядерные ферменты. Показано, что причиной выявлено эффекта является ингибирование активности ABC-транспортеров при воздействии препаратов платины. Полученные результаты явились предпосылкой к рекомендации для клинического использования цисплатина и карбоплатина: последовательность введения "препарат платины -» MDR-препарат" следует признать оптимальной.
Второй, освещенный в работе, способ преодоления фенотипа множественной лекарственной резистентности посредством использования фармакологических регуляторов базируется на увеличении поступления цитостатиков в опухолевую клетку через нарушение целостности мембран. На клетках опухолей и слизистой мочевого пузыря показано, что диоксидин способен избирательно повышать накопление доксорубицина в клетках опухолей и при этом не влиять на накопление антрациклина в клетках слизистой мочевого пузыря. Выявлено, что эффект диоксидина на клетки реализуется за счет его способности как ингибировать функцию АВС-транспортеров, так и оказывать повреждающее воздействие на мембраны опухолевых клеток. Поскольку диоксидин является официнальным препаратом и разрешен для применения у онкологических больных, на основании полученных результатов сделано заключение о возможной эффективности внутрипузырного введения раствора диоксидина на 20-30 минут перед введением доксорубицина. Более того, на основании полученных убедительных доказательств способности диоксидина оказывать повреждающее воздействие на мембраны опухолевых клеток сделано предположение, что таким образом можно повысить эффективность внутрипузырной химиотерапии не только MDR-препаратами, но и другими цитостатиками, которые применяются при лечении поверхностных опухолей мочевого пузыря, например, таких как тиотэф и митомицин С. Доступность слизистой мочевого пузыря для противоопухолевых препаратов, а следовательно и их токсичность, должны при этом сохраниться на прежнем уровне. В то же время, предварительное воздействия диоксидина должно привести к увеличению поступления препаратов в опухоль а, следовательно, и к увеличению их цитотоксичности и эффективности. Полученные результаты являются рекомендацией для проведения клинической оценки эффективности местного применения раствора диоксидина при химиотерапии поверхностных опухолей мочевого пузыря.
И, наконец, в работе описан новый механизм ингибирования фенотипа множественной лекарственной резистентности в клетках опухолей за счет физиологической регуляции активности ABC-транспортеров. В работе найдено объяснение клинического феномена большей эффективности инфузионного введения противоопухолевых препаратов по сравнению со струйным введением: при увеличении
длительности контакта клеток опухолей с модельным MDR-препаратом доксорубицином, последний может ингибировать активность АВС-транспортеров, расположенных на ядерной мембране клеток, в результате чего увеличивается поступление цитостатика в ядро клеток и его связывание с ДНК. Это особенно важно, так как мишени большинства противоопухолевых препаратов расположены именно в ядре клеток. Полученные данные послужили предпосылкой для клинической рекомендации о целесообразности тестирования, наряду с оценкой функции АВС-транспортеров в клетках опухолей, реакции клеток на накопление цитостатиков при увеличении длительности контакта с ними.
Субстратная специфичность Pgp, MRP и BCRP по отношению к цитостатикам
Субстратами Pgp являются, по существу, все противоопухолевые препараты, перечисленные в таблице 1, к которым развивается перекрестная резистентность. К ним относятся антрациклины (доксорубицин, рубомицин, эпирубицин, идарубицин) (Mechetner et al, 1997; Schinkel et al., 1993), винкаалкалоиды (винбластин, винкристин, винорельбин, виндезин) (Horio et al., 1998; Fojo et al., 1985), таксаны (таксол, таксотер) (Gottesman, Pastan, 1993), эпиподофиллотоксины (этопозид, тенипозид) (Maare et al, 1995), камптотецины (CPT-11, топотекан) (Hoki et al, 1997), хромопептидные антибиотики (актиномицин D) (Horio et al, 1989) и антрацены (митоксантрон) (Taylor et al, 1991).
Спектр субстратов MRP во многом сходен с описанным для Pgp, но не идентичен. В культутре клеток экспрессия функции MRP является причиной множественной лекарственной резистентности, сопровождающейся снижением внутриклеточного накопления и перераспределения антрациклинов, эпиподофиллотоксинов и винкаалкалоидов (Cole et al, 1994; Zaman et al, 1994; Breuninger et al, 1995; Madahi. et al, 1991; Ruetz et al, 1996); метотрексата, примененного в высоких дозах (Hooijberg et al, 1999), и актиномицина D (Lorico et al, 1996). Однако в отличие от Pgp, MRP не транспортирует паклитаксел (Cole et al, 1994; Zaman et al, 1994; Madahi. et al, 1991), митоксантрон (Cole et al, 1994), арабинозидцитозин (Madahi. et al, 1991) и амсакрин (Zaman et al, 1994). Данные о транспорте MRP колхицина, классического субстрата Pgp, противоречивы (Coley et al, 1993; Zaman etal, 1994; Madahi. et al, 1991).
Изученный спектр субстратов BCRP пока еще не очень широк, но и он во многом сходен со спектрами субстратов Pgp и MRP (Litman et al, 2000). Клетки, экспрессирующие BCRP, перекрестно резистентны к таким противоопухолевым препаратам, субстратам P-gp и MRP, как митоксантрон, антрациклины (доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин) и топотекан (Litman et al, 2000). Также к субстратам BCRP относят такие противоопухолевые препараты как флавопиридол (Ambudkar et al, 1999), индолокарбазолы (NB-506, J-107088) (Komatani et al, 2001), камптотецины (Maliepaard et al, 2001), метотрексат (Volk et al, 2002). Известно также, что цисплатин (Rabindran et al, 2000) не является субстратом BCRP. В то же время паклитаксел является специфическим субстратом только Pgp, и клетки, экспрессирующие BCRP или MRP, сохраняют чувствительность к этому цитостатику. Винбластин относится к субстратам Pgp и MRP, но не BCRP.
Различия в субстратной специфичности Pgp, MRP и BCRP по отношению к ряду противоопухолевых препаратов представленны на рисунке 1. et а!., 2000) Локализация ЛВС-транспортеров в клетке и их участие в перераспределении субстратов между ядром и цитоплазмой
Анализируя данные литературы, мы обратили внимание на тот факт, что большинство авторов, сообщающих об экспрессии в тех или иных клетках АВС-транспортеров, подразумевают под последними транспортные белки, локализованные на цитоплазматической мембране и участвующие в выкачивании токсических веществ из клеток. Однако это не совсем верно, поскольку в настоящее время имеется достоточное количество работ, в которых сообщается о том, что ABC-транспортеры в клетке локализуются не только на цитоплазматической, но также на внутриклеточных мембранах.
Так, Sugawara с коллегами методом электронной микроскопии на клетках аденокарциномы легкого показали, что MRP локализуется в клетках как на цитоплазматической мембране, так и в эндоплазматическом ретикулуме (Sugawara et al, 1995). Две другие независимые группы исследователей также приходят к аналогичным выводам (Barrand et ah, 1995; Breuninger et al, 1995). Исследователи из Венгрии на клетках рака яичка (GCTTs) методом иммуногистохимии показали наличие белка MRP не только в цитоплазме, но и в ядре (Eid et al, 2000).
Другая группа исследователей сообщает, что Pgp, MRP и BCRP не только участвуют в выкачивании цитостатиков из клеток, но и вносят вклад во внутриклеточное перераспределение препаратов, выкачивая их из органелл-мишеней (Tan et al, 2000). Rajagopal и Simon в своей работе также приходят а выводу, что Pgp, MRP1 и BCRP, о которых ранее было известно как о транспортных белках, контролирующих поступление цитостатиков в клетку на уровне цитоплазматической мембраны, локализуются также и на внутриклеточных мембранах и препятствуют таким образом поступлению MDR-субстратов в ядро (Rajagopal, Simon, 2003). Исследователи из Франции показали, что после поступления в клетки с экспрессией фенотипа MDR цитостатиков, последние сначала накапливаются в клеточных везикулах, таких как аппарат Гольджи, эндосомы или лизосомы для последующей транспортировки к цитоплазматической мембране и только после этого выбрасываются в среду. Авторы делают вывод, что такое внутриклеточное перераспределение препаратов реализуется за счет работы таких транспортных белков как Pgp и MRP (Larsen et al, 2000).
Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров
Исследование проведено разработанным в лаборатории медицинской химии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН методом лазерной проточной цитофлюориметрии, адаптированным для исследования плотных тканей, в том числе солидных опухолей (Богуш и др., 2005).
На первом этапе биопсийный материал опухоли инкубировали 30 мин. при 37 С в растворе Хенкса, содержащем 5 мМ глюкозы, для восстановления энергетических процессов в клетке. Затем биопсийный материал разрезали острым скальпелем на образцы размером 2x2x2 мм. Каждый образец аккуратно промывали в растворе Хенкса для удаления разрушенных клеток с границ среза. Контроль исследуемого материала проводили при цитологическом исследовании отпечатков опухолей.
Для получения клеточной суспензии, образцы опухоли помещали в раствор Хенкса, содержащий 5 мМ глюкозы, и интенсивно встряхивали несколько раз (в зависимости от плотности исследуемой ткани). При образовании неоднородной суспензии (наличии видимых клеточных конгломератов) - суспензию фильтровали через капроновый фильтр (размер пор 150 мк). Готовую суспензию разливали на аликвоты, к которым добавляли цисплатин (конечные концентрации - 3,3x10 3, 1,6x10"3, 1,1x10" М или 3,3x10 М в зависимости от условий постановки эксперимента); карбоплатин (конечные концентрации - 3,3х10"3 , 1,6х10 3 или 3,3х104 М в зависимости от условий постановки эксперимента); верапамил (конечная концентрация - 3,3x10"4 М); генистеин (конечная концентрация - 2x104 М), азид натрия (конечная концентрация - 5х10"3 М) или раствор Хенкса (контроль) и инкубировали 20 мин. при С. После этого во все пробы добавляли доксорубицин (конечные концентрации -7,7х10"5, 1,5х10"5 или 7,7хЮ"6М в зависимости от условий постановки эксперимента) и инкубировали 5 мин. при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением раствора формалина до конечной концентрации 10%. До проведения исследования готовые пробы хранили при 4 С.
Измерение внутриклеточной флюоресценции доксорубицина проводили на проточном флюориметре FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA), с применением программного обеспечения CellQuest. Оптимизацию параметров прибора осуществляли с помощью набора CaliBRITE Beads (Becton Dickinson). Для возбуждения флюоресценции доксорубицина используют аргоновый лазер с длиной волны испускаемого света 488 нм. Регистрацию сигнала флюоресценции внутриклеточного доксорубицина проводят с помощью фильтра FL-2, пропускающего свет с длиной волны 576+26нм (длина волны испускания флюоресцентного света для доксорубицина составляет 590нм). Сбор клеток проводят со скоростью 500 клеток/сек, число анализируемых событий составляет от 5 до 10 тысяч. Клетки собирают при значении шторки 100, что позволяет исключить из анализа разрушенные клетки (дебрис) и лимфоциты. От конгломератов клеток избавляются после сбора клеток проточным цитофлюориметром, исключая из анализа клетки, расположенные вплотную к осям на картинке распределения клеток по размеру и гранулярности, путем гейтирования. Изменяя напряжение для фильтров FSC и SSC, добиваются расположения основной массы клеток в центре картинки распределения клеток по размеру и гранулярности, что считается оптимальным положением для проведения исследования. Для каждого опухолевого образца добиваются неискаженного распределения клеток по интенсивности флюоресцентного свечения на гистограммах путем изменения напряжения для фильтра FL-2. Пробы, относящиеся к одному опухолевому образцу, измеряют при одних и тех же подобранных параметрах прибора. Для вычисления и представления статистики выбрана логарифмическая форма обсчета интенсивности флюоресцентного сигнала. Анализ гистограмм проводят с учетом средней внутриклеточной флюоресценции суммарно по всей популяции и каждой из субпопуляций в отдельности, а также распределения клеток между субпопуляциями. Оценку флюоресценции клеток проводят в области специфических пиков за областью автофлюоресценции. Изменение флюоресценции менее чем на 25% по сравнению с контролем расценивалось как колебания в пределах ошибки опыта. Анализ данных гистограмм проводили с помощью программы WinMDI.
Исследование влияния цисплатина на внутриклеточное накопление доксорубицина в клетках линии Исследование проведено с использованием метода проточной цитофлюориметрии.
Клетки отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 2 тыс оборотах, осадок ресуспендировали в растворе Хенкса с глюкозой без фенолового красного. Клеточную суспензию разливали на аликвоты, к которым добавляли цисплатин (конечные концентрации - 3,3х10"3, 1,6х10"3 или 3,3х104 М), верапамил (конечная концентрация - 3,3x10"4 М) или раствор Хенкса (контроль) и инкубировали 20 мин. при 37С. После этого во все пробы добавляли доксорубицин (конечные концентрации - 7,7х10"5,1,5х10"5 или 7,7x10" М) и инкубировали 5 мин. при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением раствора формалина до конечной концентрации 10%. До проведения исследования готовые пробы хранили при 4 С. На следующем этапе приготовленные пробы анализировали методом цитофлюориметрии в потоке. Исследование влияния длительной инкубации клеток с доксорубицином на внутриклеточное накопление доксорубицииа в опухолевых клетках человека Исследование проведено методом проточной цитофлюориметрии.
Клеточную суспензию готовили как это было описано выше для этого метода. Готовую суспензию разливали на аликвоты, после чего во все пробы, кроме контрольной, добавляли доксорубицин (конечная концентрация доксорубицииа 7,7x10" 5 М). Через 5 мин первую пробу фиксировали добавлением формалина до конечной концентрации 10%. Одновременно с первой пробой фиксировали и контрольную пробу. То же самое проводили с остальными пробами через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин соответственно. До проведения исследования готовые пробы хранили при 4С. На следующем этапе приготовленные пробы анализировали методом цитофлюориметрии в потоке.
Для того, чтобы оценить влияние длительной инкубации клеток с доксорубицином на внутриклеточное накопление доксорубицииа в опухолевых клетках человека, но после предварительного воздействия на клетки цисплатина готовую суспензию также разливали на аликвоты. После этого все полученные пробы делили на 2 группы. В пробы из первой группы добавляли цисплатин (конечная концентрация 3,3x10"3 М). Пробы из второй группы доводили до нужного объема раствором Хенкса. После этого во все пробы, кроме контрольной, добавляли доксорубицин (конечная концентрация доксорубицииа 7,7x10"5 М). Через 5 мин. первые пробы (с цисплатином и без) фиксировали добавлением формалина до конечной концентрации 10%. Одновременно с первыми пробами фиксировали и контрольную пробу. То же самое проводили с оставшимися пробами из обеих групп через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин. До проведения исследования готовые пробы хранили при 4С. На следующем этапе приготовленные пробы анализировали методом цитофлюориметрии в потоке.
Оценка действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках немелкоклеточного рака легкого и нормальной ткани легкого
Исследовано 15 образцов опухолей и 11 образцов нормальной ткани легкого, полученные во время хирургических операций 15 больных немелкоклеточным раком легкого (в 73,3% случаев - плоскоклеточный рак и в 26,7% случаев - аденокарцинома). Из всех подвергнутых исследованию образцов опухолей, только в клетках опухоли 1 больного не был экспрессирован фенотип MDR (МОЯ -фенотип). У остальных 14 больных в клетках опухолей была выявлена экспрессия фенотипа множественной лекарственной резистентности (МОЯ+-фенотип): в половине случаев (50%) экспрессия функции Pgp, и во всех опухолях (100%) - экспрессия функции MRP. В клетках всех исследованных образцов нормальной ткани легкого выявлена экспрессия фенотипа MDR: приблизительно в половине случаев (45,4%) наблюдали экспрессию функции Pgp, и во всех образцах (100%) -экспрессию функции MRP. На рис. 2 представлены типичные варианты реакций клеток немелкоклеточного рака легкого на воздействие специфических ингибиторов Pgp и MRP (верапамила и генистена соответственно) - приведены результаты исследования опухолей трех больных (I - III). На рис. 3 представлены типичные варианты реакций клеток нормальной ткани легкого на воздействие верапамила и генистена - приведены результаты исследования нормальной ткани легкого двух больных (I, II).
Обращает на себя внимание наличие двух типов реакции клеток на воздействие ингибиторов - увеличение и уменьшение флюоресценции клеток, включивших доксорубицин. Первый феномен (см. реакцию клеток на воздействие верапамила на рис.2,Ш) объясняется увеличением внутриклеточного (цитоплазматического) содержания доксорубицина. Второй - изменением внутриклеточного распределения доксорубицина, приводящего к увеличению ядерной фракции антибиотика и его связыванием с ДНК (см. реакцию клеток на воздействие генистеина на рис.2 и 3, а также реакцию клеток на верапамил на рис.2,11 и 3,11). Такая трактовка становится понятной, если принять во внимание две группы фактов. Во-первых, известно, что характерным свойством доксорубицина является значительное (до 40 раз) тушение флюоресценции при его связывании с ДНК, что позволяет использвать этот антибиотик в качестве специфического флюоресцентного зонда, тушение флюоресценции которого в среде инкубации с клетками является количественным показателем связывания с ДНК (Богуш и др., 1995). Во-вторых, показано, что Pgp и MRP осуществляют не только выброс цитостатиков из клеток, но и контролируют их внутриклеточное распределение между ядром и цитоплазмой (Larsen et ah, 2000; Gong et ah, 2000; Rajagopal, Simon, 2003). Ингибирование функции Pgp и/или MRP в опухолевых клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности приводит к увеличению соотношения содержания доксорубицина в ядре по сравнению с цитоплазмой, при этом общая флюоресценция клеток, определяемая содержанием антрациклина в цитоплазме, не достигает уровня в клетках дикого типа, не экспрессирующих эти транспортные белки (Yang et ah, 2001).
Поэтому смещение пиков флюоресценции клеток, накопивших доксорубицин, в область меньшей интенсивности (см. реакцию клеток на генистеин на рис.2 и 3, а также реакцию клеток на воздействие верапамила на рис. 2,11 и 3,11), по существу, отражает переход антрациклина в ядро и его связывание с ДНК. Последнее очень важно, поскольку биологическая эффективность большинства цитостатиков реализуется именно при взаимодействии с ДНК или ядерными ферментами. Следует отметить, что такой тип реакции, то есть увеличение поступления препарата в ядро, был выявлен в клетках практически всех из исследованных образцов опухолей и нормальной ткани легкого после воздействия специфического ингибитора MRP - генистеина и лишь в некоторых случаях после воздействия ингибитора Pgp -верапамила. А так как в клетках нормальной ткани легкого сдвиг пика флюоресценции доксорубицина влево после воздействия верапамила выявляли чаще, чем в опухолевых клетках, можно предположить, что функция Pgp в нормальной ткани легкого выражена сильнее, чем в опухоли. Это, в свою очередь, может свидетельствовать о выполняемой Pgp защитной функции в клетках нормальной ткани легкого и потере способности экспрессировать этот белок в ходе опухолевого развития.
В то же время, эти результаты в совокупности с данными, упомянутыми выше, о высокой частоте экспрессии функции MRP в клетках исследованных опухолей, позволяют заключить, что экспрессия функции именно MRP является определяющей в реализации фенотипа множественной лекарственной резистентности рака легкого. Более того, полученные результаты позволили довести это заключение до логического завершения: в клетках рака легкого с высокой частотой экспрессирован функционально активный транспортный белок MRP, который осуществляет контроль за наиболее важной составляющей накопления препарата в клетке - его поступлением в ядро.
Итак, воздействие цисплатина и карбоплатина на внутриклеточное накопление доксорубицина оценивали в клетках опухолей и нормальной ткани легкого с охарактеризованным фенотипом множественной лекарственной резистентности. В образце опухоли с MDR enoranoM (то есть при отсутствии реакции клеток на верапамил и генистеин - рис.4) реакция клеток на воздействие цисплатина отсутствовала (рис. 4). В клетках же опухолей и нормальной ткани легкого с MDR+-фенотипом препараты платины приводили к увеличению поступления доксорубицина в клетки.
На рис. 5 представлены типичные варианты реакций клеток немелкоклеточного рака легкого на воздействие препаратов платины - приведены результаты исследования опухолей трех больных (I - III). На рис. 6 представлены типичные варианты реакций клеток нормальной ткани легкого на воздействие препаратов платины - приведены результаты исследования нормальной ткани легкого трех больных (I - III).
Влияние цисплатина на связывание доксорубицина с ДНК
Прежде всего, важно было исключить возможность химического взаимодействия препаратов платины с доксорубицином, так как это могло привести к частичному или полному тушению флюоресценции доксорубицина. Для того, чтобы доказать или опровергнуть это предположение, к раствору цисплатина добавили доксорубицин. Результаты 3-х независимых экспериментов представлены на рис. 26.
Следует отметить, что флюоресценция цисплатина при длине волны 470 нм (длина волны, при которой измеряется флюоресценция доксорубицина) равна нулю. Из представленных на рис. 26 данных видно, что существует химическое взаимодействие доксорубицина с цисплатином, которое приводит к снижению флюоресценции доксорубицина. При этом степень тушения флюоресценции доксорубицина составляет в среднем около 19% при концентрации цисплатина 3,3x10 3М (Цплі), 13% при концентрации цисплатина 1,6x10"3М (Цплі/2) и 13% при концентрации цисплатина 3,3x10" М (Цпл 1/10). Однако такое незначительное уменьшение флюоресценции доксорубицина после воздействия цисплатина само по себе не могло привести к выраженному (до 3 раз) снижению внутриклеточной флюоресценции, выявленному нами при оценке действия препаратов платины на накопление доксорубицина в клетках солидных опухолей человека (см. главу 3.1). Следовательно, химическое взаимодействие цисплатина с доксорубицином не может рассматриваться в качестве объяснения выявленного феномена. Более того, из представленных данных видно, что при такой постановке эксперимента не существует зависимости между интенсивностью флюоресценции доксорубицина и дозой цисплатина, тогда как на опухолевых клетках немелкоклеточного рака легкого была выявлена четкая зависимость интенсивности внутриклеточной флюоресценции доксорубицина от воздействующей на клетки концентрации цисплатина (см. главу 3.2).
формируются устойчивые связи внутри одной нити или параллельных нитей двойной спирали ДНК. Это, в свою очередь, подавляет процесс репликации и тормозит деление клеток. Доксорубицин также реализует свой противоопухолевый потенциал путем связывания с ДНК клетки: антрациклины интеркалируют двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований, в результате чего изменяется пространственная структура ДНК. Учитывая то, что и цисплатин, и доксорубицин взаимодействуют с ДНК клетки, мы предположили, что цисплатин может влиять на процесс связывания доксорубицина с ДНК. Поэтому мы предположили, что возможным объяснением выявленного на клиническом материале уменьшения внутриклеточной флюоресценции доксорубицина после воздействия на клетки препаратов платины может послужить увеличение связывания доксорубицина с ДНК за счет повышения ее сродства к антрациклину после воздействия препаратов платины. Чтобы проверить или опровергнуть это предположение была проведена серия опытов по оценке изменения флюоресценции доксорубицина при добавлении его к ДНК в присутствии цисплатина.
Перед проведением опыта по изучению влияния цисплатина на взаимодействие доксорубицина с ДНК необходимо оценить степень изменения флюоресценции доксорубицина при его взаимодействии с ДНК и определить зависимость между концентрацией ДНК в растворе и степенью тушения доксорубицина. Следует отметить, что флюоресценция раствора ДНК при длине волны 470 нм (при данной длине волны измеряют флюоресценцию доксорубицина) равна нулю. Средняя флюоресценция доксорубицина при отсутствии в растворе ДНК составляет 183 ед. При добавлении к раствору ДНК в разных концентрациях доксорубицина флюоресценция последнего снижается. Полученные данные можно отобразить в виде кривой титрования доксорубицина, представленной на рисунке 27.
На представленном графике по оси абсцисс отложены значения отрицательного десятичного логарифма концентрации ДНК, выраженной в мг/мл. По оси ординат отложена интенсивность флюоресценции доксорубицина в исследуемом растворе, выраженная в относительных единицах. Видно, что при высоких концентрациях ДНК (1x10"2 мг/мл, 5х10"3 мг/мл, что соответствует значениям отрицательного логарифма 2 и 2,3 соответственно) флюоресценция доксорубицина в растворе приближается к нулю. При низких концентрациях ДНК (lxlO"4 мг/мл и 1х10"5 мг/мл, что соответствует значениям отрицательного логарифма 4 и 5 соответственно) флюоресценция стремится к контролю, т. е. к 183 ед. На участке кривой между значениями отрицательного логарифма 2,6 и 3,3
![Функциональная активность и прогностическая значимость АВС-транспортеров у больных раком молочной железы [Электронный ресурс]](/i/i/4375/185331.png "Функциональная активность и прогностическая значимость АВС-транспортеров у больных раком молочной железы [Электронный ресурс] Тимофеева Надежда Владимировна")
![Иммунометаболическая активность регуляторов энергетического обмена при алиментарных нарушениях [Электронный ресурс]](/i/i/4372/207855.png "Иммунометаболическая активность регуляторов энергетического обмена при алиментарных нарушениях [Электронный ресурс] Денисюк Татьяна Алексеевна")
