Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1 Химический состав костной ткани человека 10
1.1.1 Минеральный состав костной ткани 13
1.1.2. Элементный состав костной ткани 25
1.1.3 Органический состав костной ткани 35
1.2 Этапы и механизмы минерализации костной ткани 40
1.3 Возрастные особенности морфологии и химического состава костных тканей человека 46
1.4 Особенности состава костных тканей и характер их патогенных изменений 49
1.5 Состав и роль внеклеточных биологических жидкостей в процессах образования костной ткани 54
1.5.1 Плазма крови 55
1.5.2 Модельные аналоги внеклеточной жидкости 59'
1.5.3 Синовиальная жидкость 61
1.5.4 Изменение состава биологических жидкостей вследствие коксартроза 64
Глава 2. Методические подходы и методы исследования костных тканей и синтезированных соединений 68
2.1 Условия пробоподготовки костных тканей человека для исследований 68
2.2 Методы и методики изучения состава костных тканей 70
2.2.1 Методика проведения рентгенофазового анализа 70
2.2.2 Методика проведения ИК-спектроскопии 71
2.2.3 Методика проведения ионно-обменной жидкостной хроматографии 73
2.2 Методика экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита 74
2.3 Методы и методики исследования термических и парамагнитных свойств костных тканей 76
2.3.1 Методика проведения термического анализа 76
2.3.2 Методика проведенияэлектронного парамагнитного резонанса 77
2.4 Методы и методики исследования поверхностных свойств костных тканей 79
2.4.1 Методика проведения электронной растровой (сканирующей) микроскопии 79
2.4.2 Методика проведения ИК-микроскопии 79
2.5 Методы и методики исследования элементного состава костных тканей 80
2.5.1 Методика проведения атомно-абсорбционной спектроскопии 80
2.5.2 Методика проведения спектрофотометрического определения фосфора 81
2.5.3 Методика проведения масс-спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) 81
2.6 Методика проведения экспериментального моделирования состава биологических жидкостей в условиях in vitro 82
2.6.1 Моделирование неорганического состава синовиальной жидкости при физиологических значениях рН 83
2.6.2 Изучение химического состава модельных твердых и жидких фаз 84
Глава 3. Результаты химического и физико-химического исследования «нормальных» и измененных костных тканей человека 86
3.1 Химический состав «нормальных» и патогенных костных тканей 86
3.1.1 Химический состав костных тканей по данным РФА 86
3.1.2 Химический состав костных тканей по данным ИК-спектроскопии 87
3.2 Результаты экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита 96
3.3 Состав «нормальных» и пораженных костных тканей по данным термического анализа 99
3.4 Химический состав и парамагнитные свойства костных тканей по данным метода электронного парамагнитного резонанса 105
3.5. Аминокислотное распределение в костных тканях по данным ионно-обменной жидкостной хроматографии 112
3.6 Микроморфология «нормальных» и патогенных костных тканей человека 118
3.7 Элементный состав «нормальных» и патогенных костных тканей по данным спектроскопических методов исследования 121
3.7.1 Особенности атомного соотношения кальция и фосфора в «нормальных» и пораженных костных тканях 121
3.7.2 Содержание макро- и микроэлементов в костных тканях по данным масс-спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) 123
3.8 Химические показатели, характеризующие степень поражения костных тканей и возможность использования неповрежденных участков для трансплантационных целей 126
3.9 Влияние экологического состояния окружающей среды на элементный состав костной ткани человека 127
Глава 4. Фазообразование в биологических жидкостях организма человека и их моделирование в условиях in vitro (на примере синовиальной жидкости) 130
4.1 Теоретические основы моделирования образования минеральных фаз из биологических жидкостей организма человека 130
4.1.1 Описание условий осаждения малорастворимых соединений в модельных системах 130
4.1.2 Основные положения термодинамической модели образования минеральных фаз из синовиальной жидкости человека и расчет критериев их осаждения 132
4.1.3 Результаты термодинамических расчетов закономерностей образования минеральных фаз из синовиальной жидкости человека 135
4.2 Результаты экспериментального моделирования образования минеральных фаз в прототипах синовиальной жидкости человека 139
4.2.1 Результаты анализа твердых фаз, полученных в условиях модельного эксперимента 139
4.2.2 Результаты анализа жидких сред, полученных в условиях модельного эксперимента 140
Выводы 144
Список литературы 146
Приложение 168
- Возрастные особенности морфологии и химического состава костных тканей человека
- Методика экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита
- Методика проведения экспериментального моделирования состава биологических жидкостей в условиях in vitro
- Результаты экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита
Введение к работе
Костная ткань относится к биоминералам, образующимся в организме человека, и физиологически ему необходимым.
В настоящее время изучению костных тканей уделяют большое внимание специалисты разных научных направлений: химии, минералогии, материаловедения и т.п. Обычно исследователи проводят их описание в рамках узкоспециализированных решаемых задач. Химические работы содержат результаты изучения костных тканей в «норме», разработки биосовместимых с костью материалов, минералогические -посвящены рассмотрению древних костных останков, а медицинские - методам диагностики и лечения костных заболеваний. В связи с чем, фактический материал по костной организации часто имеет дискуссионный и поверхностный характер.
Сложность такого рода исследований заключается, в том, что данный биоминерал имеет сложное строение, включает трудноразделимые минеральные и органические компоненты, кристаллическая основа - карбонаттидроксилапатит является плохо окристаллизованной и нестехиометричной. При этом состав и содержание костных составляющих зависит от места отбора костного образца, его половозрастной принадлежности.
Кроме того, костные патологии составляют обширную группу болезней, угнетающих и ограничивающих жизнедеятельность, трудоспособность человека. В Омской области с 1998-2007 гг. их количество составило 17-20 % [242].
Одним из путей решения существующей проблемы является применение целостного подхода, который заключается в изучении определенного типа костных тканей и процессов образования их минеральных фаз при различных состояниях («норма» и отклонение) с привлечением современных высокоточных инструментальных методов, теоретического и экспериментального моделирования.
Полученная информация позволит установить процессы, протекающие в костных тканях, предсказать и контролировать их течение, а также способствовать разработке трансплантатов идентичных костному апатиту.
Цель работы: комплексное исследование химического состава «нормальных» и измененных костных тканей человека, их синтетических аналогов.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: XИзучить химический состав, морфологию, термические и парамагнитные свойства костных тканей человека с помощью методов физико-химического анализа. ^Установить возможные взаимосвязи между составляющими компонентами костных тканей человека при отклонениях от «нормы».
У* Реализовать и верифицировать эксперименты по моделированию неорганического состава, рН, ионной силы синовиальной жидкости человека; идентифицировать состав полученных костных аналогов. ^Предложить химические показатели, характеризующие состояние минеральной компоненты костных тканей человека. >-Выявить половозрастные изменения минеральной и органической составляющей костных тканей человека в возрастном интервале 30-79 лет.
Научная новизна работы. Проведенные исследования расширяют представления о структурной организации костных тканей на ультра- и молекулярном уровнях. Впервые установлено,' что при их поражении уменьшается упорядоченность и кристалличность структуры костного апатита, содержание апатитовой фазы, но при этом увеличивается количество адсорбционной воды, углекислого газа аморфного слоя [С02' пН20], концентраций ионов Cu2+, Sn2+, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Cr3+, парамагнитных термохимических «R-центров» органической компоненты. Показано, что в таких костных тканях занижено содержание ионов кальция и фосфора, наблюдается уменьшение упорядоченности, уплотнение и снижение растворимости коллагена.
В пораженных костных образцах выявлены взаимосвязи между: содержанием фосфат-ионов и карбонат-ионов, адсорбированных углекислого газа, воды; концентрациями ионов кальция и фосфора, ионов натрия и калия, железа и кальция.
Впервые предложена методика экстракционного разделения костных составляющих с сохранной структурой апатита, позволяющая детально исследовать неорганическую и органическую компоненты костных тканей..
В составе костных полостей (кист) установлено преобладание органических веществ, меньшая кристалличность и упорядоченность структуры костного апатита по сравнению с поврежденной костной тканью.
Впервые приведены химические показатели, характеризующие степень поражения костных тканей (кристалличность апатита, Са/Р, Na/K, Fe/Ca коэффициенты). Выявлено отсутствие достоверных половозрастных отличий кристалличности апатита в возрастном интервале 30-59 лет.
С помощью термодинамических расчетов впервые получена последовательность образования малорастворимых соединений из синовиальной жидкости в условиях отклонения от «нормы». На основе её модельных растворов синтезирован слабо окристаллизованный апатит с избытком кальция.
Практическая значимость. Материал, представленный в работе расширяет круг возможностей, позволяющих исследовать разные типы костных тканей при отклонениях от «нормы», и может быть использован в практике специализированных учреждений как Омского (ГГУЗОО Клинический Медико-хирургический центр Министерства здравоохранения Омской области, отделение «Ортопедия №1»; Омская государственная медицинская академия, кафедра патологической анатомии с курсом клинической патологии, кафедра травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии), так и других регионов.
Разработанные химические показатели определения поражения костных тканей могут применяться для отбора костного материала и получения синтетических костных аналогов с целью создания банка трансплантатов.
Предложенная методика разделения костных составляющих с сохранной минеральной структурой используется для решения широкого круга химических и минералогических задач в различных учебных и научных центрах г. Омска, Санкт-Петербурга и Екатеринбурга (ОмГУ, ОмГПУ, ОмГМА, ОмГАУ, СПбГУ и т.д.).
На защиту выносятся следующие положения:
Закономерности минерального, элементного, органического состава костных тканей человека и взаимосвязи между фосфат-ионами и содержанием карбонат-ионов, адсорбированных углекислого газа и воды, а также степенью изменений коллагеновых волокон и количеством органических веществ.
Методика экстракционного разделения минеральной и органической составляющих костного апатита с сохранной структурой.
Результаты теоретического и экспериментального моделирования процессов кристаллизации малорастворимых соединений из синовиальной жидкости.
4. Половозрастные особенности кристалличности костного апатита и аминокислотного состава костных тканей человека в возрастном интервале 30-79 лет. Апробация работы. Основные результаты работы опубликованы в 6 научных статьях (из них 4 — в рецензируемых журналах), 2 статьях и 13 тезисах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и съездов (лично сделано 8 устных докладов): International conference «Functional Materials» (Crimea, 2009); XVII International Conference on Chemical Thermodynamic in Russia (Kazan, 2009); Международном минералогическом семинаре «Минералогическая интервенция в микро- и наномир» (Сыктывкар, 2009); Всероссийской молодежной научной конференции «Минералы: строение, свойства, методы исследования» (Миасс, 2009); Международном минералогическом семинаре «Структура и разнообразие минерального мира» (Сыктывкар, 2008); V Международной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины» (Иваново, 2008); Международной научной конференции «Федоровская сессия 2008» (СПб, 2008); VI Международном Беремжановском съезде по химии и химической технологии (Караганда, 2008); VIII конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной неорганической химии и материаловедения» (Москва; Звенигород, 2008); Всероссийской научно-технической конференции «Россия молодая: передовые технологии в промышленность» (Омск, 2009); VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008); II Международной конференции «Кристаллогенезис и минералогия» (Санкт-Петербург, 2007); III Международном симпозиуме «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень» (СПб, 2007); научном семинаре «Минералогия техногенеза» (Миасс, 2005-2006).
Объем и структура работы. Диссертация представлена на 167 страницах, содержит 60 рисунков, 30 таблиц, список литературы из 254 наименований. Она состоит из введения, 4 глав и заключения.
Во введении показана актуальность исследований и дано краткое представление о работе.
В первой главе на основании обширного литературного анализа рассмотрены основные уровни организации костной ткани; путем сравнительного исследования биоминералов, встречающихся в организме человека, охарактеризованы особенности минеральной костной компоненты; на разной глубине обсуждается характер взаимодействия костных составляющих в процессах образования костного вещества, их изменений с возрастом и при отклонениях от «нормы»; рассматривается состав фазообразующих биожидкостей.
Во второй главе описаны методики, разработанные и усовершенствованные автором.
Третья глава содержит полученные данные по комплексному изучению вещества, свойств, структуры костных тканей с применением химических и инструментальных методов.
В четвертой главе приводятся результаты модельных экспериментов по исследованию физико-химических условий, характера фазообразования, синтезов костных аналогов из прототипов биожидкостей.
В заключение путем обобщения полученного материала приведены основные закономерности изменений костных тканей при повреждении и характер, образующихся в данном случае минеральных фаз, описаны особенности кристалличности апатита и аминокислотного состава в возрастном интервале 30-79 лет.
Исследования поддержаны грантами РФФИ «Научная работа молодых российских ученых в ведущих научных организациях Российской Федерации» в рамках программы «Мобильность молодых ученых» (проект 08-08-90700-моб_ст); «Молодых ученых» ОмГУ (проект № 0120.0 805003); программами УМНИК (проект № 9608); Федеральной целевой научно-технической программой № 202.
Возрастные особенности морфологии и химического состава костных тканей человека
Костная ткань - метаболически активный биоминерал, состав, структура и свойства которого в течение жизни подвергается многообразной перестройке [63-67]. Возрастные изменения затрагивают все уровни структурной организации кости. Одни исследователи при описании данных особенностей ограничиваются возрастными отличиями [45, 71], другие, помимо их считают важным учитывать и половую принадлежность, а также тип анализируемой костной ткани (губчатое или компактное вещество) [7, 63, 68, 70]. Наличие разных подходов в изучении возрастных изменений костной ткани, по нашему мнению, является одной из причин расхождения литературных данных. Возрастные особенности фазового состава минерального матрикса. Минеральный компонент матрикса характеризуется формированием следующих сдвигов. С возрастом увеличиваются размеры копланарных объединений кристаллов, что приводит к вытеснению водной и органической фракции из внеклеточного матрикса [68]. За этим следует тенденция повышения степени минерализации остеонов. Возможной причиной, по мнению У. Ньюман и М. Ньюман, является появление новых кристаллов, вытесняющих органическую матрицу [13]. Ряд исследователей указывают на изменение соотношения аморфной и кристаллической костных фаз. В зрелом возрасте кристаллическая компонента превалирует над аморфной, поскольку последняя обладает наибольшей растворимостью и расходуется в организме отдавая Са2+ в кровь [13]. Возрастные особенности элементного состава минерального матрикса А.Н. Накоскиным [68] исследовано содержание ионов кальция и фосфат-ионов в компактной и губчатой костных тканях. У мужчин отмечено увеличение Л і У содержания Са и РО4 " в губчатой кости, при этом в компактной количество кальция не изменяется, а содержание фосфора максимально в 74 года. У женщин наблюдается другая закономерность: в губчатой костной ткани отличий по содержанию ионов Са+ и РО4" не выявлено, а в компактной максимальное их количество наблюдается в 50 лет (возрастной интервал 36 - 60 лет). При этом содержание минеральных компонентов в костной ткани женщин больше чем у мужчин. Автор объясняет это тем, что у женщин в репродуктивном возрасте формируется запас ионов кальция, который очевидно расходуется на формирование плода и в постменопаузальный период[68]. Другие авторы, напротив, указывают на уменьшение РО43" в костной ткани с возрастом, вследствие их замещения С032 в структуре костного апатита [1, 6, 18, 27,31]. В исследованиях А.Н. Накоскина, S. Tsuboi et al [68, 72] отмечается, что с возрастом и в зависимости от пола, вида костной ткани содержание ионов магния в костной ткани не изменяется.
Напротив, по мнению В.Н. Богатова и др. [73], в процессе её старения происходит увеличение количеств данных ионов. В процессе старения костной ткани происходит также повышение содержания меди, кремния, уменьшение марганца [104]. Возрастные особенности органического матрикса В костях животных различного возраста отмечаются значительные колебания в содержании органических веществ по сравнению с неорганическими. Так, по Радашу (Radasch), процентное содержание органических веществ следующее: у человеческого эмбриона 4 месяце - 63,99%, у новорожденного ребенка - 52,15%, у человека в возрасте 20-60 лет - 12,40%, у взрослого человека в возрасте 61-90 лет- 39,13 -51,30% [7]. А.Н. Накоскиным [68] исследована костная ткань, принадлежащая мужчинам и женщинам возрастного периода 22 - 74 года и более. Установлено, что содержание коллагена определяется половозрастными особенностями. В костной ткани мужчин содержание коллагенновой фазы уменьшается до 74 лет, у женщин происходит её снижение до 55 лет. В компактной костной ткани (25,5±5,0 г/100 г сухой обезжиренной костной ткани) ее количество больше чем в губчатой (21,2±3,0 г/100 г). Отличные данные получены Л.И. Слуцким [7] по возрастным вариациям коллагена. Показано, что его содержание в компактной кости человека при старении увеличивается, достигает максимума к 60 - 74 гг. При этом, как и у А.Н. Накоскина компактная кость (15,2±0,2 г/100) содержит больше коллагена по сравнению с губчатой (19,6±4,6 г/100). Увеличение содержания органических веществ с возрастом также отмечено У. и М. Ньюман [13]. Кроме того, с возрастом в фибриллах коллагена возрастает число поперечных связей (поперечных сшивок), повышается структурная стабильность коллагеновых волокон (прогрессирование процесса «созревания» фибриллярных структур соединительной ткани) (рис. 1.13) [8, 51, 64]. Это приводит к накоплению нерастворимых форм коллагена, а, следовательно, снижению интенсивности его обмена в компактной и губчатой костной ткани [4, 18, 68]. Неколлагеновые органические компоненты матрикса также претерпевает немалые изменения. А.С. Аврунин [8] определил, что возрастом в экстракте костной ткани снижается содержание белка, гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты), сиаловых кислот, органического фосфора и связанных сульфатов.
Также уменьшается масса сухого остатка экстракта и кальций-связывающая способность костной ткани [63]. А.Н. Накоскиным [68] выявлены следующие вариации гликозаминогликанов (уроновых кислот) в костной ткани: у мужчин увеличение до 35 лет, последующее их уменьшение к 60 годам, после чего их содержание достигает прежних значений. У женщин максимум их содержания наблюдается в 35 лет. Содержание глюкозаминокликанов хорошо коррелирует с абсолютным содержанием сульфатов и совпадает приведенными закономерностями. Е.П. Подрушняк, В.П. Каниболоцкая [104] отмечает, что с возрастом увеличивается количество кислых гликозаминогликанов, а нейтральных -уменьшается. С возрастом уменьшается молекулярный вес гиалуроновой кислоты, вследствие чего снижаются смазывающие свойства суставных жидкостей [104]. В работе [68] отмечено, что губчатая вещество мужчин и женщин (от 40 до 50 % от веса сырой ткани) содержит больше липидов по сравнению с компактным (около 15%). Возрастные макро- и микроморфологические особенности костной ткани В процессе старения костной ткани происходит диффузное разрежение компактного вещества в трубчатых костях. Наблюдается истончение и разобщение трабекул [64, 69]. В отдельных участках компактного слоя костей обнаруживаются участки, лишенные костных клеток. Просветы центральных каналов остеонов расширяются. Старение костной ткани проявляется также интенсификацией и рассогласованием процессов костеобразования и резорбции, в результате чего развивается различные костные заболевания (например, остеопороз, артроз) [59, 64, 70]. Следует также отметить, что возрастные сдвиги затрагивают и морфологические структуры: клетки, каналы остеонов и т. п: Анализ литературных данных показал, что возрастные изменения костной ткани происходят на всех уровнях ее организации. В случае возрастных вариаций минеральной и органической костной компоненты, существуют противоречащие друг другу данные. Следовательно, необходимо проводить исследования их содержания в различные возрастные периоды. В дальнейшем это может являться достоверной экспериментально-теоретической базой, важнейшим звеном в изучении костного апатита при различных отклонениях от «нормы».
Методика экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита
Для более детального понимания вклада органических и минеральных групп в полосы поглощения, присутствующих на ИК-спектрах костных тканей, и изучения характера изменений органической компоненты была разработана методика экстракционного разделения ткани органической и неорганической костных составляющих с сохранной структурой костного апатита. Основная задача ее заключается в извлечении различных коллагеновых и неколлагеновых фракций костной ткани экстрагентами-растворителями, которые не оказывают разрушающего воздействия на кристаллическую основу кости. Их разделение осуществлялось с учетом сложного состава коллагена, состоящего из водорастворимой, кислоторастворимой и нерастворимой фракций [4, 66]; Для извлечения водорастворимой фракции коллагена использовали чистые органические растворители: смесь спирта и хлороформа в соотношении: 2:1. Солевая компонента и часть неколлагеновых белков извлекалась с помощью 1% раствора NaCl [4]. Помимо подбора растворителей выбраны условия проведения экстракции (кратность и время). В соответствие с рис. 2.4 сущность методики заключается в том, что сухой костный порошок подвергали последовательному экстракционному концентрированию, для чего его помещали в колбу с притертой пробкой и добавляли раствор экстрагента-смеси хлороформ :этиловый спирт в объемном отношении 2:1 на трое суток. Далее из колб испаряли растворитель, осадок промывали водой и отфильтровывали. Таким образом, извлекали водорастворимую коллагеновую фракцию - фильтрат (анализируемый раствор 1). Костную ткань (сухой остаток) подвергали дальнейшему концентрированию в 0,2 М растворе хлорида натрия в течение 3 суток в однократной повторности. После чего проводились процедуры по испарению экстрагента и получению фильтрата солерастворимой части коллагена (анализируемый раствор 2) и сухого остатка костной ткани. После отделения водного раствора, костный порошок высушивали при 105 С в течение 60-75 мин, который исследовали методами РФА и ИК-спектроскопией.
В полученных фильтратах (раствор 1 и 2) определяли долю водорастворимой и солерастворимой формы белка реактивом Бенедикта (биуретовый реактив для определения микроколичеств белковых соединений) [193, 194] спектрофотометрическим методом. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 (А фф = 330 нм, 1=10 мм). Фоновые растворы готовили аналогично растворам 1 и 2 без внесения пробы костной ткани. Количественное содержание белковых составляющих определяли методом градуировочного графика, используя стандартный раствор альбумина (КлиниТест-ОБ, «Эко Сервис»). Предел обнаружения при определении водорастворимых белковых соединений составляет 30 мкг/мл, относительное стандартное отклонение - 0,03-0,04. Для оценки эффективности экстракции по результатам спектрофотометрического анализа рассчитывалась степень извлечения (R, %). За теоретическое значение принималось содержание общего азота в костной ткани, определенное фотометрическим индофенольным методом по ГОСТу 13496.4 - 93 [195] ( эфф = 665 нм, автоматизированная линия «КОНТИФЛО», датчик цветной реакции 01 - 603, г. Омск, Омский ФГУ центр агрохимической службы). ля уточнения количественного состава минеральной и органической компоненты костных тканей и изучения энергетики процессов их термического разложения использован термический анализ. Термический анализ проведен на дериватографе SII Diamond - TG-DTA фирмы Perkin Elmer (г. Екатеринбург, Институт геологии и геохимии им. академика А.Н. Заварицкого УрО РАН, лаборатория физических и химических методов исследования минерального вещества). Прокаливание костных проб проводили в платиновых тиглях в атмосфере воздуха от 25 до 1000 С, оптимальная скорость нагревания - 20 С/мин (рис. 2.5); масса пробы - 25-30 мг; чувствительность измерения веса - 2" 10" %, погрешность 0,1 %; чувствительность измерения термоэффектов 610"4 В, погрешность ± 6 С, чувствительность измерения веса 10" %. Количественные данные массовых потерь при отжиге получены с помощью программного обеспечения PYRIS 7.0.
По полученным термогравиметрической (ТГ), дифференциально-термической (ДТГ) кривым определялись массовые потери костной ткани при нагревании и состав исследуемых образцов; дифференциально-гравиметрическая кривая (ДТА) служила для характеристики наблюдаемых термических эффектов (изменение энергии, С/мин) [180-182]. Для получения представлений о структурной организации и упорядоченности костной ткани на молекулярном и ионном уровнях использовался метод электронно-парамагнитного резонанса. В рамках исследования проводилось изучение природы и концентрации парамагнитных центров (ІГМЦ), содержащих неспаренные электроны органической и неорганической костных составляющих [197-200]. ЭПР спектры регистрировались на радиоспектрометре ESR70-03 DX/2 (Беларусь), который фиксирует поглощение сверхвысокочастотного (v 10 ГГц) электромагнитного излучения (СВЧ) парамагнитным образцом в поляризующем магнитном поле за счёт квантовых переходов между Зеемановскими уровнями парамагнитных частиц (г. Екатеринбург, Институт геологии и геохимии им. академика А.Н. Заварицкого УрО РАН, лаборатория физических и химических методов исследования минерального вещества). В качестве эталона использовался MgO:Mn2+ с концентрацией парамагнитных центров 8,6 1014 спин и АН = 1 Гс, рабочая частота 9,3 - 9,7 ГГц, ґмод=100кГц. Активация ПМЦ осуществлялась путем варьирования процедур термического и электронного воздействий на костную ткань: (1) облучение пучком электронов в течение 5 мин; (2) последовательный отжиг при температурах 23 - 600 С с интервалом 30 С; (3) отжиг с последующим облучением импульсами электронов высокой плотности (время облучения 5 мин) в температурном диапазоне от 23 до 300 С. Термический отжиг костных проб проводился в электропечи SNOL 6,7/1300, облучение - на ускорители «КлавиР», изготовитель ИЭ УрО РАН.
Методика проведения экспериментального моделирования состава биологических жидкостей в условиях in vitro
Модельный эксперимент проводился с целью изучения процессов образования минеральных фаз костных тканей из прототипов биологических жидкостей в «норме» и при костных отклонениях (на примере, коксартроза) в условиях in vitro. Получение подобной информации в рамках живого организма (in vivo) является затруднительным, что, прежде всего, связано с многофакторным влиянием на костную минерализацию и невозможностью исследования предшествующих кристаллическому апатиту метастабильных неорганических соединений. Закономерности фазообразования в физиологических средах изучены на основе термодинамических расчетов и экспериментально. Описание термодинамической модели образования малорастворимых веществ в гипотетических растворах, соответствующих по своим параметрам (состав, рН, ионная сила, вязкость) таковым организма человека, приведено в разделе п. 4.1.2. Поскольку при повреждении костная ткань соприкасается с суставной синовиальной жидкостью изучение характера образующихся при этом соединений, проводилось путем моделирования состава данного раствора.
На начальном этапе экспериментального моделирования изучалось поведение систем при значениях рН и ионных сил в «норме» 7,40±0,05 и патогенных отклонениях в щелочную сторону 7,60±0,05, 7,80±0,05. Для получения достаточной для проведения химического анализа массы осадка, выбрано пятидесяти кратное пересыщение по ионам Са и РО4 ". Для приготовления модельных растворов использовались соли марки ч.д.а, х.ч. и дистиллированная вода. Соли и их количество подбирались таким образом, чтобы концентрации их ионов в растворе и ионная сила были приближены к заданным моделируемым условиям (табл. 2.2). При этом полученная ионная сила отличалась от исходного значения не более чем на 0,03. Схема эксперимента заключалась в приготовлении растворов, содержащих катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения (рабочий раствор 1 и 2, рис. 2.7). После смешения эквивалентных объемов растворов в мерной колбе на 250 мл для достижения заданных значений концентраций ионов Na+, СГ и ионной силы добавляли определенную массу кристаллического NaCl и доводили дистиллированной водой до метки. Полученный раствор с рН = 7,50 ± 0,05 переливали в коническую колбу с притертой пробкой на 250 мл и проводили корректировку рН до фебуемых физиологических значений рН растворами 20 % NaOH или НС1 (конц.)- Готовые модельные системы закрывали пробками и оставляли для кристаллизации при комнатной температуре на время 30 суток. По истечении заданного времени выдерживания осадки отфильтровывались, просушивались в течение 2-х суток в эксикаторе, далее при 100 С (70 мин). После чего проводилось их взвешивание на аналитических весах и исследование фазового состава с помощью РФА и ИК-спектроскопии (п. 2.1.1 - 2.1.2). Количественное определение катионов и анионов в твердой фазе осуществлялось методом остаточных концентраций по разности начальных и конечных концентраций осадкообразующих ионов в модельном растворе, где анализировалось содержание ионов Са2+, Mg2+ и Р043".
Определение Са и Mg при их совместном присутствии основано на титровании раствора стандартным раствором ЭДТА с двумя индикаторами -эриохромом черным Т и мурексидом. С эриохромом черным Т титруется сумма кальция и магния; затем с мурексидом в щелочной среде - только кальций. Разность объемов, затраченных на титрование смеси с разными индикаторами, соответствует содержанию магния в растворе. Титрование проводят с предварительным отделением фосфатов путем осаждения солями висмута в слабоїсислой среде (РД 52.24.403-2007 [209]). Погрешность определений составляет в пределах 1-2 отн.%. Определение концентрации РО/" основано на реакции восстановления фосфорномолибденового комплекса до соединения, отвечающего предположительно формуле (Мо02-4Мо03)2 НзР04 окрашенного в синий цвет, и фотометрировании раствора на спектрофотометре при Хофф= 690 нм (ГОСТ 18309-72 [210]). Погрешность определений находится в пределах 2-4 отн.%. Статистическая обработка. При статистической обработке результатов исследования оценка точности и надежности числовых характеристик определялась по доверительному интервалу истинного среднего значения М95 = х + t95 mx, где х - среднее арифметическое значение; t95 - табличное значение t-критерия Стьюдента, отвечающее доверительной вероятности 95% по числу степеней свободы/= п — 1; тх - средняя квадратичная ошибка среднего значения [211]. Достоверность полученных результатов подтверждалась с использованием многомерных статистических методов (дискриминантный, кластерный, корелляционные анализы) с помощью программного пакета статистической обработки данных StatSoft Statistica 6.0 [212]. Таким образом, в данной главе показано, что для получения целостной картины о морфологии, химическом составе (минеральном и органическом), свойствах костных тканей необходимым является применение совокупности химических и физико-химических методов исследования.
По данным РФА кристаллическая фаза костной ткани представлена плохоокристаллизованным гидроксилапатитом, основным интенсивным линиям, которого соответствует межплоскостные расстояния d, А: 3.43, 3.08, 2.80, 2.73, 2.27, 1.95, 1.84, 1.74 (рис. 3.1). Малая интенсивность и полуширина дифракционных отражений указывает на его низкую кристалличность. Такая окристаллизованность минерала связана с присутствием аморфной компоненты в виде коллагена, других органических веществ и фосфатов кальция [9]. На дифрактограммах пораженных образцов в сравнении с «нормальной» костной тканью отмечается повышение фоновых сигналов в области 10 - 23 20, а также менее разрешенные и уширенные рефлексы, что свидетельствует об увеличении содержания органических веществ, меньшей окристаллизованности и структурной упорядоченности минеральной основы кости при патологии. Можно предположить, что на степень аморфизации, в данном случае, влияет характер протекающих патогенных процессов. Из рис. 3.1 следует, что наиболее близкой по степени разрешения рефлексов к «норме» является дифрактограмма нижнего среза пораженной костной ткани. Это может указывать на направление развития изменений костного апатита от верхнего среза к нижнему.
Результаты экстракционного разделения составляющих костной ткани с сохранной структурой костного апатита
Проведенный литературный обзор (гл. 1) показал, что костная ткань имеет сложный многокомпонентный состав. Экспериментальные данные, полученные с помощью методов, дающих одновременно информацию о суммарном содержании костных компонент (как минеральной, так и органической) требуют уточнения (например, ИК-спектроскопия). А именно, достаточно сложной задачей является проведение исследований отдельных костных составляющих. С этой целью была разработана методика экстракционного разделения костных минеральных и органических составляющих (п. 2.1.3), которая с одной стороны, позволяет установить природу связей органических и неорганических групп и их вклад в интенсивности полос поглощения колебаний, присутствующих на ИК-спектрах костных образцов. С другой, её использование дает возможность получения дополнительной информации об изменениях отдельных костных фаз. езультаты определения содержания азота пептидных связей в водных растворах органических экстрактов костных тканей контрольных и пораженных проб представлены в табл. 3.3. Доля извлекаемых белковых фракций с помощью данной методики составляет от 40 до 70%. Для поврежденных срезов характерна наименьшая степень извлечения белковой компоненты (R, %), что можно объяснить присутствием меньших количеств экстрагируемых водорастворимых и солерастворимых составляющих. По нашему мнению, это связано либо с меньшим содержанием органических веществ при повреждении или с переходом растворимых белковых компонент в нерастворимые за счет деформации меж- и внутримолекулярных связей коллагеновых волокон, что также согласуется с [4, 5, 8]. На основании чего можно предположить, что для коллагеновых молекул патогенных костных тканей характерна большая степень агрегации. В контрольных пробах содержание солерастворимой фракции и неколлагеновых белков, выделенных с помощью 1% раствора NaCl, достоверно меньше по сравнению с извлеченной смесью хлороформ : спирт водорастворимой компонентой.
Напротив, в патогенных костных тканях отмечается повышение количеств солерастворимой белковой составляющей. Известно, что эта фракция коллагена обладает большой метаболической активностью и является предшественником, образующих каркас костной ткани, других менее растворимых коллагеновых компонент (кислоторастворимой, нерастворимой) [4]. Полученные данные также могут указывать на процессы перестройки коллагена при повреждении, а именно, на переход в менее растворимое состояние, что негативно сказывается на всех этапах костной минерализации и приводит к снижению метаболической активности костной ткани. На ИК-спектрах после поэтапного воздействия используемых растворителей (рис 3.9), отмечается уменьшение полос поглощения колебаний связей органических групп следующих частот: 2950-2800 см"1, 1790-1700 см"1, 1242 -1260 см"1, принадлежащих соответственно v(C-Hn), v(C=0), v(NH). колебаний связей, основной вклад в интенсивности которых принадлежит молекулам и ионам неорганической фазы костной ткани, см"1: 3600-3200 - vOH" в молекулах воды; 1680-1610 - Н-О-Н в Н20; 1590-1500 - С-О в С032\ указывающие на замещение ими в структуре апатита фосфатных тетраэдров по А-механизму; 1480-1410 - С-0 в СОз2" В-типа; 1090-1030 - и3 Р-0 в Р043"; 962-968 - v, Р-0 в Р043 ; 872-879 - v2 С032"; 574-605 - щ О-Р-0 в Р043". Полученные данные подтверждают правильность качественной интерпретации ИК-спектров исследуемых костных тканей. На рентгенограммах (рис. ЗЛО) таких образцов отмечается заметное снижение фоновых сигналов, особенно в области от 10.8 до 16.8 29, принадлежащей аморфной компоненте,прежде всего органической. Кроме того, апатитовые рефлексы более разрешенные, что свидетельствует об улучшение его кристалличности.
В ходе анализа термических данных на всех дериватограммах исследованных костных тканей - изменённых и контрольных выделено четыре температурных диапазона (далее I-IV), соответствующих термопреобразованию разных по своей природе костных составляющих [171, 216, 219] (табл. 3.4), (рис. 3.11). интервал IV, табл. 3.4) происходит преимущественно за счет удаления С02 минеральной костной компоненты при переходе нестехиометричного карбонатгидроксилапатита в стехиометричный и (3-Са3(Р04)2 [171, 216, 219]. Дальнейшее преобразование апатита происходит при температурах 1300-1500 С, что превышает максимальную температуру опыта, и в рамках исследования не рассматривалось. Исследование массовых термических потерь (кривые ТГ и ДТГ) контрольных костных образцов (рис. 3.12, прил. 5) показало, что во всех срезах головки бедренной кости (верхний - средний - нижний) наблюдаются одинаковое уменьшение массы веществ во всем промежутке исследуемых температур. Это указывает на одинаковое распределение веществ во всех трех срезах головки бедренной кости. Напротив, в патогенных пробах согласно математической обработке дериватограмм (прил. 5) и анализу кривых ДТА патогенной костной ткани величина массовых потерь веществ и наблюдаемые при этом энергетические эффекты определяется степенью поражения ткани, что подтверждается результатами дискриминантного анализа. Так, на диаграмме канонических рассеиваний (рис. 3.13) видно, что состав верхнего (более поврежденного) среза отличается по содержанию адсорбированной воды, органических веществ, летучих компонентов от «нормы» и менее поврежденных средних и нижних проб. Следовательно, это согласуется с данными РФА (п. 3.1.1) и ИК-спектроскопии (п. 3.1.2) о направление развития заболевания от верхней пластинки к нижней. Поэтому оценка глубины поражения образцов костной ткани женщин осуществлялась путем сравнения весовых потерь в верхнем и среднем срезах с составом нижней пробы.
