Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные методы лечения заболевания сетчатки 13
1.2. Понятие стволовая клетка 17
1.3. Классификация СК 18
1.4. Свойства СК 20
1.5. Возможности и перспективы применения клеточных технологий в офтальмологии 22
Глава 2. Материал и методы 35
2.1. Трансплантационный материал 35
2.2. Характер экспериментального материала 40
2.3. Характеристика методов исследования 43
Собственные исследования:
Глава 3. Изучение безопасности трансплантации МСПК и НСПК при различных способах введения в глаза экспериментальных животных51
Глава 4 . Трансплантация МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки 57
4.1. Интравитреальная трансплантация МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки 57
4.2. Трансплантация МСПК в супрахориоидальное пространство на модели лазерного повреждения сетчатки 60
Глава 5 . Изучение воздействия нейрональных стволовых клеток на моделях лазеркоагуляции и ишемии сетчатки 63
5.1. Изучение воздействия интравитреальной-трансплантации НСПК после лазеркоагуляции 63
5.2. Трансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство на модели' лазерного повреждения сетчатки 64
5.3. Супрахориоидальная трансплантация НСПК на модели острой ишемии сетчатки 65
Глава 6. Результаты электроретинографических исследований 68
6.1. Динамика электрогенеза сетчатки при интравитреальном введении МСПК на фоне лазерной коагуляции сетчатки 68
6.2. Динамика электрогенеза сетчатки при супрахориоидальном введении МСПК на фоне лазерной коагуляции сетчатки 70
6.3. Динамика электрогенеза сетчатки при интравитреальном введении НСПК 82
6.4. Трансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство на двух моделях повреждения сетчатки 86
6.4.1. Исследования эффектов НСПК на интактную сетчатку 86
6.4.2. Исследование динамики ретиналъной функции при моделировании очаговой ретиналъной патологии и ишемии сетчатки без введения НСПК 86
6.4.3. Влияние НСПК на модели очаговых дистрофических изменений в сетчатке 88
6.4.3. Влияние НСПК на модели ретиналъной ишемии (II серия, 3-я подгруппа) 89
Глава 7. Результаты гистологических исследований трансплантации МСПК и НСПК 93
Заключение 104
Выводы 109
Практические рекомендации 111
Список литературы 112
- Современные методы лечения заболевания сетчатки
- Возможности и перспективы применения клеточных технологий в офтальмологии
- Интравитреальная трансплантация МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки
- Трансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство на модели' лазерного повреждения сетчатки
Введение к работе
Патология сетчатки занимает одно из первых мест в мире как причина слабовидения, и слепоты. Это относится к таким заболеваниям как посттравматические и воспалительные изменения сетчатки, поражение глазного дна при гипертонической болезни, тромбоз вен сетчатки, центральная инволюционная хориоретинальная дистрофия, диабетическая ретинопатия, наследственные заболевания сетчатки.
Несмотря на постоянные поиски и усовершенствование медикаментозной терапии, появления лазерного и< современных хирургических методов лечения, патология сетчатки остается^ главной причиной» необратимого снижения зрения; в основе которой* лежит снижение обменных и восстановительных процессов, нарушение микроциркуляции, нарушение структурной организации сетчатки.
Ввиду вышесказанного, поиск новых патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний сетчатки является актуальным.
Будущее медицины сегодня напрямую связывают с развитием клеточных технологий, позволяющий не меняя поврежденный орган, "обновлять" его клеточный^ состав. Такое "обновление" структурно-функциональных элементов органа решает те же задачи, что и органная трансплантация: Вместе с тем, эта технология намного расширяет возможности трансплантационного лечения, делая его доступным для широкого круга разных категорий пациентов.
Основой для развития клеточных технологии являются стволовые клетки, способные в зависимости от микроокружения превращаться в клетки разных органов и тканей, одна такая клетка может дать множество функционально активных потомков. В настоящее время в мире активно разрабатываются подходы к наращиванию стволовых клеток, а также интенсивно исследуются возможности их генетической модификации. Список болезней, в борьбе с которыми либо трансплантация стволовых клеток уже успешно проводится, либо применение клеточных технологий планируется в ближайшем будущем,
быстро растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезнщ медикаментозное лечение которых малоэффективно.
Целью трансплантации; стволовых клеток (GK) является: замещение
нефункционирующей или дефектной ткани или клеточной популяции;
стимуляция;собственных стволовыхклетокорганизмаи усиление репаративного
регенерации; адресная- доставка генетических конструкций^ биомолекул; и.
лекарственных средств. В экспериментах показано, что небольшое количеств*
высокоспециализированных клеток может компенсировать функцию
поражённого органа.. Будучи трансплантированными, стволовые: клеткго
способны, приживляться? и; дифференцироваться' в\ зависимости^ от
.микроокружения. Эти; клетки способны, значительно повысить, адаптивные:
возможности, организма за-, счет усиления? процессов физиологического го
репаративного клеточной регенерации [28]. При; соблюдении определенных:
условий' ал л огеннаяг трансплантация? стволовых: клеток; не вызывает иммунных
реакций^ направленных на»; отторжение донорских клеток. Это подразумевает
возможность применения; трансплантационных клеточных- технологий: длят
лечения стволовымго клетками*, без; использования иммуносупрессорнойї
терапии. . "
Представляется1 важной с медицинской точки зрения способность, низкодифференцированных клеток тормозить, а в- некоторых случаях реверсировать развитие грубоволокнистого соединительной ткани. Такое" торможение создает важные дополнительные предпосылки; для эффективного; восполнения клеточных потерь организма новыми функционально-полноценными: клетками [64]. Результатом трансплантации стволовых клеток полученных из; донорскойшезрелой кроветворнойіткани-являетея1, значительное повышение: регенераторных и адаптивных возможностей? организма; Вызываемое этими? клетками; "обновление" организма, по-видимому, может; препятствовать, развитию процессов,, ведущих к. старению [28]. Отсюда, перспективность и целесообразность использования клеточных технологий в
лечении целого ряда заболеваний, обусловленных старением организма. Трансплантация низкодифференцированных стволовых клеток незрелой кроветворной ткани во взрослый, организм может способствовать восстановлению кровотока в ишемизированных органах и тканях. Этот эффект объясняется наличием в этой ткани незрелых предшественников эндотелиальных клеток, способных генерировать рост новых кроветворных сосудов [90]. Предметом исследования и. клинического применения8 является противоопухолевая активность низкодифференцированных кроветворных клеток. Важным компонентом этой активности является способность этих клеток прямо супрессировать опухолевый рост [78,104].
Среди множества, методов и*, направлений, наиболее перспективной для внедрения в* клинику, на наш взгляд, является трансплантация аутологичных (собственных) стволовых/прогениторных клеток пациента, выделенных ИЗ' разных тканей ^органов.
Одним из самых перспективных видов аутологичного материала для' клеточной терапии* и тканевой) инженерии считаются мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (MGITK) и нейрональные стволовые клетки (НСПК), выделенные из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека. Опубликованы работы свидетельствующие, что при определенной подготовке МСПК могут быть успешно трансплантированы RCS. крысам: встраиваясь в сетчатку реципиента, клетки дифференцируются в< зрелые нейроны; выделяя характерные маркеры:, виментин, калбиндин, родопсин, GFAP.
Мультипотентные нейральные стволовые клетки (НСПК) взрослого организма за последние годы были, выделены из разных тканей и органов, однако степень их пластичности в настоящее время активно дискутируется.
В 2001 году Roistein F.J. и соавт. впервые выделили нейральные стволовые клетки из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека, а позже Zhang X. получил аналогичные нейросферы в своей лаборатории.
Отдельную субпопуляцию в обонятельной части слизистой оболочки носа человека образуют так называемые обкладочные нейроэпителиальные клетки (olfactory ensheathing cells - OECs), обладающие свойствами: нейральных стволовых. Имеются так же указания; что клетки базального слоя; «обонятельного эпителия» мыши могут дифференцироваться- ив экстра' -нейрональном направлении [101,118].
Учитывая вышесказанное, мы остановили свой вьіборінаїМЄІЖ костного мозга- и НЄПК обонятельной- области носа, ввиду их пластичности? и малоинвазивного способа их получения иЗ'ВЗрослого организма;
Цель работы . Изучить, влияние трансплантации мультипотентных; мезенхимальныхг стволовых/прогениторных. клеток костного мозга (МСПК) и нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК),. выделенных из обонятельной областшслизистой оболочки носа взрослого'человека;, на? процессы репарации, регенерации и- сохранность функциональной; активности сетчатки? после: ее; повреждения в эксперименте.
Задачи:
1. Определить способы и дозы введения клеточных культур с
последующей оценкой безопасности трансплантации; ЄК вглаза кроликов.
2. Изучить воздействие МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки
у кроликов с; помощью клинических, электрофизиологических И; :
гистологических методов исследования.
3. Определить: эффективность трансплантации НСПК на моделях
лазерного повреждения сетчатки и ретинальнои ишемии у кроликов с
использованием/, клинических, электрофизиологических и гистологических;
методов исследования-
4: Провести анализ полученных результатов, с оценкой перспективности ; внедрения в клиническую офтальмологию.
Научная новизна:: .
1. Определены безопасные и наиболее эффективные дозы и способы
введения нейрональных СК, выделенных из обонятельной области слизистой
носа', и культивированных мезенхимальных СК, выделенных, из костного мозга.
2. На фоне лазеркоагуляции сетчатки супрахориоидальная;трансплантация?
МСИК и НСПК ведет к статистически достоверному уменьшению, размера
очагов лазерного поражения сетчатки, а также суммарного (среднего) размера
зон первичного лазерного поражения." Меньшая; площадь повреждения в
опытных глазах при одинаковых условиях лазеркоагуляции* доказывает, что
супрахориоидальная трансплантация: СК, стимулируетпрепаративные процессы
в сетчатке: и защищает ееот развития вторичных дистрофических изменений.
При моделировании.. . очагового повреждения4 сетчатки лазерной коагуляцией характерна большая выраженность угнетения; функции фоторецепторові чем пострецёпторных нейронов. Динамика 3PF на стимулы различной интенсивности свидетельствует,.что этот факт может быть связан с нарушением кинетики регенерации зрительных' пигментов, которое выражено значительно в меньшей степени при супрахориоидальном введении МСПК.
Сравнительный анализ результатов исследований показал схожие закономерности в развитии влияния на электрогенез сетчатки супрахориоидальной трансплантации СК различного происхождения -мезенхимальных и обкладочных,: которые состоят в защите функции и структуры нейронов сетчатки - нейропротекторном эффекте - в ранний период развития ретинальной патологии и в ускорении процесса восстановления ретинальной функции в отдаленном периоде наблюдения.
На ранних сроках после моделирования лазерного повреждения* нейропротекторный эффект при трансплантации МСПК наиболее выражен для/ функции фоторецепторов,, а при введении HGHK - не только для-функциональной активности фоторецепторов, но и клеток Мюллера.
Практическая значимость:
1. Показано, что для- повышения репаративной и функциональной,
активности сетчатки при ее патологии различного генеза целесообразно
применение культивированных нейрональных СК, выделенных из
обонятельной области слизистой^ носа и культивированных мезенхимальных
СК, выделенных из костного мозга.
Установлено, что оптимальным методом трансплантации СК является их введение в супрахориоидальное пространство в количестве 500 тыс. в 0,02 мл физиологического раствора.
Использование МСПК и,НСПК может служить основой для разработки новых перспективных стратегий в офтальмотравматологии, и целесообразно t дальнейшее изучение их возможностей в качестве средств неиропротекции ИЛИ' альтернативных терапевтических приемов при лечении последствий заболеваний сетчатки.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Оптимальным методом трансплантации культивированных нейрональных СК, выделенных из обонятельной области слизистой носа (НСПК) и культивированных мезенхимальных СК, выделенных из костного мозга (МСПК), является их введение в супрахориоидальное пространство в количестве 500 тыс. в 0,02 мл физиологического раствора.
2. Супрахориоидальная трансплантация СК стимулирует репаративные
процессы в сетчатке и защищает ее от развития вторичных дистрофических
изменений при лазерном повреждении, что выражается меньшей площадью
повреждения и- меньшей степенью нарушения электрогенеза сетчатки по
сравнению с контрольной группой.
3. В результате комплексных электроретинографических и
гистологических исследований установлено, что супрахориоидальное введение
НСПК и МСПК в указанных дозах оказывает нейропротекторное воздействие,
наиболее выраженное для функции фоторецепторов и клеток Мюллера в
ранние сроки после моделирования лазерного повреждения: сетчатки кроликов или ретинальной: ишемии. На отдаленных сроках: трансплантация: стволовых/прогениторных. клеток способствует ускорению, процесса восстановления- функции сетчатки.. Большая стелены возрастания амплитуды ЭРГ и РЭРГ коррелирует с данными гистологических исследований
Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены и обсужденье на научно- практических конференциях: «Федоровские чтения» (Москва, 2007 и 2008), VIK симпозиуме международного общества; по глазной травме, (Рим, Италия; 2006); II Всероссийской научной конференции-, молодых ученых (Москва,, 2007);. объединенном конгрессе SOE/AAO (Вена, Австрия; 2007); в> Британском посольстве на. конференции: «Стволовые: клетки: законодательство, исследования; и- инновации. Международные перспективы- сотрудничества»;. 2007, наУченом СоветеМНИИїЕБ; май 2007, VIII симпозиуме международного^ : общества по глазной травме (Вёрсбург,.Германия; 20Q8)i.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 в. центральною печати и 4 в зарубежной литературе. Получено положительное решение ог выдаче патента на изобретение от 01.04109: по заявке №2008121546/14 (приоритет от 29.05.08). Изобретение отобрано в число- «100' лучших, изобретении России».
Структура и объем диссертации.
Работа5 изложена на 125 страницах машинописи, иллюстрирована 47 рисунками, 4 таблицами. Список литературы включает 121 источника, из них^ 40> отечественных да 81 иностранных. Диссертация» состоит из введения семи? глав; включая обзор литературы, материалы? и;методы, заключение; выводов*ш практическихрекомендации.
Работа выполнена на базе Московского научно-исследовательского института' глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий (директор -
доктор мед. наук, профессор В.В. Нероев) в отделе травматологии, реконструктивной, пластической хирургии и глазного протезирования (руководитель отдела - доктор мед. наук, профессор Р.А. Гундорова), а также в лаборатории клинической физиологии зрения им. СВ. Кравкова. Гистологические исследования проводились на базе Институт биологии гена РАН, Москва.
;; ' .; із
Современные методы лечения заболевания сетчатки
Полагают, что задержка регресса клинических проявлений повреждения сетчатки связана; с крайне низким восстановительным потенциалом нервной ткани, а также; с тем, что нейрогенез, т.е. формирование нервных клеток, уже-завершается к моменту рождения; после которого новые клетки не образуются [32]. До конца 80-х годов торможение восстановительных, процессов при повреждении связывали с глиальным рубцом. Позднее, с совершенствованием техники исследования в данной области, ингибицию регенеративных процессов; стали: объяснять ранним развитием; в зоне повреждения дисбаланса тканевых пептидов - дефицитом белковых ростостимулирующих нейротрофических факторов и; опережающим, появлением белков- - ингибиторов ростам. В результате сочетанного воздействия факторов деструкции; и, дегенерации зона . травмы сетчатки; последовательно проходит через несколько этапов формирования необратимого структурного повреждения В! современной офтальмологии существуют несколько направлений в лечении патологии сетчатки. Разработаны комплексные методы лечения, включающие в себя медикаментозные, лазерные, ультразвуковые, электро и, магнитостимуляции. Консервативные методы лечения по-прежнему обладают рядом преимуществ, поскольку не приводят к прямому повреждению сетчатки; доступны большому числу больных, имеют более широкие показания к использованию. Патогенетически направленным в лечении, дистрофий различного генеза, посттравматических изменений, поражений; сетчатки при общих заболеваниях является применение препаратов, обладающих наряду с улучшением метаболизма тканей сетчатки антигипоксантным, антиагрегантным свойствами и антиоксидантной активностью, которые приводят к регуляции свободнорадикальных процессов в сетчатке. Среди них обоснованным является применение препаратов из группы антиоксидантов, таких, как аскорбиновая кислота, витамины А и Е, аевит, триовит, эмоксипин, микроэлементы, в частности цинк, альфа-токоферол, бета-каротин [20]. В большей . степени улучшает зрительные функции и биохимические показатели комбинация неоселена и альфа-токоферола, бета-каротина, которые, расщепляясь, образуют ретиноидные соединения, участвующие в процессе зрения. Антиоксидантное действие- оказывает парааминобензойная кислота путем патологического повышения уровня продуктов перекисного окисления липидов и восстановления активности каталазы в сетчатке. Эффективность инстилляции 1% раствора эмоксипина, вероятно, обусловлена его амфифильностью, связанной с наличием пиридинового кольца, метилового и этилового радикалов, а- также гидроксигруппы [21]. Выраженное ретинопротекторное свойство выявлено у антиоксиданта Гистохром. При физико-химических исследованиях действующего- вещества»эхинохрома обнаружено его свойство исполнять роль "перехватчика" свободных радикалов и нейтрализовать основные инициаторы неферментативного процесса перекисного окисления, липидов, накапливающихся в зоне ишемического повреждения ткани. Эхинохром способствует устранению повреждений кальций транспортирующей системы тканей на уровне внутриклеточных структур саркоплазматического ретикулума, уменьшению выхода креатинкиназы и предотвращению накопления в тканях токсических пероксидов [27]. При дегенеративных заболеваниях сетчатки все шире применяются лекарственные средства, получаемые из растительного сырья. Препараты черники содержат различные биофлавоноиды и антоцианозиды, витамины, органические кислоты, и другие биологически активные вещества, оказывающие противовоспалительное и антиоксидантное действия. Основное фармакологическое действие оказывают антоцианозиды, содержащиеся в листьях и ягодах. Они способны ускорять регенерацию светочувствительного пигмента - родопсина, улучшать трофику сетчатки, стимулировать ее микроциркуляцию и восстанавливать тканевые механизмы, защиты сетчатки.; Отмечается? положительный эффект при применении: в лечении склеротических хориоретинальных дистрофий: препаратов, обладающих-гиполипидемическим действием, таких, как эссенциале, витамины:В1, В6; В12, Є, никотиновая кислота, мисклерощ.продектин, диаспонин и др.
Наибольший терапевтический интерес представляют препараты: патогенетического ряда, в частности регуляторные пептидьг (ретиналамин- ис .. кортексин), которые в той,или иной степени способствуют инициации-синтеза: белков и цитокинов! и имеют двойственный механизм действия; Є однош стороны, запуская- синтез № пролиферацию; они: стимулируют внутриклеточное; образование активных форм; кислорода,, а с другой;; - имея, возможность перехватывать радикалы,, могут воздействовать на; процессы межклеточной регуляции; и способствовать восстановлению? и сохранению межклеточных: контактов; Цитомедины и цитогены способны повышать, активность. антиокислительноШ системы крови; ВІТОМ числе ферментов; антиоксид антнош защиты, за счет нейтрализации образующихся в процессе свободнорадикального окисления высокотоксичных гидроксильных ш" пероксильных радикалов; Кортексин представляет комплекс полипептидов;, выделенных из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней. Препарат обладает тропным действием в отношении, коры головного мозга щ регулирует процессы метаболизма нейромедиаторов и перекисного окисления в коре головного мозга зрительном нерве и нейронах сетчатки. Ветиналамин -комплекс пептидов, выделенный из сетчатки крупного рогатого- скота, уменьшает деструктивные изменения в пигментном эпителии, сетчатки, при различных формах дегенерации; модулирует активность клеточных элементов, сетчатки, улучшает эффективность функционального взаимодействия , пигментного эпителия, и наружных сегментов; фоторецепторов? при: развитии патологических процессов. Кроме того; ретиналамин стимулирует фибринолитическую активность крови, обладает выраженным: протекторным
Возможности и перспективы применения клеточных технологий в офтальмологии
Еще: в 20-х годах прошлого века- исследователи предпринималишопыткш трансплантацииіфоторецепторного аппарата (у земноводных). Первая успешная? пересадка сетчатки млекопитающего датируется 1959 годом, когдаг были трансплантированы части: сетчатки.. Будучи; помещенными: в: глазные среды; они.не погибали-сразу, но ише интегрировались-вісетчатку реципиента:[І02]і В$,. дальнейшем реципиентам пересаживали нейробласты - предшественники палочек и колбочек, полученные из: фетального материала; предпринимались попытки осуществлять трансплантации после этапа культивирования im vitro;: трансплантировались фоторецепторы взрослых особей, однако результаты этих исследований были весьма противоречивы и не получили существенного дальнейшего развития [38,55}. Одним из критериев успешной трансплантации является формирование синаптических связей между фоторецепторами и нейронами: реципиента; чего удавалось добиться лишь в: единичных случаях [45-,105]. . . Исследователи : из Британии посчитали, что пересаживать следует не ранние предшественники: палочек и колбочеку а постмитотические: прекурсоры -на .стадии? начала,образования межклеточных синаптических связей: [89]. В-ходе эксперимента выполненного на мышах, страдающих, генетическим дефектом - дегенерацией сетчатки, показано, что пересаженные клетки, полученные от трансгенных (GFP+, CFP+) доноров на сроках от 1 до 15 дня постнатальной жизни способны колонизировать сетчатку в пределах наружного ядерного слоя и дифференцироваться в фоторецепторы. Наибольший успех был, достигнут с применением клеток, полученных от мышат в возрасте 3-5 дней. Реципиентам инъецировали от 300 до 1000 клеток в субретинальный слой. Пересаженные клетки дифференцировались в морфологически идентифицируемые палочки, и даже колбочки. Помимо этого они формировали функционирующие синаптические связи с биполярными клетками, что было доказано возникновением и проведением электрических потенциалов в ответ на освещение и поведением ранее слепых мышей. Вероятность слияния пересаженных клеток с фоторецепторами реципиента была сведена к минимуму посредством пересадки GFP+ клеток CFP+ реципиентам. При; конфокальной микроскопии кофлюоресценция не была обнаружена:ни в одном из наблюдений. Кроме того, ядра пересаженных клеток были маркированы BrdU, что также подтвердило донорское происхождение сформированных фоторецепторных клеток в сетчатке реципиента. Показано, что клетки; полученные от животных в возрасте до 3-х дней клетки еще способны делиться, позже они мигрируют в область наружного ядерного слоя.
Авторы указывают, что установленные на мышах закономерности лишь открывают перспективы для дальнейших исследований в области лечения заболеваний сетчатки у человека. По степени морфо-функциональной зрелости предшественники фоторецепторов 3-5 дня жизни у мышей соответствуют таковым у человека во втором триместре внутриутробной жизни, что делает их малодоступным материалом. Вместе с тем, сотрудники той же исследовательской группы показали, что прогрессивное развитие постмитотических предшественников палочек и колбочек ассоциировано с началом функционирования транскрипционного фактора Nlr. Пересаженные клетки, находящиеся на этой стадии развития характеризовались лучшим приживлением и дифференцировкой в фоторецепторы. Активацию данного фактора наблюдали и в культуре эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК). Вероятно, ЭСК отобранные на стадии активации данного фактора, способньь к прогрессивной дифференцировке в фоторецепторные клетки сетчатки, что, по мнению исследователей, приведет в ближайшее время, к созданию клеточной биотехнологии лечения патологии сетчатки у человека.
Многочисленные экспериментальные работы еще в 80-х годах показали, что успешная трансплантация эмбриональных СК, содержащих в основном один тип клеток - нейробласты, в сетчатку взрослых млекопитающих возможна. Трансплантаты растут и дифференцируются, формируют все клеточные типы и слои нормальной сетчатки. Имплантированная ткань интегрируется с сетчаткой реципиента, и при длительном выживании могут устанавливаться морфологические контакты с первичными зрительными центрами.
По данным D. М. Chacko при» введении СК эмбриональной сетчатки в субретинальное пространство глаз здоровых крыс, трансплантаты, как нейросферы, так и диссоциированные клетки, через 2 недели оказались способными экспрессировать маркер, специфический для фоторецепторов опсин. Важно отметить, что в этом случае, пересаженные клетки1 дифференцировались, находясь в месте введения в субретинальном пространстве, не мигрируя в сетчатку реципиента [53]. Полученные результаты подтверждают мнение о том, что СК способны широко мигрировать и интегрировать в ткани реципиента при наличии повреждения.
В работе А. Нага с соавт. исследовали интеграцию и дифференциацию ЭСК при интравитреальном введении взрослым мышам. Через 30 дней сеть нейроноподобных клеток с аксонами идентифицировалась во внутреннем плексиформном слое. При подсчете донорских клеток с использованием dUTP1 biotin выявлено, что большое количество клеток погибло в течение 5 дней, после трансплантации, пережившие же этот срок клетки, сохраняли дальнейшую жизнеспособность в течение месяца. Takahashi с соавторами в 1998 году доказали, что НСПК полученные из гиппокампа взрослых особей и трансплантированные в стекловидное тело новорожденным и взрослым крысам с механическим повреждением сетчатки, выживали и широко интегрировали в различные структурные слои сетчатки реципиента. Через 4 недели после трансплантации некоторые клетки экспрессировали маркеры, служащие признаком зрелых нейронов (NF-200, МАР-5) [108].
Интравитреальная трансплантация МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки
При исследовании с помощью биомикроскопии, через сутки после лазеркоагуляции и интравитральнои трансплантации МСПК отмечалась умеренная, смешанная, перикорнеальная сосудистая инъекция (рис. 13А), постепенно проходящая к концу 3-го дня. Со стороны переднего отрезка глаза патологических изменений не выявлено. В стекловидном теле просматривались введенные клетки виде взвеси, количество которых увеличивалось в течение 14 дней, что связано с пролиферацией и рассеиванием основной массы введенных клеток осевших на глазном дне в виде конгломерата (рис. 13Б). Через 2-3 недели количество клеток в1 стекловидном теле стало постепенно уменьшаться и к концу месяца встречались только в виде единичных мелких скопления клеток. Офтальмоскопически, через сутки .на глазном дне наблюдалась умеренная сосудистая реакция, локальный воспалительный отек сетчатки на месте коагуляции. Начиная с 3 его дня отек сетчатки стал постепенно уменьшаться. Коагуляты принимали более темную окраску, в связи с пролиферацией пигментных клеток. Пигмент сначала появился по периферии коагулятов, отграничивая их от неповрежденной сетчатки с последующей их полной пигментацией в течение 7 дней (Рис.14). Временная разница в скорости пигментации коагулятов между опытными и контрольными глазами не отмечалась (Рис.15, 16).
У двух животных спустя 2 недели с пролиферацией введенных клеток в стекловидном теле появились пленчатые помутнения с эпиретинальным фиброзом и васкуляризацией пленчатых образовании (Рис.17).
Трансплантация МСПК в супрахориоидальное пространство на модели лазерного повреждения сетчаткиПри исследовании с помощью биомикроскопии, через сутки после лазеркоагуляции отмечалась умеренная сосудистая инъекция конъюнктивы преимущественно в зоне оперативного вмешательства, постепенно проходящая к концу 3 его дня. Разница в степени и характере местного воспалительного процесса между контрольными и опытными глазами не отмечалась. Со стороны переднего отрезка глаза патологические изменения не выявлены, оптические среды сохраняли прозрачность.
При офтальмоскопии на глазном дне со стороны диска зрительного нерва изменений не наблюдались. В течение первых суток отмечалась незначительная сосудистая реакция и локальный отек сетчатки на месте лазерного повреждения, сохраняющийся в течение 3 дней (рис.18). С резорбцией отека сетчатки, коагуляты стали постепенно пигментироваться. К концу 7 ого дня почти все коагуляты пигментировались полностью (рис. 19-20). В течение остального времени наблюдения со стороны переднего отрезка глаза каких-либо признаков воспалительной или аллергической реакции выявлено не было. На глазном дне наблюдалось нарастание интенсивности пигментации лазеркоагулятов, продолжавшиеся в течение 1 месяца. Достоверной разницы в скорости пигментации лазеркоагулятов между контрольными и опытными глазами при офтальмоскопии не отмечалось.
Таким образом, по данным клинико-экспериментальных исследований после интравитреальной трансплантации МСПК у большинства кроликов на всех сроках наблюдения не выявлено каких либо воспалительных изменении. В 2-х случаях после интравитреальной трансплантации МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки (1-ая подгруппа), в стекловидном теле выявлено развитие ПВР с появлением пленчатых помутнения, фиброзом и васкуляризацией пленчатых образовании, что возможно связано с сочетанием высокой пролиферативной и митогенной активности МСПК, массивного повреждающго действия лазера и способа введения. Рис.18. Фотографии глазного дна правого глаза кролика через 2 и 4 суток после лазеркоагуляции и введения МСПК супрахороидалъно.
В подгруппе с супрахориоидальным введением МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки, патологические изменения со стороны переднего и заднего отрезка глаза не наблюдались. Разница в динамике пигментации лазеркоагулятов между контрольными и опытными глазами при офтальмоскопии так же не отмечалось.
Трансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство на модели' лазерного повреждения сетчатки
Через сутки после лазеркоагуляции и; интравитреальной трансплантации НСПК, отмечалась умеренная» смешанная,, перикорнеальнаяг сосудистая-инъекция; постепенно проходящая к концу 3 его дня. Со стороны переднего отрезка глаза патологические изменения? не выявлены., В: стекловидном теле введенные клетки просматривались в, виде; взвеси и единичных, мелких, скоплении округлош формы. Основная Maccas клеток расположилась в нижней части стекловидного тела; К" концу 30-ого дюк С: увеличением; количество скопления, округлой: формы, количество единичных клеток в стекловидном; теле заметно; уменьшилось.
При- офтальмоскопии; со стороны диска, зрительного: нерва? и сосудов сетчатки изменений не наблюдались.. В; течение 10-ти дней-почти все лазеркоагуляты пигментировались, полностью. В контрольных . глазах отмечалась более быстрая и интенсивная пигментация коагулятов в среднем на 4 дня (рис.21 А, Б).
В течение остального времени наблюдения со стороны переднего отрезка: глаза каких-либо признаков, воспалительных или аллергических реакции выявлено не было. На: глазном дне наблюдалось нарастание интенсивности пигментации лазеркоагулятов, продолжавшиеся в течение 1 месяца (рис.21 В Г) Рис.21. А) 5 дней, Б) 1 месяц после лазеркоагуляции и интравитреалъного введения НСПК.
При исследовании с помощью биомикроскопии, через сутки после лазеркоагуляции в зоне оперативного вмешательства отмечалась умеренная сосудистая инъекция конъюнктивы, проходящая к концу 3 его дня. Разница в степени и характере местного воспалительного процесса между контрольными и опытными глазами не отмечалась. Со стороны переднего отрезка глаза патологические изменения не выявлены, оптические среды сохраняли прозрачность.
При офтальмоскопии на глазном дне со стороны диска зрительного нерва изменений не наблюдались. В течение первых суток отмечалась незначительная сосудистая реакция и локальный отек сетчатки на месте лазерного повреждения, сохраняющийся влечение 3 днет С резорбцией отек сетчатки, коагуляты стали постепенно пигментироваться. К концу 7 ого дня почти все коагуляты пигментировались полностью. В течение остального времени каких-либо признаков воспалительной или аллергической реакции выявлено не было. Наблюдалось нарастание интенсивности пигментации лазеркоагулятов в течение 1 месяца. Достоверной разницы в скорости пигментации коагулятов между контрольными и опытными глазами не отмечалось.
Супрахориоидальная трансплантация НСПК на модели острой ишемии сетчатки Офтальмоскопический после лазеркоагуляции сосудов отмечалось резкое І сужение всех сосудов с полной или почти полной остановкой кровотока, сохраняющиеся на протяжении нескольких минут (2-5 мин.), после чего кровоток постепенно восстанавливался, но несмотря на это сосуды оставались резко сужены. На следующий день после коагуляций, на глазном, дне у некоторых кроликов наблюдалась незначительная гиперемия, стушеванность границ диска из-за отека окружающей сетчатки, суженые артерии, местами до полного западения. Кровоток в них стал сегментарным. Отмечалось ампулообразное I расширение вен, застои, отек сетчатки по ходу сосудов (рис. 22 А). На ( периферии патологические изменения не выявлены. За последующие 7 дней наблюдения кровоток в сосудах сетчатки стал постепенно восстанавливаться. Сохранялся неравномерный калибр артерии с участками окклюзии (рис.22 Б). В венах увеличился застой, они стали более і к і 4 і широкими, появились патологическая извитость. В местах лазеркоагуляции, по ходу сосудистого пучка, появились дистрофические хориоретинальные очаги разной величины, мелкие, округлые, соответствующие по размеру диаметру лазер коагулят и большие по площади, появившийся, вследствие острого нарушения кровообращения. На периферии так же обнаруживались участки очагового некроза сетчатки и дистрофические очаги (рис. 23, 24).
Примечательно что, в зависимости от того, как быстро и полноценно восстанавливался кровоток в сосудах, развивались ли коллатерали, степень ишемии в разных глазах была разная. Встречались, как только единичные мелкие, так и множественные и обширные изменения. В опытной группе выявлялось меньшее количество дистрофических очагов сетчатки, чем в контрольных глазах, однако провести количественное их сравнение не представлялось возможным из-за вариабельности размеров и форм очагов.
Фотографии глазного дна кролика: А) через 24ч после лазеркоагуляции сосудов сетчатки. ( Неравномерное сужение артерии и вен, застои, отек сетчатки по ходу сосудов). Б) через 7 дней после моделирования ишемии.
В течение остального времени наблюдения со стороны глазного дна отмечалось постепенное восстановление кровотока в ретинальных сосудах, стали развиваться коллатерали. Просвет сосудов стал боле равномерным на всем протяжении, но восстановления их калибра до исходного уровня не было. В венах сохранялся застойные явления. На сетчатке сохранялись прежние дистрофические очаги.
