Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Патогенетические аспекты глаукомнои оптической нейропатии (обзор литературы) 11
1.1. Цели и задачи нейропротекции у больных ПОУГ 14
1.2. Нейропротекторная эффективность известных препаратов для лечения глаукомной оптической нейропатии 16
1.3. Современные возможности исследования апоптоза и роли эндогенных антиоксидантов в его развитии 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материал клинического исследования 30
2.2. Методы клинического исследования 32
2.3. Материалы и методы исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo 35
2.4 Материалы и методы исследований антиапоптозных свойств фенотропила 40
2.5. Методы статистической обработки 41
ГЛАВА 3. Результаты экспериментальных исследований
3.1 Результаты экспериментальных исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo 42
3.2. Результаты экспериментальной оценки антиапоптозной эффективности лекарственных препаратов на модели апоптоза 48
ГЛАВА 4 . Результаты двойного слепого плацебо контролируемого рандомизированного исследования эффективности препарата фенотропил у больных нестабилизированной первичной открытоугольной глаукомой 52
4.1. Анализ гидродинамических изменений у больных ПОУГ в результате лечения фенотропилом 52
4.2. Влияние фенотропила на светочувствительность сетчатки у больных нестабилизированной ПОУГ обеих клинических групп 53
4.3. Отдаленные результаты лечения пациентов обеих групп 65
Заключение 72
Выводы 78
Практические рекомендации 79
Список литературы 80
- Нейропротекторная эффективность известных препаратов для лечения глаукомной оптической нейропатии
- Материалы и методы исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo
- Результаты экспериментальных исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo
- Анализ гидродинамических изменений у больных ПОУГ в результате лечения фенотропилом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) является одной из основных причин слепоты и слабовидения в мире. С возрастом число больных увеличивается от 0,1-1,5% в 40-45 лет до 10-14%о в 75 лет и выше [65, 67, 68].
Несмотря на внедрение новых методов диагностики и лечения, процент тяжелых исходов с каждым годом увеличивается. Глаукомой болеют от 70 до 90 млн. человек, причем около 10% из них становятся слепыми на оба глаза [130].
По прогнозам, сделанным в 2006 году, больных первичной глаукомой к 2010 году будет около 60,5 миллионов человек, а к 2020 году число больных может увеличиться до 79,6 миллионов. Из них 74%) будет иметь ПОУГ. От двухсторонней слепоты в 2010 году пострадают около 4,5 миллионов человек с первичной открытоугольной глаукомой и 3,9 миллионов людей с закрыто-угольной глаукомой с постепенным повышением до 5,9 и 5,3 миллионам человек соответственно к 2020 году [187].
Анализ за период 1994-2002 г.г., проведенный в 27 субъектах РФ, показал повышение частоты глаукомы в среднем от 3,1 до 4,7 на 1000 населения [54]. А удельный вес глаукомы среди причин первичной инвалидности за 5 лет (2000-2005) возрос с 20 до 28%), увеличилась и распространенность заболевания с 0,15 до 0,60 на 10000 взрослого населения [55].
Непосредственной причиной слепоты и слабовидения является глау-комная оптическая нейропатия и апоптоз ганглиозных клеток сетчатки [127, 139].
Особую остроту проблема лечения глаукомы приобретает в далеко зашедшей стадии заболевания, при которой дефицит кровоснабжения глаза ведет к ухудшению питания тканей, а повышенный на этом фоне офтальмотонус усугубляет ранее возникшие нарушения микроциркуляции и
процессов метаболизма в сетчатке, хориоидее и зрительном нерве [6, 12, 32, 33, 39, 50, 66, 74].
Большинство офтальмологов при лечении больных далеко зашедшей стадией заболевания приходят к выводу о целесообразности оперативного лечения [1,6,49,52,66].
Однако отдаленные результаты других авторов показывают, что, несмотря на нормализацию ВГД, падение зрительных функций в послеоперационном периоде продолжается [2, 47, 69, 71, 72, 80, 85, 129, 144, 200].
В.Г.Абрамов с соавт. [1], наблюдая группу из 62 больных в течение 5-19 лет после операции, несмотря на нормализацию ВГД, улучшение отмечал в 10 процентах случаев. У остальных наблюдалась стабилизация процесса или постепенное снижение зрительных функций.
А.Н.Добромыслов и соавт. [17], анализируя на большом материале результаты лечения больных за 10 лет, установили, что стабилизация зрительных функций в отдаленном периоде у больных, оперированных в далеко зашедшей стадии, составляет лишь 37%, в то время как в развитой стадии - в 50,2%о, а в начальной стадии - в 81% случаев. Число оперированных в далеко зашедшей стадии заболевания составляет 39,2%о от всех больных, кому выполнялись актиглаукоматозные операции.
Исследования прошлых лет полностью подтверждаются 6 основными рандомизированными клиническими исследованиями, проведенными за последние 10 лет, которые продемонстрировали прогрессирующее падение зрительных функций, не смотря на снижении ВГД до возможного минимума [84, 105, 137, 189,204,205].
Учитывая вышесказанное, имеется настоятельная необходимость в назначении препаратов, защищающих зрительный нерв от повреждения, с этой целью предложено большое количество лекарственных средств. Однако на сегодняшний день есть весьма ограниченный выбор препаратов с доказанной
эффективностью, применяемых в офтальмологии и позиционирующихся как нейропротекторы: супероксиддисмутаза, ретиналамин и бетаксолол. Большие надежды возлагались на препарат мемантин, который в экспериментальных и рандомизированных клинических исследованиях (РКИ) с небольшим количеством испытуемых продемонстрировал высокую эффективность. Но в многоцентровом РКИ с участием более 1000 человек не было различий между группами, получающими препарат и принимающими плацебо.
Все вышесказанное подчеркивает значение глаукомной оптической нейропатии в развитии слепоты при глаукоме и актуальность поиска эффективных лекарственных препаратов с позиций доказательной медицины, которые снижают или полностью предотвращают падение зрительных функций при нестабилизированной глаукоме.
Цель исследования:
Оценить эффективность комплексной гипотензивной и
нейропротекторной терапии оптической нейропатии у больных нестабилизированной первичной открытоугольной глаукомой.
Задачи исследования:
Произвести экспериментальную оценку влияния препарата фенотропил В' сравнении с известными антиоксидантами на естественные внутриклеточные антиоксидантные системы на растительном материале in vivo.
Оценить антиапоптозные свойства препарата фенотропил на растительной модели апоптоза - этиолированных колеоптилей пшеницы средствами по-лимеразной цепной реакции (ГТЦР) с выделением ДНК и определением биохимического маркёра апоптоза.
3. Выполнить двойное слепое плацебо контролируемое исследование ней
ропротекторной эффективности и безопасности препарата фенотропил в
лечении больных первичной нестабилизированной открытоугольной
глаукомой.
4. Изучить клиническую эффективность препарата фенотропил в отдаленном периоде наблюдений и разработать рекомендации по его использованию в клинической практике. Научная новизна
Впервые проведена экспериментальная оценка влияния лекарственных препаратов на естественные внутриклеточные антиоксидантные системы на растительном материале.
Впервые предложен метод оценки антиапоптозной активности лекарственных препаратов с выделением ДНК и определением биохимического маркера апоптоза на основе полимеразной цепной реакции и растительной модели апоптоза.
Впервые по результатам двойного слепого плацебо контролируемого рандомизированного клинического исследования доказана возможность и безопасность применения фенотропила в комплексном лечении больных нестабилизированной ПОУГ в качестве непрямого нейропротектора.
Изучена клиническая эффективность предлагаемого препарата у больных первичной нестабилизированной открытоугольной глаукомой в отдаленные сроки наблюдения (6 мес).
Практическая значимость работы
Предложено и обосновано лечение нестабилизированной первичной открытоугольной глаукомы препаратом фенотропил 2 раза в год в течение 1 месяца.
Предложен способ изучения антиапоптозных свойств лекарственных препаратов in vivo на доклинических этапах исследования
Предложен способ оценки воздействия лекарственных препаратов на естественные внутриклеточные антиоксидантные системы на растительной модели.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Препарат фенотропил оказывает влияние на естественные
внутриклеточные антиокислительные системы in vivo и способствует
повышению уровня эндогенных антиоксидантов: супероксиддисмутазы,
каталазы, витамина Е и С в клетках растительного организма.
2. Метод оценки антиапоптозной активности лекарственных препаратов с
выделением ДНК и определением биохимического маркера апоптоза на
основе полимеразнои цепной реакции в растительной модели позволяет
экспериментально оценить антиапотозную активность препарата
фенотропил, который на 16,6% ингибирует время развития апоптоза по
сравнению с контролем.
Фенотропил улучшает показатели периметрии и пространственной контрастной чувствительности в области средних пространственных частот на ахроматический и синий паттерн у 75% пациентов и не влияет на уровень внутриглазного давления, показатели гидродинамики и остроту зрения у больных первичной открытоугольной глаукомой.
Препарат фенотропил обладает нейропротекторной эффективностью у больных нестабилизированной глаукомой с нормализованным внутриглазным давлением. При приеме препарата по 100 мг 1 раз в день в течение 1 месяца достигается стабилизация процесса в 75% случаев, что на 30,6% превосходит эффект плацебо. В течение 6 месяцев наблюдения положительный эффект препарата фенотропил сохраняется у 62,5-66,5% пациентов, превышая исходные показатели.
Внедрение в практику
Предложенный способ лечения глаукомной оптической нейропатии, практические и теоретические результаты диссертационной работы внедрены в Городской больнице скорой медицинской помощи им. Семашко г. Орла, ООО «Офтальмологический центр» проф. С.Н. Басинского, г. Орла. Материалы диссертации частично используются при проведении семинарских занятий и чтении лекций для студентов, ординаторов, врачей-интернов, ординаторов, аспи-
рантов на кафедре специализированных хирургических дисциплин медицинского института Орловского государственного университета.
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикаций.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 101 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, клинических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 20 таблицами. Указатель литературы включает 214 источников: 82 отечественных и 132 зарубежных авторов.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на: областном научно-практическом обществе врачей офтальмологов (Орел, 2007); VII Всероссийской конференции с международным участием «Федоровские чтения - 2008» и сателлитном симпозиуме «Глаукома при общих заболеваниях» (Москва, 2008); VIII экспертном совете по глаукоме (Кемер, 2008); VI международной конференции «Глаукома: теории, тенденции, технологии» (Москва, 2008); Межобластной конференции межрегионального общества врачей офтальмологов (Орел, 2008); заседании общества ассоциации врачей офтальмологов Красноярского края (Красноярск, 2008); межкафедральном совещании медицинского института Орловского госуниверситета (Орел, 2009).
Нейропротекторная эффективность известных препаратов для лечения глаукомной оптической нейропатии
По мнению В.В. Волкова, для стабилизации зрительных функций необходимо использовать комплекс мер, направленных на улучшение кровообращения в ДЗН, увеличение уровня метаболизма в опорных структурах решетчатой мембраны и повышение, таким образом, ее прочности. Кроме того, необходимо воздействие нейропротекторными препаратами и физиотерапевтическими методами на еще не погибшие, но уже испытывающие влияние неблагоприятных факторов (метаболических, ишемизирующих, аутоиммунных, гипероксидных и др.) аксоны ганглионарных нервных клеток [15]. В этом направлении выполнены многочисленные исследования с использованием лекарственных препаратов из разных групп. Для коррекции нарушений микроциркуляции в сосудах зрительного нерва и сетчатки при глаукоме предприняты попытки использования комплексного медикаментозного лечения, включающего: вазодилятаторы; антисклеротические препараты; средства, улучшающие микроциркуляцию и тканевые обменные процессы [13, 21, 22, 24, 27, 28, 31, 41, 42, 43, 44, 46, 48,51,63,78, 101, 106]. Исторически нейропротекторы демонстрировали низкую эффективность в клинических испытаниях, несмотря на успешную доклиническую апробацию на моделях животных. Клинические исследования более чем 100 кандидатов в нейропротекторы показали их низкую эффективность или не безопасность [86, 99, 168].
За последние годы проведено много экспериментальных и клинических исследований влияния различных лекарственных веществ на стабилизацию зрительных функций при глаукомной оптической нейропатии. Наиболее значимые из них представлены ниже: King СЕ. и соавт. сообщают об экспериментальных исследованиях ци-токина эритропоэтин (ЕРО). Результаты свидетельствуют, что препарат об ладает не только нейропротективным эффектом, но и вызывает нейрорегене-рацию пересеченных аксонов. Способность эритропоэтина преодолевать ге-моэнцефалический барьер делает его весьма перспективным в целях восстановления поврежденных нервных клеток [123, 124].
Представляют большой интерес антагонисты NMDA-рецепторов, к которым относится мемантин - антагонист рецептора глутамата подтипа N-METHYL-D-ASPARTATE (NMDA). Исследования, проведенные Lipton S.A. показали, что мемантин блокирует лишь чрезмерную деятельность рецептора NMDA, не нарушая их нормальную функцию [146, 197]. В 2007 году завершены два параллельных, многолетних, с двойным слепым контролем, плацебо контролируемые исследования безопасности и эффективности препарата мемантин при открытоугольной глаукоме. В каждом исследовании зарегистрировано более 1000 пациентов, которые также получали стандартную гипотензивную терапию [120, 151, 197].
Чрезвычайно актуально для лечения глаукомы сочетание гипотензивного и нейропротекторного эффекта. Известно, что препарат бетаксалол - селективный бета-блокатор, помимо снижения ВГД, также имеет функцию блокатора кальциевых каналов [135, 174]. Chen Y.N. и соавт. доказали, что наряду с бетаксололом нейропротекторным эффектом при ишемии глаза обладает тимолол и нипрадилол [135]. Dong Y. И соавт. в эксперименте показали, что тимолол обладает способностью блокировать кальциевые каналы и расширять сосуды наряду с бетаксололом, но эффект тимолола составляет 70% от эффекта бетоптика [114].
Непосредственное воздействие на про- и антиапоптозные гены является весьма перспективным направлением в лечении оптической нейропатии. Процесс апоптоза генетически детерминирован и регулируется следующими генами: усиление работы генов Сірі (р21), Вах (р21), Daax и др., белков р53, р21 ускоряет течение апоптоза [58, 147]; гены семейства Bcl-2, Bad, Bagl препятствуют апоптозу ганглиозных клеток. Антиапоптозный ген Bcl-2 Вс1-2 и связанные белки - главные ингибиторы апоптоза. Реализуется эта функция через опосредованное блокирование белков каспаз, участвующих в протеолизе белков клетки. Отдельные авторы для регуляции апоптоза предлагают ингибировать фактор некроза опухоли (ФНО). ФНО функционирует как фактор транскрипции, который при увеличении усиливает проявление проапоптозного гена Ьах, а при снижении усиливает проявление антиапоптозного гена bcl-2 и, тем самым, предотвращает апоптоз. В качестве ингибитора исследуется препарат рекомби-нантный интерлейкин-6 [83, 148, 166].
М. Schwartz на основе экспериментальных исследований предположил, что возможно создание вакцины для лечения глаукомы. При возникновении повреждения вакцина будет блокировать многие из факторов, вызывающих апоптоз, например, ФНО, коллапсин, и кроме того стимулировать восстановление клеток [153]. М. Schwartz на основании своих исследований предлагает нейропротективную прививку на основе клеток Т- лимфоцитов для предотвращения прогрессирования болезни. Активизированные Т- клетки индуцируют образование цитокинов и факторов роста, воздействуют на микро-глию, макрофаги, обеспечивая их защитным фенотипом. Активизированная микроглия может утилизировать глутамат и продукты повреждения, продуцировать факторы роста, одновременно блокируя синтез агентов (глутамат, нитроокислы, ФНО, активные формы кислорода), которые являются частью механизма развития апоптоза [103, 153, 162, 181].
Продвигаясь в этом же направлении, другие авторы предложили наиболее безопасный препарат glatiramer acetate - синтетический олигопептид естественных аминокислот, который опосредованно вызывая ответ Т- лимфоцитов, воздействует на участок повреждения. Glatiramer acetate проходит одобрение FDA в качестве препарата для лечения рассеянного склероза [208]. На модели глаукомы у крыс на фоне длительно повышенного ВГД, прививка с glatiramer acetate значительно уменьшает потерю ганглиозных клеток, даже когда ВГД остается высоким [162, 207].
Материалы и методы исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo
Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры физиологии и биотехнологии растений Орловского государственного аграрного университета совместно с доктором сельскохозяйственных наук, профессором Н.Е. Павловской и кандидатом сельскохозяйственных наук И.Н. Гагариной. В эксперименте использовали семена гороха (30 граммов на пробу), которые замачивали в дистиллированной воде на 12 часов (ГОСТ № 12038-84). Изначально семена гороха для прорастания укладывали в чашки Петри (10 штук) на увлажненную фильтровальную бумагу. Затем семена ежедневно опрыскивали растворами лекарственных препаратов до увлажнения в следующих разведениях (на 100 мл): 3 пробы - по 0,05, 0,1 и 0,2 г фенотропила, 2 пробы по 0,5 и 1,0 г аскорбиновой кислоты, 2 пробы по 0,2 и 0,4 г-витамина Е, 2 пробы по 0,05 и 0,1 г эмоксипина. Состояние экспериментальных растений сравнивали с контролем, где растения опрыскивали аналогично только дистиллированной водой. Эксперимент проводился в течение 10 дней - с 04.04.2008 г. по 14.04.2008 г. Ежедневно в 11 часов растения опрыскивали вышеуказанными растворами препаратов. В соответствии с ГОСТ № 12038-84, начиная с четвертого дня вегетации, стебель и с пятого дня - корень отделяли от семян. С помощью методик, описанных ниже, определялось количество супероксид дисмутазы, каталазы, пероксидазы, аскорбиновой кислоты, токоферола в каждой из проб. Использованы традиционные методики определение активности супер-оксиддисмутазы, пероксидазы, каталазы, содержания витаминов С и Е [34,35]. Для определение активности супероксиддисмутазы использовали весы лабораторные, фотоэлектроколориметр КФК-22 (Россия), центрифугу ОП-8, фотореактор и следующие реактивы: дигидроортофосфат калия, М=136 г/моль; гидроксид калия, М=56 г/моль; метионин, М=149 г/моль; ЭДТА, динатриевая соль, М=416 г/моль; нитросиний тетразолий, М=818 г/моль; рибофлавин, М=376 г/моль.
Методика определения активности супероксиддисмутазы (СОД): растительный материал измельчали в ступке с молотым стеклом в 25 мл фосфатного буферного раствора с рН 7,8 и центрифугировали с частотой 7000 об./ мин в течение 15 мин., затем отделяли надосадочную жидкость и вели дальнейшие эксперименты с ней (в дальнейшем - экстракт супероксиддисмутазы, СОД). Для определения активности СОД была использована методика, основанная на ингибировании восстановления нитросинего тетразо-лия.
Реакционная среда, общим объемом 2,5 мл содержала 50 мМ фосфатного буфера с рН 7.8, 13 мМ L-метионина, 75 мкМ нитросинего тетразолия, 2 мкМ рибофлавина, 0.1 мМ ЭДТА и 0.5 мл экстракта СОД. Рибофлавин добавляли в последнюю очередь и облучали контрольные и опытные пробирки светом люминесцентной лампы мощностью 30 Вт. Через 15 минут реакцию прекращали, выключая лампу, затем измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре КФК-2 при длине волны 540 нм. Необлученная реакционная смесь не окрашивалась и служила базовой линией для спектрофотометра. Реакционная смесь, лишенная фермента, приобретала интенсивное пурпурное окрашивание в результате максимального восстановления нитросинего тетразолия. Интенсив ность окрашивания смеси, содержащей супероксиддисмутазу, была невысока и зависела от активности фермента.
Активность СОД рассчитывали по формуле: - СОД-\А контр" L х) i-J контр ( » реакц.смеси » экстракта) \У для реакции ГПнанескиЛ где АСод-активность супероксиддисмутазы, О К0Н1р-среднее арифметическое из оптических плотностей контрольных растворов, 0 х-среднее арифметическое из оптических плотностей растворов с содержанием экстракта, Vpe. акихмеси- Общий объем реаКЦИОННОЙ СМЄСИ, Узкстракта-объеМ ЭКСТраКТа, Удля реакции -объем экстракта, взятого для реакции; тмавсски-масса навески биологического материала. Для проведения колориметрического определения активности пероксидазы использовали весы лабораторные, фотоэлектроколориметр КФК-22, центрифугу ОП-8, термостат, фарфоровую ступку с пестиком, конические колбы на 50, 150, 250 мл, мерные стаканы, мерный цилиндр на 25мл, кварцевые кюветы. Применяли следующие реактивы: ацетатный буфер рН 5,4:0,2М ацетата натрия и 0,2М уксусной кислоты; раствор бензидина: готовят на ацетатном буфере (в мерную колбу на 200 см3 наливают примерно 100 см3 дистиллированной воды, прибавляют 2,3см3 ледяной уксусной кислоты 184 мг бензидина; колбу нагревают на водяной бане при 60С, постоянно взбалтывая; после полного растворения бензидина в колбу добавляют 5,45 г уксуснокислого натрия, охлаждают и доводят водой до метки; 0,3%-я перекись водорода.
Для определения активности пероксидазы растительный материал измельчали в ступке с молотым стеклом в 20 мл ацетатного буферного раствора с рН 4,8 и центрифугировали с частотой 4000 об./мин в течение 15 минут, затем отделяли надосадочную жидкость и вели дальнейшие эксперименты с ней (в дальнейшем - экстракт пероксидазы), основанная на окислении бензидина перекисью водорода под действием пероксидазы. В кювете спектрофотометра КФК-2 смешивали 1.95 мл ацетатного буферного раствора с рН 4.8, 0.05 мл экстракта пероксидазы, 1 мл 3%-й перекиси водорода и 1 мл 0.005 М раствора бензидина. После добавления бензидина сразу включали секундомер и записывали его показания после того, как оптическая плотность реакционной смеси на длине волны 490 нм достигала 0.15. Активность пероксидазы рассчитывали по формуле
А=0-а-б-в/(с-і),где D-оптическая плотность растворов, D=0,15; а-степень разбавления навески в экстракте, к массе сырой ткани, мл/г; б-степень разбавления экстракта, взятого для реакции; с-длина оптического пути в кювете, с=1см, с; в-степень разбавления экстракта в реакционной смеси; t-время в секундах, требующееся реакционной смеси для достижения оптической плотности D=0,15.
Для определение активности каталазы использовали весы лабораторные, центрифугу ОП-8, термостат, фарфоровая ступку с пестиком, конические колбы на 50, 150, 250 мл, мерные стаканы, мерный цилиндр на 25мл, стеклянные пипетки на 1, 2, 5 мл. Реактивы. Ацетатный буфер рН 5,4:0,2М ацетата натрия и 0,2М уксусной кислоты, 1%-я перекись водорода, 10%-ая серная кислота. Для определения активности каталазы мы использовали методику, основанную на измерении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Количество выделившегося кислорода измеряли в специальном приборе. Для определения активности каталазы навеску листьев гороха растирали в фарфоровой ступке с молотым стеклом в 20 мл фосфатного буферного раствора с рН 7.8. Полу-ченную массу переносили в мерную колбу на 100 см , доводили до метки буферным раствором, переносили взвесь в коническую колбу и помещали её на механический встряхиватель на 30 минут. Далее суспензию переносили в реакционный сосуд прибора, прибавляли против вспенивания 3-5 капель толуола. Затем помещали туда маленький стаканчик с 3 см3 3 % НаС1. Реакционный сосуд соединяли с остальной частью прибора и запускали связанную с реакционным сосудом 1 магнитную мешалку (скорость 600 об./мин), которая опрокидывала стаканчик с перекисью водорода, запуская тем самым реакцию. Объем выделившегося кислорода регистрировали с 3-ей по 15-ю минуту после начала реакции с интервалом 3 мин. Затем выстраивали кинетические кривые зависимости объема выделившегося 02 от времени и аппроксимировали их функцией вида y—a-Ln(x)+b. В качестве исходного показателя активности каталазы использовали предлогарифмический коэффициент а. Для того чтобы нивелировать влияние колебаний навески на результат эксперимента коэффициент а делили на массу навески, получая, таким образом, приведенный предлогарифмический коэффициент, являющийся окончательным показателем активности каталазы.
Результаты экспериментальных исследований антиоксидантной активности фенотропила in vivo
Оценка антиоксидантной активности препарата фенотропил и известных антиоксидантов основывалась на том, что при наличии антиоксидантного эффекта в клетках и тканях растения в больших количествах сохраняются эндогенные антиокислители.
В результате проведенных экспериментов нами были получены данные, свидетельствующие о том, что эти препараты по-разному влияют на те или иные звенья антиоксидантной системы (табл. 3-7). Наиболее эффективным препаратом с широким спектром антиоксидантной активности показал себя фенотропил в дозе 50 мг. При обработке этим препаратом сохранялось более высокое количество таких эндогенных антиокислителей как: супероксиддисмутаза, каталаза, витамин Е и С.
В пробах, где обработка производилась аскорбиновой кислотой, увеличивалось эндогенное содержание аскорбиновой кислоты и особенно каталазы, которая в ростках к концу исследования в четыре раза превышала содержание каталазы в контроле. Препарат эмоксипин показывал некоторую активность в повышении уровня супероксиддисмутазы, каталазы и витамина ЕТаким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что препарат фенотропил обладает антиокислительной активностью, нейтрализуя окислители и тем самым повышая уровень эндогенных антиоксидантов: су-перо ксидд и смутазы, каталазы, витаминов Е и С. Различные препараты и различные дозировки препаратов отличаются по эффективности и спектру воздействия на окислители, что необходимо учитывать при дальнейших клинических исследованиях. Предложенный метод оценки антиоксидантной активности фенотропила и других лекарственных средств может быть использован для оценки эффективности препаратов in vivo на доклиническом этапе исследований.
Результаты экспериментальной оценки антиапоптозной эффективности лекарственных препаратов на модели апонтоза При анализе состояния ДНК с помощью полимеразой цепной реакции на 4 день эксперимента (рис. 3) апоптоз отсутствовал как в контроле, так и во всех пробах экспериментальных растений. уДШІ Рис. 3. Четвертый день эксперимента. 1. Вода (контроль); 2. Фенотропил 25 мг; 3. Фенотропил 50 мг; 4. Мемантин 5 мг; 5. Мемантин 10 мг; Нобен 30 мг. На пятый день эксперимента результаты электрофоретического разделения белков в агарозном геле оставалась практически без изменений (рис. 4) Рис. 4. Пятый день эксперимента. 1. Контроль; 2. Фенотропил 25 мг; 3. Фенотропил 50 мг; 4. Мемантин 5 мг; 5. Мемантин 10 мг; Нобен 30 мг. На шестой день эксперимента в контроле появлялась классическая «лесенка» - маркер апоптоза (рис. 5). В остальных пробах апоптоз отсутствовал. Рис. 5. Шестой день эксперимента. 1. Контроль; 2. Фенотропил 25 мг; 3. Фенотропил 50 мг; 4. Мемантин 5 мг; 5. Мемантин !0 мг; Нобен 30 мг. На седьмой день эксперимента (рис. 6) апоптоз появлялся в растениях, обрабатывавшихся фенотропилом 25 и 50 мг и мемантином 5 мг. Отсутствовал апоптоз в растениях, обрабатываемых мемантином 10 мг. Рис. 6. Седьмой день эксперимента. 1. Контроль; 2. Фенотропил 25 мг; 3. Фенотропил 50 мг; 4. Мемантин 5 мг; 5. Мемантин 10 мг; Нобен 30 мг. На восьмой день апоптоз определялся во всех растениях, кроме растений, которые обрабатывались нобеном, в них так и не было отмечено появления характерной «лесенки», биохимического маркера апоптоза, так как в некротических клетках и тканях ДНК очень быстро, хаотично деградирует. Кроме того, сами растения отличались от остальных тем, что отставали в росте. На основании этого был сделан вывод о развитии некроза (рис.7). Рис. 7. Восьмой день эксперимента. 1. Вода (контроль); 2. Фенотропил 25 мг; 3. Фенотропил 50 мг; 4. Мемантин 5 мг; 5. Мемантин 10 мг; 6. Нобен 30 мг. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии анти-апоптозного эффекта у фенотропила. В контроле развитие апоптоза наступало на шестые сутки (через 144 часа), а у растений, обработанных фенотропи-лом, на одни сутки позже, что составило 16,7% по сравнению с контролем. Ингибирование апоптоза является показателем, указывающим на положительное воздействие препарата на различные механизмы и этапы его развития. Предложенный метод может служить моделью для оценки анти-апоптозной активности препаратов на экспериментальном этапе их исследования.
Анализ гидродинамических изменений у больных ПОУГ в результате лечения фенотропилом
Произведена оценка влияния препарата фенотропил в дозе 100 мг при однократном приеме утром в течение 30 дней в сравнении с исходными данными по результатам периметрии в 1 группе. Исследование производилось в сроки от 1 до 10 дней после завершения месячного курса приема препарата. Улучшение показателей, которое выражалось в уменьшении абсолютных скотом, увеличении числа нормальных точек и уменьшении показателя дефицита поля зрения, наблюдалось у 18 человек - 75% (рО.001), у 2-х человек (8,3%)) поле зрения осталось без изменений, и у 4-х человек (16,7% ) поле зрения было хуже исходных данных (табл. 10). распределение пациентов по полученному эффекту на основе периметрии после 1 месяца лечения фенотропилом показатели n улучшение без изменения ухудшение Абсолютные показатели 24 18 2 4 Относительные 100% 75% 8,3% 16,7% Результаты анализа показывают, что после проведенного лечения больных нестабилизированной глаукомой фенотропилом у 75% достигнуто улучшение полей зрения, а еще у двух пациентов (8,3%) показатели периметрии оставалось стабильными. Такими образом, после приема фенотропила у 83,3%о пациентов поля зрения были лучше исходных или оставались на прежнем уровне. Анализ средних данных периметрии по 1 группе пациентов представлен в таблице динамика показателей периметрии до приема и через месяц После приема препарата фенотропил в 1 группе Показатели Количествонормальныхточек (М±т) Количествоабсолютныхскотом (М±т) ПЧПЗ(М±т) До приема Фенотропила 101,4±5,9 53,7±5,1 47,8±7,7 После приема Фенотропила 118-,4±5,5 40,5±4,9 78,0±7,5 Достоверность (Р) 0,05 0,05 0,001 Таким образом, после приема фенотропила получено достоверное улучшение показателей периметрии. Количество нормальных точек после приема увеличилось с 101,4±5,9 до 118,4±5,5 (Р 0,001), что составляет 16,3%), а число абсолютных скотом уменьшилось на 24,6%. Более наглядно полученные результаты отражает показатель чувствительности поля зрения, который одновременно учитывает как увеличение нормальных точек, так и уменьшение числа точек, не видимых пациентом. Установлено достоверное увеличение показателя чувствительности поля зрения на 63,2% по сравнению с исходными данными.
Представляет интерес динамика показателей периметрии в более отдаленный период после приема препарата, в связи с этим мы исследовали поля зрения у больных глаукомой через месяц после завершения лечения фено-тропилом сравнительные данные периметрии непосредственно после приема фенотропила и через 1 месяц после лечения в 1 группе Показатели Количествонормальныхточек (М±т) Количество абсолютных скотом (М±т) ПЧПЗ (М±т) Через 1 месяц после окончания приема фенотропила наблюдалось дальнейшее улучшение показателей: увеличение количества нормальных точек достигло уже 19,8%, а число абсолютных скотом уменьшилось на 28,0%о, ПЧПЗ увеличился по сравнению с исходными данными на 73,2%. В целом улучшение достигнуто у 75% больных. Таким образом, улучшение показателей наблюдается непосредственно после курса лечения фенотропилом и нарастает через месяц после его окончания. Весьма существенный интерес представляли результаты исследования 2 группы пациентов, которые первоначально в течение 1 месяца принимали плацебо, что позволяло определить уровень плацебо эффекта и наиболее объективно оценить наличие или отсутствие эффекта фенотропила.
Исследование производилось в сроки от 1 до 10 дней после завершения месячного курса приема плацебо. Улучшение после приема плацебо наблюдалось у 8 человек, что составило 44,4% (р 0,05), а у 10 человек (55,6%) показатели периметрии были хуже исходных данных (табл. 13). распределение пациентов по эффекту после приема плацебо Показатели Исходноечисло пациентов Число пациентов с улучшением после 30 дней приема плацебо Число пациентов с ухудшением Абсолютные показатели 18 8 10 Относительные показатели 100% 44,4% 55,6% Анализ средних показателей периметрии по 2 группе пациентов после приема плацебо в Полученные результаты свидетельствуют о том, что даже от приема плацебо в 44,4% случаев происходило улучшение показателей периметрии. Количество нормальных точек в среднем увеличивалось с 90,1 ±5,8 до 94,1±5,7 ( 0,05), но полученный результат статистически не значим. Не сколько больше уменьшалось количество точек, которые пациенты в исходном исследовании не видели, но и этот результат наряду с показателем чувствительности поля зрения был статистически недостоверен. По нашему мнению, важным было оценить, насколько существенными будут изменения показателей периметрии после лечения фенотропилом у пациентов, которые раньше принимали плацебо. Поэтому мы сравнили динамику зрительных функций после приема плацебо и фенотропила. Анализ средних данных периметрии во 2 группе пациентов после приема плацебо и лечения фенотропилом представлен в таблице
