Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр.8
Глава 2. Материалы и методы стр.46
Глава 3. Определение степени нарушений, обратимости и восстановления сперматогенеза при экспериментальном двухстороннем абдоминальном крипторхизме стр.69
Глава 4. Влияние ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками различных видов, на функциональное состояние крипторхированных яичек стр. 81
Глава 5. Осложнения экспериментальной работы стр.98
Заключение стр. 104
Выводы стр.106
Практические рекомендации стр.108
Список используемой литературы стр.110
- Обзор литературы
- Определение степени нарушений, обратимости и восстановления сперматогенеза при экспериментальном двухстороннем абдоминальном крипторхизме
- Влияние ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками различных видов, на функциональное состояние крипторхированных яичек
- Осложнения экспериментальной работы
Введение к работе
Актуальность темы
Во всем мире проблема инфсртнлыюсти имеет не только важное медицинское, но социальное значение. Демоірафические показатели России и многих стран мира свидетельствуют об увеличении частоты ннфертильности у мужчин, достигающей в среднем о г 30 до 50 %. Доля «мужского» фактора бесплодия в общей доле бесплодных браков составляет по некоторым данным от 30 до 40 % (Божсдомов В.А., 2001, Тср-Аванесов Г.В., 2000)
По данным некоторых авторов за последние десятилетия во всем мире отмечается прогрессирующее снижение качества спермы у мужчин, обеспечивающее их фертильность. Так при анализе эякулята в фиксированной мужской популяции с 1973 по 1992 годы содержание сперматозоидов в эякуляте ежегодно снижалось на 2,1 % (Auger J., 1997). За последние полвека отмечалось снижение показателей спермограммы почти в 3 раза (Irvine S, 1996). Частота бесплодия в браке колеблется от 8-29%. По оценке специалистов, в Европе бесплодны около 10% супружеских пар, в США - 8-15%, в России от 8 до 17,5% и в настоящее время нет тенденции к снижению (Кулаков В И., 2005).
На фертильность мужчин оказывают влияние различные социальные и демографические факторы, такие как загрязнение окружающей среды, стрессы, привычные интоксикации и другие (Курило Л.Ф., Гришина Е.М., 2006). Полнэтиологичность мужского бесплодия, сложность развития заболевания, функциональная взаимосвязь мужских гонад со всеми системами и органами, создают большие трудности в разработке адекватных методов лечения сперматогенеза (Тер-Аванесов Г.В., 2000).
В связи с увеличением числа бесплодных браков, на фоне увеличения доли мужского бесплодия, актуальной задачей на сегодняшний день, является разработка новых методов лечения инфертильности у мужчин. В последние годы, появившиеся инновационные методики лечения, такие как нанотехнологии, генная инженерия, терапия стволовыми клетками, и успехи их применения, о которых периодически сообщается в мировой печати, заслуживают пристального внимания и могут рассматриваться в качестве перспективных методов для лечения мужского бесплодия. Имеются попытки применения культур, обогащенных различными видами стволовых клеток (сингенных, аутологичных и.т.д.) дія восстановления фертильности у мужчин, результаты которых часто являются предметом дискуссии и служат предметом дальнейшего изучения (Ogawa Т, et al., 2003, Shinohara Т., 2006).
Сперматогенез это процесс, осуществляющийся у мужчин на протяжении всей жизии. Обусловлен он делениями сперматогенньгх стволовых клеток, имеющих но некоторым данным неограниченный потенциал деления (Russell L.D., 1990). Это предположение
\
4 основано на том, что эти клетки имеют высокий потенциал дифференцировки, самообновления, и быстрого деления.
Эффективность трансплантации, при пересадке культур, обогащенных сперматогенными стволовыми клетками у животных, в различных вариантах по разным данным, колеблется от 18 до 80% (Brinster R.L.,2002; Nikolaos S., 2004).
Большая разница в показателях, полученная при оценке результатов этих исследований, отсутствие стандартных методик выделения, культивирования трансплантации и оценки эффективности результатов обуславливает актуальность создания модели для изучения эффекта трансплантации обогащенными клеточными культурами или препаратами, содержащими стволовые клетки разных видов, а также для оценки возможности восстановления фертильности и безопасности такой процедуры.
На сегодняшний день публикации по этим вопросам единичны. Все вышеперечисленное определяет актуальность темы, как с научной, так и с практической точки зрения.
Цель исследования
Улучшение сперматогенеза у мужчин путем определения влияния ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми клетками различных видов, при экспериментальном крипторхизме.
Задачи исследования
1. Определить степень нарушений, обратимости и восстановления процессов
сперматогенеза на модели абдоминального двухстороннего крипторхизма у
экспериментальных животных.
2. Изучить фертилыюсть экспериментальных животных на фоне сформированного
двухстороннего абдоминального крипторхизма, оценить изменения и возможности
восстановления после его устранения.
3. Оценить особенности клинического эффекта ксенотрансплантации культур,
обогащенных стволовыми клетками различных видов на всех этапах эксперимента.
-
Исследовать воздействие ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками человека, на репродуктивную способность экспериментальных животных.
-
Сформулировать критерии эффективности ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур при лечении инфертильности, обусловленной формированием абдоминального крипторхизма у экспериментальных животных.
5 Научная новизна
Дана комплексная оценка экспериментальному, линейному, управляемому, абдоминальному, двухстороннему крипторхизму, который может быть использован в качестве биологической модели для оценки эффекта новых методов лечения инфертильности в эксперименте, в том числе при ксснотрансплантации культур, обогащенных человеческими фетальними прогениторными и стволовыми клетками различных видов
Доказано что гипогонадизм у крыс развивается вследствие непосредственного поражения тсстикулярной ткани при абдоминальном крипторхизме и характеризуется гипоплазией яичек, повышением уровней гонадотропинов в крови и снижением уровня общего тестостерона
Отмечено восстановление показателя фертильности при ксенотрансплантации культур, обогащенных человеческими фетальными прогениторными и стволовыми клетками разных групп в поздние сроки наблюдения.
Ксенотрансплантаиия культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками у животных приводит к более быстрому и более полноценному восстановлению сперматогенеза и общего тестостерона в сравнении с контрольной группой.
Установлено, что нормальные показатели уровня общего тестостерона у крыс после трансплантации обогащенных клеточных культур обеспечиваются за счет гиперфункции имеющейся стабильной популяции клеток Лейдига, с признаками нормохромии ядер и средним количеством хромафинных зерен. Доказано, что при отсутствии лечения относительная нормализация уровней гонадотропинов и общего тестостерона обеспечивается, за счет количественных показателей гиперплазироватшой популяции клеток Леіідига, находящихся в выраженном функциональном напряжении.
Обосновано, что трансплантация обогащенных клеточных культур усиливает эффективность восстановления герминогенной и сперматогенной функции яичек.
Практическая значимость
Усовершенствована модель экспериментального двухстороннего абдоминального крштгорхизма Изучены особенности повреждения и восстановления сперматогенеза у экспериментальных животных на разных сроках. Установлены сроки восстановления фертильности и синтеза общего тестостерона у животных при экспериментальном крипторхизме. Разработана оптимальная техника тканевой трансплантации под капсулу яичка и доказана се эффективность и безопасность для животных. Проведена оценка эффективности восстановления сперматогенеза при экспериментальном крипторхизме. после
введения обогащенных клеточных культур различных видов. Исключено влияние операционного стресса на фертильность экспериментальных животных.
Основные положения, выносимые на защиту
Ксенотрансплантация обогащенных фетальных клеточных культур является самостоятельным методом оперативного лечения инфертильности и гипергонадотропного гипогонадизма.
Экспериментальная модель двухстороннего абдоминального крипторхизма является удобной для изучения и внедрения новых методов лечения инфертильности и гипергонадотропного гипогонадизма
Перенесенный операционный стресс не оказывает влияния на фертильность экспериментальных животных.
Ксенотрансплантация обогащенных фетальных клеточных культур приводит к восстановлению фертильности у экспериментальных животных, которая выявляется не ранее 72 суток от момента ксенотрансплантации.
После ксенотрансплантации клетки пересаженного материала выживают в отдаленные периоды наблюдения.
Ксенотрансплантация обогащенной культуры клеток фетального яичка оказывает наиболее выраженное воздействие на восстановление показателя фертильности, чем обогащенная мононуклеарная культура клеток костного мозга и культура, обогащенная мезеихимальцыми стволовыми и прогениторными клетками.
В группах животных перенесших трансплантацию обогащенных клеточных культур происходит снижение индекса сперматогенеза, что говорит об активном увеличении форменных элементов сперматогенеза по отношению к общему количеству клеток Сертоли.
Ксенотрансплантация культур, обогащенных стволовыми и прогениторными, фетальными человеческими клетками различных видов не приводит к образованию в семенниках реципиента донорских сперматозоидов, а стимулирует собственный сперматогенез у экспериментальных животных. Это обеспечивает генетическую межвидовую безопасность метода
Связь с планом НИР ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий»
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ (НИР) ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», а также с планами НИР Проблемной комиссии №24 00 Межведомственного Научного Совета по «Уронефрологии» РАМН и
7 Минисіерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации - № государственной регистрации 0120.0 807031.
Внелрсіше в практику
Результаты исследования могут служить основой для лечения пациентов с бесплодием эндокринного, иммунологического и посггравмагического гепеза, а таюке у пациентов с абдоминальным крипторхизмом. Полученные результаты исследования направлены на рецензию в НИИ биологии гена РАН, Институт биологии развития имени Н.К.Кольцова РАН, ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова, НИИ прикладной механики РАН. Получены положительные отзывы на представленную работу.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на:
-
Координационном совете ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий» (г. Москва, 15 января 2008г.);
-
Симпозиуме: «Высокотехнологичная помощь в урологии: проблемы и перспективы внедрения», (г. Москва, 26 сентября 2007 г);
-
XI Съезде Российского общества урологов (6-8 ноября 2007 г.);
-
Четвертом Российском конгрессе «Мужское здоровье» (г. Москва, 12-14 ноября 2008г.);
-
Международном медицинском форуме «Индустрия здоровья» (Крокус - Сити, 14-18 апреля 2008 г);
-
Московском обществе урологов (г. Москва, 25 декабря 2007 г);
-
Втором Съезде «Репродуктивное здоровье семьи», 22 января 2008 г;
-
Российско-кубинском форуме «Стратегические вопросы репродуктивного здоровья» (г.Гавана, Куба 1-11 апреля 2008 г);
-
Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», г.Москва, 21 февраля 2008 г.
Публикации По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в которых отражены основные положения диссертационной работы, из них 2 в рецензируемых изданиях ВАК РФ.
Объем и структура работы
Обзор литературы
Большинство клеток человеческого организма имеют узкую специализацию, которая при дифференцировке определяет специфические функции органов и тканей. В организме человека таких клеток более 350 видов. В процессе эмбриогенеза, особенно на ранних стадиях, клетки организма еще не имеют узкой специализации, но способны к дифференцировке и способны быть родоначальниками различных видов клеток. Такие клетки называются стволовыми. Эти клетки являются универсальным строительным материалом, из которого при соответствующем функциональном и анатомическом окружении, при протекании специфических биохимических реакций, дифференцируются любые клетки нашего организма (Лищук В.А., Мосткова Е.В., 2003).
Стволовые клетки — это отдельные клетки или группа клеток-предшественников, обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке в специализированные ткани.
Эти клетки оказались перспективными для решения не только многих фундаментальных вопросов биологии и генетики развития, но и в практической биотехнологии, генной терапии, трансплантологии, гематологии, ветеринарии, фармакотоксикологии, при тестировании лекарств и в других областях. Если эмбриональные стволовые клетки выращивать в культуре, in vitro, то из них возникают обычные стволовые (недифференцированные и самообновляющиеся) клетки, которые способны трансформироваться в разные типы клеток и тканей (кроветворные, половые, мышечные, нервные) и длительное время сохраняться с помощью криоконсервации (Курило Л.Ф.,2000).
Отношение к проблеме изучения стволовых клеток во всем мире неоднозначное. Общественное мнение стран мира часто расходится по отношению к работам в области клеточных трансплантаций с точки зрения этических факторов, как для экспериментального, так и для их клинического использования. Например, в Великобритании, Канаде и Австралии, разработана система законодательных актов, регулирующая и контролирующая исследования с эмбрионами и эмбриональными тканями. В США они проводятся только в частных фирмах, так как конгресс запрещает использовать для этой цели федеральные средства. В ряде стран разрешаются исследования лишь на тех эмбрионах человека, которые не востребованы после экстракорпорального оплодотворения, а также получение стволовых клеток только от криоконсервированных или переданных их "владельцами" эмбрионов человека при соблюдении соответствующих правил (Сухих Г.Т., 1998).
Руководства и принципы исследований на эмбрионах человека детально обсуждаются группой по этике в науке и новых технологиях при Европейской комиссии, а также рабочими группами Руководящего комитета по биоэтике в Совете Европы. Эти группы разрабатывают дополнительные протоколы к Конвенции о правах человека и биомедицине (Курило Л.Ф.,2000).
В России, работы со стволовыми клетками регулируются "Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан", Временной инструкцией о порядке исследований в области клеточных технологий и их использовании в учреждениях здравоохранения, разработанной Экспертным Советом Минздрава России 18.04.2002 г, законом Российской Федерации "О трансплантации органов и (или) тканей человека" (1992г), а также Приказом Минздрава РФ от 25 июля 2003 г. N 325 "О развитии клеточных технологий в Российской Федерации" (Курило Л.Ф.,2000; ВИ, 18.04.2002).
В 2002 г принята отраслевая программа «Новые клеточные технологии - медицине», рассчитанная на 8 лет, целью которой является разработка и широкое внедрение в России наукоемких и эффективных биомедицинских технологий, основанных на фундаментальных и прикладных исследованиях стволовых клеток и создания необходимой для этого инфраструктуры (Ярыгин В.Н.,2002).
В исследовательских целях разрешено использование эмбрионального материала человека с момента оплодотворения до 8-й недели включительно. При использовании абортивного фетального материала должны соблюдаться условия контроля возраста плодов; а стволовые клетки- должны извлекаться из неповрежденных зародышей. Использование в исследовательских целях жидкостей, оболочек, пуповинных и плацентарных тканей і после рождения, ребенка, а впоследствии применение выделенных клеток в терапевтической практике разрешено, при условии оформления письменного разрешения законодательных органов здравоохранения Российской Федерации. Работа с донорским материалом должна проводиться по правилам принятым при переливании крови и ее компонентов (Временная Инструкция, 18.04.2002).
В литературе используются две классификации стволовых клеток, имеющие основой деление по источнику происхоокдения клеток и по способности к их направленной дифференцировке.
По источнику происхождения клеток различают эмбриональные, фетальные, клетки костного мозга, клетки пуповинной крови, стволовые клетки тканей взрослого организма и так далее. По способности к дифференцировке различают тотипотентные, образующие клетки любых типов, плюрипотентпые, образующие клетки многих типов, но не всех, мультипотентные, образующие клетки, нескольких типов и унипотентпые - образующие только один тип клеток (Курило Л.Ф.,2000).
Термин «стволовая клетка» введен в биологию русским гистологом А.А.Максимовым в 1908 г, при исследовании процессов кроветворения. Он высказал гипотезу о существовании недифференцированных клеток, сохраняющихся в организме пожизненно, которые могли превращаться в лимфоциты и другие специализированные клетки соединительной ткани и крови. Клетки были названы по аналогии со строением дерева, то есть ветками, растущими от одного ствола. Тогда в практической медицине широко использовалось направление, ставящее целью омоложение человеческого организма. Литературный герой. М.Булгакова профессор Ф.Ф.Преображенский с этой целью пересаживал «яичники обезьяны», а апофеозом романа явилась пересадка животному человеческого гипофиза. Следует отметить, что подобная практика действительно применялась рядом клиник в 20-30-х годах прошлого столетия. В частности, русский хирург С.Воронцов в Париже, с целью омоложения пересаживал пациентам половые железы обезьян. Отмечено было выраженное омолаживающее действие от подобных вмешательств, с кратковременным эффектом, в течение нескольких недель. Каждая последующая операция давала менее выраженный эффект и в итоге наступало скорое старение пациента. В 1997 г журнал «Тайм» поместил об этом специальную статью (Сухих Г.Т., 1998). В СССР академик В.Ф.Филатов с 1933 по 1969 г успешно разрабатывал методы получения тканевых препаратов для стимуляции биосинтетических и обменных процессов и активации репараций в клетках стареющего организма (Филатов В.Ф.,1978). В 1931 г Пауль Ниханс, в Швейцарии, опубликовал ряд работ и основал клинику, занимающуюся трансплантациями тканей содержащих живые клетки. Использовалась пересадка паращитовидных желез крупного рогатого скота, как сообщалось с положительным эффектом. Любопытно, что он трактовал результаты трансплантаций, не как эффект воздействия гормонов (или стимулирующего воздействия трансплантированных активных факторов), а как восстановление в организме больного адекватных функций, которые до операции выполняли поврежденные и удаленные при операции клетки. Клиника Ниханса существует в настоящее время, и с 1931 года в ней выполнено боле 50000 операций (Лищук В.А., Мосткова Е.В.,2003; Niehans Р. 1954).
Наиболее активно трансплантация органов и тканей стала развиваться с 50-60-х годах, когда начались работы по лечению пациентов имеющих тяжелые заболевания крови. В середине 50-х E.Thomas сделал пересадку костного мозга, от здоровой сестры близнеца, девочке перенесшей радиационное лечение острой анемии с положительным результатом. В 1961 г была сделана первая пересадка фетальных гематогенных предшественников двум пациентам с апластической анемией. Начиная с 1970 г, стали появляться работы об успешных трансплантациях островков Лангерганса крысам с экспериментальным диабетом (Репин B.C., Сухих Г.Т.,1998). В СССР Фриденштейн А.Я.опубликовал ряд работ посвященных изучению плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, и процессов их дифференцировки, получивших международное признание. В частности он отметил, такое важное свойство мезенхимальньгх стволовых клеток, как способность придерживаться, распространяться и развиваться на статической поверхности (базальная мембрана органов или пластик in vitro). (Friedenstein A.J., 1961,1968)
Определение степени нарушений, обратимости и восстановления сперматогенеза при экспериментальном двухстороннем абдоминальном крипторхизме
На этом этапе изучались особенности течения экспериментального, двухстороннего, абдоминального крипторхизма с исследованием состояния общего тестостерона сыворотки крови, фертильности экспериментальных животных и весовых характеристик удаленных у них яичек и придатков, а также оценкой их гистологического состояния и расчетом индекса сперматогенеза.
Измерения весовых характеристик яичек и придатков экспериментальных животных
Результаты изменений весовых характеристик яичек и придатков яичек представлены на рисунках 3.1 и 3.2.
Изменения весовых характеристик яичек лишь косвенно свидетельствуют о происходящих дегенеративных и атрофических процессах в крипторхированных яичках. Нарастание массы яичек после низведения, может свидетельствовать как об активном восстановлении нормального метаболизма за счет функции сперматогенного эпителия и клеток Лейдига уцелевших канальцев, что подтверждается данными ряда авторов (Симодейко А.А. 1994; Ilio K.Y., 2000), так и о наличии местного отека в исследуемом органе, что более характерно для более тяжелых форм крипторхизма.
Оценка изменений общего тестостерона при экспериментальном двухстороннем абдоминальном крипторхизме
Отмечено, что к моменту низведения крипторхированных яичек в мошонку у животных всех групп в плазме крови отмечалась гипотестостеронемия. Динамика общего тестостерона плазмы крови в исследуемых группах представлена на рисунке 3.3.
Отмечено, что уровень общего тестостерона снижался у животных всех экспериментальных групп, кроме контрольной, ниже определенной нами нормы. В контрольной группе колебания средних цифр общего тестостерона находились в границах популяционной нормы и за их пределы не выходили, что свидетельствует о том, что «хирургический фактор воздействия» ложной операции не влияет на результаты, полученные в работе. После низведения яичек в мошонку у всех крипторхированных животных произошло восстановление общего тестостерона плазмы крови до нормальных популяционных значений. Причем отмечено, что чем короче время воздействия крипторхизма, тем быстрее и эффективнее восстанавливается уровень общего тестостерона в сыворотке крови, а повышение общего тестостерона выше нормы свидетельствует о компенсаторной гиперплазии клеток Лейдига.
Результаты гистологического исследования яичек
У животных с двухнедельным абдоминальным крипторхизмом при исследовании на момент низведения сперматогенез был сохранен до сперматогоний 2 порядка во всех сперматогенных канальцах, причем встречались единичные канальцы, в которых сохранены были только клетки Сертоли. Сперматозоидов выявлено не было. На 14 сутки после низведения в мошонку было отмечено частичное восстановление сперматогенеза, в большинстве канальцев до уровня сперматогонии, а в некоторых канальцах до сперматоцитов 1 порядка. К 28 суткам отмечено восстановление сперматогенеза практически во всех канальцах, причем в некоторых нам встречались правильно сформированные сперматозоиды, расположенные ламинально (Рисунок 3.4).
У животных перенесших воздействие трехнедельного абдоминального крипторхизма по данным гистологии при низведении яичек отмечено, что сперматогенез был резко угнетен, канальцы деформированы, неправильной формы. В отдельных канальцах встречались небольшие локусы с клетками Сертоли. В ламинальных частях отдельных канальцев встречались резко дистрофичные сперматогонии. Многие канальцы были заполнены эозинофильным гомогенным содержимым. На 14 сутки отмечено, что сперматогенез значительно угнетен в большинстве канальцев, а в отдельных канальцах сохранен лишь до уровня сперматогонии 1 порядка. К 28 суткам подавляющее большинство было представлено канальцами с полностью утраченными признаками сперматогенеза. В части канальцев сохранялись только клетки Сертоли. Но, наряду с канальцами, имеющими признаки утраты сперматогенеза, встречались единичные канальцы, в которых сперматогенез осуществлялся до уровня сперматозоидов, что представлено на рисунке 3.5. Нарушения сперматогенеза в придатках яичек не были зафиксированы на всех сроках наблюдения.
У животных подвергнутых четырехнедельному абдоминальному крипторхизму на этапе низведения были выявлены признаки резкой дистрофии семенных канальцев. Признаки сперматогенеза в большинстве из них отсутствовали, они были деформированы, многие в спавшемся состоянии. В просвете отдельных канальцев выявлено гомогенное эозинофильное содержимое. К 14 суткам после устранения повреждающего фактора отмечено отсутствие признаков восстановления сперматогенеза, что представлено на рисунке 3.6.
Большинство канальцев деформировано, многие в спавшемся состоянии. В просвете отдельных канальцев выявлено гомогенное, эозинофильное содержимое. И лишь в единичных канальцах определялись клетки Сертоли. К 28 суткам отмечено полное отсутствие признаков сперматогенеза, деформация запустевание и спадение канальцев, как в яичке, так и в придатке. Отмечена секвестрация, эозинофильного, гомогенного секрета яичек. Часть канальцев была замещена соединительной тканью (рисунок 3.7).
Таким образом, чем выраженнее и продолжительнее неблагоприятное воздействие абдоминального крипторхизма, тем больше угнетаются процессы метаболизма в яичках и тем выше вероятность атрофии. Прогрессирующая атрофия семенного эпителия и очаговое разрастание соединительной ткани в интерстиции указывают на то, что компенсаторные возможности инкреторного аппарата задержанного яичка весьма ограничены. Нелеченный крипторхизм приводит к полному склеротическому перерождению и "стиранию" семенных канальцев, нередко к формированию гистологической картины "одних клеток Сертоли", обуславливая инфертильность. Такую картину мы наблюдали в большинстве семенных канальцев животных с индуцированным 4-х недельным крипторхизмом, при этом отмечалось запустевание семенных канальцев и заполнение их эозинофильным гомогенным содержимым, что свидетельствовало о резком угнетении сперматогенеза, по всей видимости, за счет процессов аутоиммунной природы . и образования антиспермальных антител. После устранения повреждающего воздействия происходило частичное восстановление сперматогенеза во всех группах, наряду с атрофией части семенных канальцев. Связано это, по всей видимости, с неравномерным воздействием на канальцы повреждающих факторов при абдоминальном крипторхизме. Восстановление сперматогенеза и фертильности в данном случае зависит от доли сохранившихся в функциональном отношении семенных канальцев. Чем более продолжителен период воздействия, тем большее количество семенных канальцев подвергается повреждению и атрофии, и их регенераторная способность снижается.
Влияние ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками различных видов, на функциональное состояние крипторхированных яичек
На этом этапе работы для оценки результатов трансплантации различных видов стволовых клеток, нами была выбрана исследованная ранее модель абдоминальной формы двухстороннего крипторхизма. Используемая модель является удобной для создания тяжелых нарушений функций яичек, в том числе эндокринной функции. При этом регенерационные возможности и степень повреждения тканей контролируются временем воздействия. С нашей точки зрения наиболее рационально было использование подобной модели сроком 21 день, так как после него самостоятельного восстановления фертильности у животных не происходит. Регенерационные резервы тестикулярной ткани после трехнедельного воздействия высоки, так как быстро восстанавливают гормонпродуцирующую функцию яичек уже к 14 суткам. Степень гипотрофии яичек по данным гистологического исследования также умеренна по сравнению с яичками животных перенесших абдоминальный крипторхизм в течение 4 недель.
Результаты полученные в эксперименте
Исследование весовых характеристик яичек и придатков яичек
Согласно данным проведенного исследования во всех исследуемых группах после устранения абдоминального двухстороннего крипторхизма была отмечена тенденция к нарастанию массы органа к 14 суткам, которая сохранялась и к 28 контрольным суткам.
Динамика весовых характеристик яичек и придатков представлена на рисунке 4.1.
Исследование уровня гонадотропных гормонов и общего тестостерона плазмы крови
При исследовании состояния гормонального профиля у крыс во всех группах к 3 неделе крипторхизма было выявлено снижение уровня общего тестостерона плазмы крови относительно изначальных цифр. Концентрация гонадотропных гормонов оказалась повышенной. Полученные на данном этапе работы данные оценки изменений уровней общего тестостерона, ЛГ и ФСГ представленные таблице 4.1.
После устранения абдоминального крипторхизма и низведения яичек в мошонку у животных основных групп (А, Б и В) к 14 суткам восстанавливался адекватный уровень общего тестостерона, который стабильно сохранялся на нормальных цифрах к 28 суткам наблюдения. В группе контроля (группа Г) восстановление уровня общего тестостерона шло более медленно, и к 28-м суткам достигло лишь нижней границы нормальных значений в экспериментальной популяции, что представлено на рисунке 4.1. Во всех группах животных, перенесших ксенотрансплантацию обогащенных клеточных культур, уровень гонадотропинов снизился до начальных значений. В группе контроля также произошло снижение уровня гонадотропинов, в частности ЛГ гормональный профиль которого был наиболее показательный.
На фоне клеточной терапии к 14 суткам после низведения яичек, концентрация гонадотропинов снизилась, по всей видимости, за счет действующей по типу «обратной связи» гипертестостеронемии. Сниженные концентрации ФСГ и ЛГ сохранились к 28 суткам. Отмечено, что в группах крыс, перенесших трансплантацию клеточными культурами, восстановление уровня общего тестостерона происходило быстрее, чем в контрольной группе и показатели были более значимыми. Трансплантация костномозговых стволовых и прогениторных клеток (мононуклеарная фракция), а также культура обогащенная мезенхимальными стволовыми и прогениторными клетками, оказала более выраженное воздействие на уровень тестостерона, чем культура специфичных сперматогенных стволовых клеток, что представлено на рисунке 4.2.
Гистологические исследования тканей семенников в экспериментальных группах
В нашем исследовании на момент низведения яичек в мошонку были получены гистологические изменения одинаковые для всех групп экспериментальных животных, сходные с литературными данными, заключавшиеся в резком угнетении сперматогенеза в семенных канальцах, которые были структурно деформированы. В отдельных канальцах встречались лишь небольшие участки с клетками Сертоли. В ламинальных частях отдельных канальцев встречались резко дистрофичные сперматогонии. Многие канальцы были заполнены эозинофильным гомогенным содержимым.
При оценке гистологических изменений в контрольной группе (группа Г) к 14 суткам отмечены признаки выраженной деструкции в 50% канальцев, такие как вакуолизация сперматогенного эпителия с нарушением его рядности, на фоне единичных уцелевших канальцев. К 28 суткам наряду с аналогичными признаками отмечено опустошение большинства семенных канальцев. Состояние тестикулярной ткани в группе Г представлено на рисунке 4.6.
В группе Б животных было выявлено, что на 14 сутки в единичных канальцах было выявлено наличие 2-3 слоев сперматогенного эпителия. В большинстве канальцев были отмечены вакуолизация половых клеток и их слущивание в просвет семенных канальцев, а также наличие гигантских многоядерных клеток. На 28 сутки, в большей части семенных канальцев было выявлено наличие правильного расположения слоев сперматогенного эпителия, что свидетельствует об активизации процессов регенерации.
Тем не менее, в некоторых семенных канальцах было выявлено наличие признаков гибели сперматогенного эпителия. Гистологическая картина представлена на рисунке 4.7.
Похожие результаты были получены при анализе гистологических срезов тестикулярной ткани в группе В. Причем в большинстве канальцев имело место правильное расположение слоев сперматогенного эпителия, с элементами всех стадий сперматогенеза (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды).
В группе А (Рисунок 4.8) на 14 сутки в яичках отмечены изменения, свидетельствующие о частичной регенерации отдельных семенных канальцев, ясно видимых на общем фоне клеточной картины. В целом морфологическая картина яичка характеризовалась выраженной отечностью тканей, с сильной инфильтрацией и кровенаполнением сосудов. В половине канальцев наблюдалась выраженная дистрофия семенных канальцев, сопровождающаяся вакуолизацией сперматогенного эпителия и нарушением его рядности. В отдельных канальцах наблюдались конгломераты клеток сперматогенного эпителия слущеных в просвет канальца. Тем не менее, в некоторых канальцах наблюдалось сохранение 2-3 слоев сперматогеннного эпителия, с выраженной рядностью слоев, что расценивается нами как признаки частичной регенерации. К 28 суткам гистологическая картина в части поврежденных канальцев имела признаки дегенерации, на фоне небольшого отека интерстициальной ткани наблюдались признаки деструкции, такие как вакуолизация половых клеток, наличие гигантских многоядерных клеток и гиперхромных сперматид. Тем не менее, в большинстве канальцев было отмечено правильное расположение слоев сперматогенного эпителия, что свидетельствует о частичной регенерации.
Осложнения экспериментальной работы
Из интраоперационных осложнений, встречавшихся нам, мы отметили 12 случаев (16,21%) разволокнения мышц передней брюшной стенки при осуществлении доступа в брюшную полость при отклонении от белой линии живота. Это осложнение, ведущее к расщеплению волокон мышц с повреждением сосудов, которые осуществляют кровоснабжение, что ведет к возникновению интраоперационного кровотечения, увеличению времени операции и трудностям при зашивании операционной раны. Увеличение времени операции ведет к увеличению расхода эфира на 1 животное и повышению риска передозировки и гибели животного. Кроме того, послеоперационный рубец в таком случае формируется более грубый и при осуществлении повторного доступа возможно возникновение сложностей технического плана.
Интраперационное кровотечение при орхфуникулоэктомии наблюдалось у нас в 3-х случаях (4,05%) на начальных этапах работы. При накладывании на «сосудистую ножку» яичка гемостатической лигатуры с прошиванием окружающей клетчатки осложнение было устранено и не встречалось при дальнейшей работе. Имеющийся 1 случай гематомы мошонки, объемом не менее 20 см3 связан, по всей видимости, со слетевшей с культи тестикулярной артерии лигатурой в отдаленном послеоперационном периоде. Установить точный источник кровотечения не удалось, так как животное вскоре. погибло.
У одного животного были отмечены множественные нагноившиеся гематомы по ходу операционного рубца. В данном случае, по всей видимости, имело место наличие заболевания свертывающей системы крови у животного, так как после ревизии этих абсцессов формировались новые гематомы и через 2-3 суток нагнаивались. Животное было из эксперимента исключено.
Наличие послеоперационных спаек не является грубым после операционным осложнением. Спайки образуются либо при осуществлении грубого доступа, либо при попадании в операционную рану остатков шерсти с поверхности кожи, полное удаление которой не представляется возможным. Осложнение незначительно увеличивает продолжительность операции. Наблюдалось приблизительно в 9,45 % случаев.
Формирование эластичных спаек, вследствие низкой степени коллагенизации соединительной ткани у животного является неприятным осложнением, так как такие спайки не выполняют роли фиксирующего элемента и не препятствуют миграции яичка в мошонку. При этом нарушается равномерность воздействия повреждающих факторов, и как следствие, линейная управляемость процессом планомерного воздействия и предсказать конечный результат и дать ему оценку становится невозможным. Такое осложнение встречалось нам на начальных стадиях эксперимента у 3-х животных и связано оно с индивидуальными особенностями организма. Эту проблему нам удалось снять, путем захватывания вместе с уздечкой яичка окружающей жировой клетчатки. Спайка в таком случае образуется более грубой и препятствует миграции яичка в мошонку.
Самое грозное осложнение, ведущее к гибели животного на операционном столе, является передозировка эфирного наркоза. На этапе изучения биологической модели, 3 животных (4,05%) были выведены из эксперимента ранее установленных сроков именно по этой причине. Реанимационные мероприятия в данной ситуации редко бывают успешными. Осложнения можно избежать при тщательном контроле проведения медикаментозного сна во время операции.
Таким образом, на этапе изучения биологической модели двухстороннего крипторхизма было выявлено 40,5% осложнений, из которых тяжелыми явились передозировка эфирного наркоза и различного вида кровотечения, составившие по совокупности 8,1%. Остальные осложнения, не представляют угрозы для жизни животного, и не влияют на чистоту эксперимента. Отсутствие инфекционных осложнений, за исключением 2 случаев нагноившихся подкожных гематом, у экспериментальных животных свидетельствует о хорошей переносимости операций и высокой реактивности местного и общего иммунитета у крыс.
Из интраоперационных осложнений, встречавшихся нам, мы отметили 10 случаев (7,35%) разволокнения мышц передней брюшной стенки при осуществлении доступа в брюшную полость при отклонении от белой линии живота. По сравнению с предыдущим этапом работы отмечено уменьшение количеств этих осложнений с 16,21% до 7,35%, что говорит об улучшении операционной техники.
Интраперационное кровотечение при орхфуникулоэктомии наблюдалось у двух крыс (1,47%) в процессе работы и объяснялось прорезыванием лигатур. Оба осложнения купированы консервативно «Х»-образным прошиванием кровоточащей зоны.
Наличие послеоперационных спаек отмечено в 8,08 % случаев, что свидетельствует о повышении качества проводимых операций (на предыдущем этапе — 9,45%).
Передозировка эфирного наркоза возникла у 2 животных (1,47%), из-за технических ошибок.
Таким образом, на этапе изучения биологической модели двухстороннего крипторхизма было выявлено 19,1% осложнений, из которых тяжелыми явились передозировка эфирного наркоза и различного вида кровотечения, составившие по совокупности 2,94 %. Остальные осложнения, не представляют угрозы для жизни животного, и не влияют на чистоту эксперимента.
Инфекционных осложнений зафиксировано не было.
Так как иммунологические конфликты в нашей работе не учитывались из-за несовершенства антигенной системы трансплантируемого материала, возможные реакции иммунологической защиты у реципиента мы не учитывали. Тем не менее, следует отметить, что наличие хорошего клинического эффекта у животных исследуемых групп свидетельствует о том, что возможные иммунологические реакции были минимальны.
