Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Биологические функции, метаболизм и транспорт аминокислот 13
1.2. Роль аминокислот в регуляции пролиферации и апоптоза клеток семенников 29
1.2.1. Механизмы апоптоза 30
1.2.2. Влияние аминокислот на пролиферацию и апоптоз 32
1.3. Возрастные изменения семенников и метаболизма аминокислот
1.3.1. Теории старения 35
1.3.2. Возрастные изменения семенников 37
1.3.3. Возрастные изменения метаболизма аминокислот 38
Глава 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Органотипическое культивирование тканей 42
2.2. Подготовительные операции для культивирования тканей 43
2.2.1. Состав питательной среды 43
2.2.2. Приготовление растворов тестируемых веществ 43
2.2.3. Получение коллагена и коллагеновой подложки 56
2.3 Процедура культивирования тканей 57
2.4 Морфометрический метод исследования эксплантатов 57
2.5. Иммуногистохимические методы исследования эксплантатов 59
2.5 Л. Методика иммуногистохимического исследования 59
2.5.2. Морфометрическая обработка экспериментальных данных 61
2.6. Статистическая обработка экспериментальных данных 62
Глава 3. Результаты исследования 64
3.1. Скрининг кодируемых аминокислот в органотипической культуре семенников крыс разного возраста 64
3.2. Влияние аминокислот на экспрессию белка р53 72
3.3. Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных L-амиокислот 74
3.4. Изучение эффектов структурных аналогов L-изолейцина 78
3.5 Изучение эффектов метаболитов L-аргинина 80
3.6. Исследование путей реализации эффектов оксида азота 84
3.7. Изучение эффектов смеси, состоящей из наиболее активных аминокислот и их метаболитов 88
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 98
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список литературы
- Роль аминокислот в регуляции пролиферации и апоптоза клеток семенников
- Подготовительные операции для культивирования тканей
- Иммуногистохимические методы исследования эксплантатов
- Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных L-амиокислот
Введение к работе
Актуальность исследования. Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости последнее время становится всё более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых страш [Ани-симов В.Н., 2003]. Старение населения в экономически развитых странах ассоциировано'с существенным увеличением частоты поздних браков. Одним из негативных медицинских последствий позднего брака является бесплодие. По данным ВОЗ 16% семейных пар в мире живут с диагнозом "бесплодие" [Овсянникова Т.В. и соавт., 1998]. При этом мужское бесплодие составляет 50% в структуре общего бесплодия. Кроме того, в последнее время опубликовано несколько крупных исследований, свидетельствующих о стойком прогрессирующем снижении' показателей сперматогенеза у здоровых мужчин [БыковВ.Л., 1999]. При обследовании доноров спермы Великобритании установлено, что основные показатели сперматогенеза (концентрация сперматозоидов и процент прогрессивно подвижных форм) уменьшаются со скоростью 2% в год [Ivrine S. et al., 1996]. Механизм описанных нарушений до конца не ясен. В последнее время всё большее количество исследований посвящается изучению изменений ткани семенников при старе-нии? но-большинство-экспериментальных работ-направлено на определение функциональных изменений яичек как основного поставщика тестостерона. Сложность изучения возрастных изменений семенников состоит в том, что несмотря на выраженные дегенеративные изменения, семенники даже при старении остаются интенсивно пролиферирующим органом, продолжающим выполнять функции стероидогенеза и гаметогенеза [Eshre С, 2005]. Таким образом, актуальность разработки методов лечения мужского бесплодия при старении организма не вызывает сомнений.
Необходимо отметить, что мужское бесплодие секреторной этиологии представляет собой неоднородную полиэтиологическую группу заболева-
ний, объединяемых недостаточным синтезом белка. Несмотря-на указанный-общий патофизиологический; признак, до сих пор не проводилось систематизированного исследования по применению разных аминокислот в лечении мужского бесплодия. Из всех известных аминокислот в терапии мужского бесплодия; использовался только L-аргинин.. Мета-анализ клинических ис-
. следований показал, что терапия Е-аргинином в дозе 4-8 г/сутки нашротя-жении от 1 до 6 месяцев приводит к существенному увеличению числа прогрессивно-подвижных форм: сперматозоидов у. 2/3;- мужчин с бесплодием, секреторной этиологии [БоровецСЮ. и соавт., 2005]МТёрвые исследования;, посвященные изучению; роли-Е-аргинина в; терапии, мужского* бесплодия-относятся к. 1944 году. Тогда из рациона питания трёх здоровых мужчині с нормальными показателями; сперматогенеза полностью исключили; Е-аргинин. Через; 9е дней; у них отмечалось резкое: снижение подвижности сперматозоидов; Кроме того, были; получены данные об> увеличении; числа прогрессивно-подвижных форм;сперматозоидов у троих:из пяти пациентов; страдавших астеноолигозооспермией, на фоне: приёма;Е-аргинина [Holt; L.E. et al;, .1944]. Однако малое число наблюдении тогда не позволил о ^сделать каких-либо достоверных выводов: При использовании больших доз- L-аргинина (10-20 г/сутки) было достигнуто 30% увеличение количествашро-
_П?есЖШОтпрдвижных_ _ф_орм_сперматозридов. [Giarols-A. _et :aL,. 1959]LBt 1973 году проведено; крупномасштабное исследование,. в котором приняли участие 178 мужчин-с различными формами секреторного бесплодия. После четырёхмесячного приёма L-аргинина в дозе 4 г в сутки отмечалось, значительное увеличение числа и: подвижности сперматозоидов у 111 пациентов (62,4 %), а у 28изних появились дети [Shachaker А.А., 1973]. Исследование, проведённое в 1994 году в Италии, подтвердило эффективность L-аргинина: в терапии мужского бесплодия. Тогда 40 мужчин с нарушением фертильносте получали перорально 80 мл 10% раствора L-аргинина гидрохлорида в сутки на протяжении 6 месяцев. Использование в терапии аргининовых до-
бавок значительно увеличило число прогрессивно-подвижных форм сперматозоидов без каких-либо наблюдаемых побочных эффектов [Scibona М., 1994].
Одним из препятствий в разработке и внедрении новых препаратов для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии является отсутствие адекватной экспериментальной модели. Большинство моделей не способны воспроизвести основные этапы патогенеза секреторного мужского бесплодия [Roulet V. et al., 2006; Lambrota R. et al., 2006], поэтому актуальным представляется использование метода органотипического культивирования ткани семенников. Данная модель имеет ряд преимуществ. Прежде всего, этот метод позволяет исследовать местное воздействием биологически активных веществ, то есть исключаются системные эффекты нервной и эндокринной систем. Во-вторых, в органотипической культуре сохраняются нормальные тканевые взаимодействия между отдельными клетками (в отличие от диссоциированной культуры клеток Лейдига или Сертоли). И'наконец, экономические затраты на органотипическое культивирование тканей значительном меньше, чем на длительные эксперименты с участием интакт-ных животных [Чалисова Н.И. и соавт., 2005]. В" 2006 году две группы французских лабораторий независимо друг от друга подробно охарактеризовали данный^ метод. Доказано, что .органотипическая-культура, сохраняет основные функции интактных семенников: стероидогенез (синтез тестостерона) и гаметогенез (образование сперматозоидов) на протяжении двух недель с момента начала культивирования [Roulet V. et al., 2006; Lambrota R. et al., 2006]. Необходимо отметить, что несмотря на многогранность изменений, наблюдаемых при развитии органотипической культуры семенников, можно выделить два фундаментальных процесса развития ткани, таких как пролиферация и апоптоз. Многочисленные эксперименты в органотипической культуре разных тканей и органов свидетельствует об эффективности
описанного метода для- быстрой количественной оценки процессов пролиферации и апоптоза [Чалисова Н.И., 2002].
В последнее двадцатилетие опубликовано много работ о чувствительности человека и животных к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ. Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков- ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором [Шевченко И.Н., 2003; Чалисова Н.И. и соавт., 2002]. Сверхмалые дозы могут помочь решить важную для геронтологической* практики проблему уменьшения выраженности побочных эффектов, поэтому актуальным-является исследование эффектов аминокислот и их метаболитов* в сверхмалых дозах.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении влияния 20 кодируемых аминокислот и их метаболитов на* процессышроли-ферации и апоптоза в органотипической культуре семенников молодых и старых крыс. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот в широком спектре кон
центраций диапазона сверхмалых доз на развитие органотипической-куль-
..туры семенников крыс разного возраста. ... . _ ..__.....
Определить ведущий путь апоптоза, задействованный в реализации' эффекта аминокислот, доказавших свою активность в органотипической культуре семенников.
Исследовать структурные аналоги и метаболиты аминокислот, стимулирующих пролиферацию в органотипической культуре семенников. Изучить возможные пути увеличения эффективности аминокислот, активно регулирующих развитие органотипической культуры семенников.
Установить оптимальное долевое соотношение аминокислот, необходимое для максимальной стимуляции органотипической культуры семенников.
Научная новизна работы. Впервые проведено систематизированное
исследование влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органоти
пической культуры ткани семенников крысы. При этом изучены эффекты
аминокислот в широком диапазоне сверхмалых доз. Впервые показано
уменьшение числа аминокислот, проявляющих активность в культуре ткани
семенников старых крыс и уменьшение диапазона концентраций, при кото
рых аминокислоты демонстрирует свою эффективность, по сравнению с мо
лодыми крысами). С помощью селективных регуляторов апоптоза» (2,4-
динитрофенол и молочная1 кислота) определены ведущие пути апоптоза (ми-
тохондриальный и рецепторно-опосредованный), задействованные в реали
зации эффекта аминокислот, рующих развитие органотипической культуры
ткани семенников. Впервые проведено систематизированное исследование
влияния основных метаболитов L-аргинина на развитие культуры тканиь се
менников. При этом обоснована возможность использования метода органо-
типического культивирования для-определения метаболической взаимосвя
зи между отдельными биологически активными веществами. Установлено,
что для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипи
ческой культуре ткани семенников крыс концентрация L-аргинина должна
быть в 10 раз больше концентрации L-орнитина и креатина, но в* Щ раз
_ менынелсонцентрации Ьтизолейцина, L-лизина и Ьгцитруллина _. . _
Практическая значимость работы. Результаты исследования влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии, в том числе ассоциированного со старением организма. Наиболее перспективными для дальнейших исследований являются три аминокислоты: L-изолейцин, L-лизин, L-аргинин. Изучены доступные пути для увеличения эффективности L-аргинина. Полученные данные об оптимальном долевом соотношении <ами-
нокислот, необходимых для максимальной стимуляции органотипической культуры семенников крысы, могут быть использованы при создании многокомпонентных препаратов с аминокислотами. Кроме того, результаты исследования могут быть полезными в экспериментальной работе при использовании органотипической культуре ткани. Продемонстрировано, что исследование веществ в широком спектре концентраций позволяет определить особенности метаболической взаимосвязи между отдельными биологически активными веществами. Обоснована необходимость оценки возрастных, изменений не только с позиций уменьшения количества действующих биологически активных веществ, но и с точки зрения- уменьшения- диапазона их эффективных концентраций.
Положения, выносимые на защиту.
Кодируемые аминокислоты в широком диапазоне концентраций* сверхмалых доз либо стимулируют (лейцин, изолейцин, аргинин, пролин, лизин) или ингибируют (гистидин) развитие органотипической культурьъ семенников крысы. Аминокислоты принимают участие в регуляции как митохонд-риального, так и рецепторно-опосредованного пути апоптоза.
Эффективные в отношении клеточной пролиферации или апоптоза аминокислоты отличаются не только увеличением амплитуды активности; но и
~- концентрационной- шириной- пика- активности: При- старении- наблюдается уменьшение количества'эффективных аминокислот и ширины пика* активности тех аминокислот, которые сохраняют своё влияние на развитие органотипической культуры семенников.
3. Метаболиты аргинина либо стимулируют (мочевина, орнитин, цитруллин,
креатин), либо ингибируют (оксид азота) развитие органотпической культу
ры ткани семенников зрелых крыс. У старых животных орнитин и креатин
теряют стимулирующее влияние на пролиферацию клеток семенников и
происходит снижение чувствительности ткани семенников к повреждающе
му действию оксида азота.
4. Для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипиче-ской культуре ткани семенников крыс концентрация L-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации L-орнитина и креатина, но в 10г раз меньше концентрации L-изолейцина, L-лизина и L-цитруллина.
Связь с научно - исследовательской работой Института. Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии. СЗО РАМН:
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 17 таблиц и 13 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов. Список литературы содержит 211 источников, из них отечественных - 41, зарубежных - 170.
Публикации. По'Теме диссертации опубликована 20 научнаяiработа: 11 статей и 9 тезисов, среди них 11 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки Российской Федерации.
Апробация и реализация диссертации. Материалы диссертации доложены на Международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии-им-И:П: Павлова- (Санкт-Петербург),"2005; на Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects" (Санкт-Петербург), 2005; на "Политехническом симпозиуме" (Санкт-Петербург), 2006; на Всероссийской конференции "Перспективы фундаментальной геронтологии"* (Санкт-Петербург), 2006; на межинститутской конференции молодых учёных "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" (Санкт-Петербург), 2007; на V Всероссийской конференции с международным участием имени В.Н. Черниговского "Механизмы функционирования
висцеральных систем" (Санкт-Петербург), 2007; на LXVIII ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых учёных (Санкт-Петербург), 2007.
Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, института физиологии имени академика И.П.Павлова.
Роль аминокислот в регуляции пролиферации и апоптоза клеток семенников
Число клеток в органах и тканях определяется динамическим равновесием между образованием клеток путём пролиферации и их гибелью: Семенники относятся-к интенсивно пролиферирующим органам, что связано с гаметогенезом. Источником сперматозоидов, являются стволовые клетки семенников (SSC - spermatogonial stem cells). SSC находятся на базальной мембране извитых семенных канальцев в микроокружении, формируемом клетками Сертоли. SSC сходны с эмбриональными стволовыми клетками, но механизмы формирования самоподдерживающейся популяции у SSC несколько иной. Кроме того, при трансплантации in vivo SSC не формируют тератокарциномы [Goossens Е. et al., 2006; Brinster R.L. et al., 2007].
Интенсивная пролифераци семенников требует жёсткой системы выбраковки повреждённых клеток. Существует два основных варианта клеточной гибели: некроз и апоптоз (программируемая клеточная гибель). В отличие от некроза, апоптоз реализуется в разбросанных отдельно клетках и не сопровождается воспалительной реакцией. Апоптоз герминативных клеток, наряду с их пролиферацией и дифференцировкой, является важным процессом регуляции нормального функционирования семенников.
Выделяют два пути реализации апоптоза: митохондриальный и рецеп-торно-опосредованный. Митохондриальный путь свойственен патологически изменённым клеткам, опосредуется цитохромом с разрушенных митохондрий и характеризуется активацией каспазы 9. Рецепторно-опосредованный путь типичен для неповреждённых клеток, опосредуется особыми рецепторами цитоплазматической мембраны и характеризуется первичной активацией каспазы 8 [Григорьев М.Ю. и соавт., 2003].
1. Митохондриальный путь. При воздействии различных повреждающих факторов; нарушающих энергетический обмен, в первую очередь, страдает митохондриальная мембрана. На внутренней митохондриальной мембране образуются гигантские поры, через которые выходит цитохром с - белок электрон-транспортной цепи. Цитохром с благодаря адаптерному белку Apaf-1 (apoptotic protease activating factor - фактор, активирующий апопто-тические протеазы) взаимодействует с неактивной проксимальной каспазой 9 (данный комплекс получил название апоптосомы). В составе комлекса активируется каспаза 9, которая активирует дистальные каспазы 3, 6 и 7. Дис-тальные каспазы лизируют ряд клеточных белков и опосредуют межнуклео-сомную фрагментацию ДНК [Crow М.Т. et al., 2004]. Ингибиторы каспаз блокируют апоптоз герминативных клеток [Pentikainen V. et al., 1999].
Другой независимый патогенетический механизм высвобождения ци-тохрома с связан с активацией антионкогена р53 в ответ на повреждение ДНК. р53 - это ядерный белок с молекулярной массой 53 кДа. В обычных условиях уровень р53 очень низкий, но при повреждении ДНК происходит активация этого белка через серию посттрансляционных модификаций. р53 приводит к аресту клеточного цикла. Если клетке не удаётся справиться с повреждениями ДНК, то наступает апоптоз. Ключевая роль р53 в апоптозе герминативных клеток продемонстрирована при облучении семенников [Hasegawa М. et al., 1998]. На уровне транскрипции р53 увеличивает экс прессию трёх групп белков: блокаторов клеточного цикла (р21 - ингибитор большинства циклинзависимых киназ), ферментов репарации ДНК (р53 связывающий белок), активаторов апоптоза (Вах - увеличивает высвобождение цитохрома с из митохондрий) и его ингибиторов (Вс1-2 — ингибирует высвобождение цитохрома с из митохондрий) [Lacroix М. et al., 2006]. Семейство белков Вс1-2 выполняет важную роль в апоптозе герминативных клеток на разных этапах созревания [OldereidN.B. et al., 2001].
2. Рецепторно-опосредованный путь. В мембранах клеток содержатся особые рецепторы смерти (death receptors), относящиеся к суперсемейству фактора некроза-опухоли (Fas-рецепторы). После взаимодействия со специфическим лигандом FasL, рецептор олигомеризуется и благодаря адаптер-ному белку FADD (Fas-associated via death domain - белок, связанный с Fas посредством домена смерти) взаимодействует с неактивной проксимальной каспазой 8 (данный комплекс получил название "death-inducing signal complex" - сигнальный комплекс, индуцирующий гибель клетки). Формирование комплекса приводит к активации каспазы 8, которая, в свою очередь, активирует дистальные каспазы. Кроме того, каспаза 8 активирует сигнальный белок Bid, который инициирует выход цитохрома с из митохондрий [Gustafsson А.В. et al., 2003]. Ряд авторов считают, что выделение митохонд-риального пути апоптоза нецелесообразно, так как повреждение митохондрий и выход в цитоплазму цитохрома с является вторичным событием, инициируемым каспазами [Рыженкова О.П., 2002]. FasL конститутивно экс-прессируется на клетках Сертоли. Поэтому клетки Сертоли вызывают апоп-тоз герминативных клеток, отмеченных Fas-рецептором. Более того, введе-ниє токсинов, специфически действующих на клетки Сертоли, приводит к увеличению экспрессии Fas-рецепторов на герминативных клетках [Penti-kainen V. et al., 1999].
Подготовительные операции для культивирования тканей
Для получения требуемых концентраций проводились последовательные разведения тестируемых веществ в питательной среде. В работе использовалось четыре группы химических реактивов: L-аминокислоты (аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспартат (Asp), валин (Val), цистеин (Cys), глутамат (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (He), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серии (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Туг); Sigma, США), метаболиты L-аргинина (L-орнитин, мочевина, L-цитруллин, оксид азота, креатин - Vecton, Россия), вспомогательные вещества (силденафил — Pfizer, США; глутатион — Vecton, Россия), регуляторы апоптоза (2,4-динитрофенол, молочная кислота - Vecton, Россия) и L-аргинин-содержащий препарат "Гепа-сол" (Hemopharm, Югославия). Например, для приготовления- раствора L-лизина 146 мг сухого порошка растворяют в 100 мл питательной среды (колба №1). 1 мл полученного раствора, содержащий. Л О"4 моль-L-лизина, переносят в колбу №2 вместимостью 100 мл и доводят питательной средой до метки. 1 мл раствора с концентрацией L-лизина 10-6 моль/л, переносят в колбу №3 и добавляют 99 мл мл питательной среды. При разведении Г мл раствора из колбы №3"в 9 мл питательной среды получают раствор L-лизина с концентрацией 10-9 моль/л (колба №4а), в 99 мл питательной среды - раствор с концентрацией L-лизина Ю-10 моль/л (колба №46). Аналогичным образом готовят растворы L-лизина с концентрацией 10 п моль/л (колба №5a)f и 10 моль/л (колба №56). Эксплантаты семенников культивируются в 3 мл питательной среды, поэтому для получения конечного раствора L-лизина с концентрацией ЮГ10 моль/л из колбы №3 в чашку Петри переносят. 0,3 _мл. раствора (так как 0,1 мл питательной среды из колбы №3 содержит Ю-9 моль L-лизина). Аналогичным образом готовят растворы с конечной концентрацией L-лизина Ю-11 - Ю-14 моль/л (рис. 4). Молекулярные массы и химические формулы реактивов, использованных в работе, приведены в табл. 1. Состав L-аргинин-содержащего многокомпонентного препарата "Гепасол" указан в табл. 2.
Концентрации 10 10-10 14 моль/л относятся к диапазону сверхмалых доз..Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества которая создает концентрацию на несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия, вещества;со своим эффектором. В научной литературе:можно встретить и другие терминьъдля: обозначения сверхмалых.доз и их эффектов: ультрамалаяї. концентрация;. пикомолярная(хЮт М) тфе-томолярная хЮ-15 моль/л) чувствительность.
Эффективность сверхмалых доз биологически активных веществшро-демонстрирована: в опытах на? всевозможных биологических" моделях (изолированные : ферменты; клетки;. ткани, лабораторные: животные) и :в.клинических- исследованиях [Шевченко; И.Н:, 2003]:. Многочисленные: экспериментальные данные- позволяют выделить четыре: основные -характеристики эффектов сверхмалых доз биологически активных веществ:
Двухфазностъ эффекта. Первый пик активности вещества «регистрируется в щреде л ах чувствительности его биологического эффектора. Чаще: всего .роль эффектора: выполняют рецепторы; нижний; предел чувствительности которых не:опускается?ниже Щ10 Мі Дальнейшее:снижение концентрации вещества приводит к исчезновению; эффекта, но в диапазоне сверхмалых концентраций можно зарегистрировать второй пик активности- Диат пазон;неэффективных;концентраций между. двумяпиками[активности;полу-чил название "молчащей зоны" или "мёртвой зоны! . Второй: пик активности аналогично первому характеризуется дозо-зависимостью; то есть эффект является не точечным, а распространяется в некотором;, диапазоне концентраций [БурлаковаЕ.Б.,. 1999].
Иммуногистохимические методы исследования эксплантатов
В первой серии опытов было проведено скрининговое исследование влияния всех . 20 кодируемых аминокислот на пролиферацию органотипической культуры семенников. Многолетний опыт изучения эффектов сверхмалых доз Ь-аминокислот позволил установить, что эффективная концентрация L-аминокислот в культуре ткани составляет 10 моль/л. Если аминокислота- достоверно влияет на развитие органотипической культуры ткани в-концентрации 10 12 моль/л, то имеется вероятность её активного воздействия на культуру ткани и: в- других концентрациях, диапазона сверхмалых доз. При- отсутствии эффекта пикомолярных концентраций маловероятно появление пиков активности в других концентрациях, соответствующих сверхмалым дозам. .
Достоверно влияют на развитие органотипической культуры; семенников молодых крыс только шесть L-аминокислот: изолейцин, лейцин, аргинин, лизин, пролин, гистидин (рис. 8). При добавлении Ь-изолейцина в концентрации 10 моль/л индекс площади органотипической культуры семенников молодых крыс увеличился на 31±6% (п — 22, р 0,05) по сравнению с индексом площади контрольной органотипической культуры семенников, развивавшейся; в аналогичных условиях, но без добавления. Е-изолейцина. Введение в культуральную среду L-лейцина в концентрации 10 . моль/л приводит к.увеличению индекса площади на 21 ±3%(п = 20; р 0 05) по сравнению с контрольными значениями. Добавление L-аргинина увеличивает индекса площади органотипической культуры семенников молодых крыс на 26±5% (п = 24, р 0,05), L-лизина - на 25±4% (п = 24, р 0,05)," L-пролина - на 1б±4% (n = 22, р 0,05) относительно органотипической культуры, культивируемой без дополнительной добавки ультрамалых доз указанных аминокислот. При этом L-гистидин является единственной аминокислотой, угнетающей развитие органотипическои культуры ткани семенников молодых крыс. Индекс площади органотипическои культуры семенников при введении в культуральную L-гистидина в концентрации 10 12 моль/л снизился на 15±4% (п=22, р 0,05) по сравнению с контрольными значениями индекса площади. Остальные 14 протестированных L-аминокислот (глицин, аланин, валин, аспарагин, аспартат, глутамин, цистеин, серии, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин, тирозин, глутамат) не оказали достоверного влияния на индекс площади органотипическои культуры семенников через трое суток культивирования (табл. 3).
При- изучении органотпической культуры семенников старых крыс достоверную активность продемонстрировали только три L-аминокислоты и 20 изученных: L-лизин, L-аргинин и L-гистидин (рис. 9). Индекс площади, органотипической культуры семенников старых крыс при введении в культуральную среду L-лизина в. концентрации 10" моль/л увеличился на 25±5% (п=25, р 0,05) относительно контрольных значений индекса площади. Культивирование эксплантатов семенников, полученных от старых животных, в присутствии L-аргинина приводит к возрастанию индекса площади на 16±4%» (п=25, р 0,05). L-гистидин, аналогично результатам экспериментов, проведённых с использованием органотипической культуры семенников молодых крыс, уменьшает индекс площади. Добавление L-гистидина в концентрации 10 моль/л уменьшает индекс площади на 18±4% (п=25, р 0,05) относительно органотипической культуры, культивируемой без дополнительной добавки ультрамалых доз L-гистидина. Другие три L-аминокислоты, эффективные у молодых крыс (изолейцин, лейцин и пролин), не влияют на индекс площади при культивировании органотипической. культуры семенников старых животных. Через трое суток культивирования значения индекса площади культуры семенников, развивавшейся в присутствии ультрамалых доз указанных аминокислот, составили 2±5% (п=25,_р 0,05) дляХ изолейцина,-6±3% (п=23, р 0,05) для L-лейцина и 4±6% (п=23, р 0,05) для L-пролина. Аналогично результатам опытов, проведённых на семенниках молодых крыс, остальные 14 L-аминокислот (глицин, аланин, валин, аспарагин, аспартат, глутамин, цистеин, серии, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин, тирозин, глутамат) не влияют на пролиферацию клеток в органотипической культуре семенников старых животных (табл. 3).
Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных L-амиокислот
Выделяют два пути реализации апоптоза: митохондриальный и рецеп-торно-опосредованный. Митохондриальный путь свойственен патологически изменённым клеткам и опосредуется цитохромом с разрушенных митохондрий. Тогда как рецепторно-опосредованный путь типичен для неповреждённых клеток и опосредуется особыми рецепторами цитоплазматической мембраны. Для определения ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных L-аминокислот, были использованы химические вещества — селективные регуляторы митохондриального и ре-цепторно-опосредованного путей апоптоза: 2,4-динитрофенол и молочная кислота.
Для избирательной активации митохондриального пути апоптоза используются химические вещества, разобщающие процессы окисления, и фосфорилирования, протекающие на внутренней митохондриальной мембране. Хорошо изученным представителем группы разобщителей окислительного фосфорилирования является 2,4-динитрофенол. В определённых концентрациях разобщители окислительного фосфорилирования полностью блокируют синтез аденозинтрифосфата в митохондриях и запускают митохондриальный путь апоптоза. В связи с отсутствием литературных данных о влиянии 2,4-динитрофенола на апоптоз в органотипической культуре семенников были проведены предварительные опыты, направленные на определение наиболее эффективной концентрации используемого разобщителя окислительного фосфорилирования. Результаты предварительных экспериментов, проведенных в органотипической культуре семенников молодых крыс, продемонстрировали выраженный проапоптотический эффект 2,4-динитрофенола в диапазоне концентраций от 10мкг/мл до 100 мкг/мл. Куль-туральная среда с концентрацией 2,4-динитрофенола 10 мкг/мл угнетает рост органотипической культуры семенников на 24±4% (п = 23, р 0,05). Ин деке площади при использовании 2,4-динитрофенола в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл составил -26±6% (п = 22, р 0,05) и -29±3% (n = 22, р 0,05) соответственно.
Для селективной активации рецепторно-опосредованного пути апоп тоза используются антитела-агонисты Fas-рецепторов. Антитела, добавляе мые в культуральную среду, могут служить, дополнительным источником тестируемых аминокислот и искажать результаты опытов. Поэтому для изу чения рецепторно-опосредованного пути активации; апоптоза был использо ван D-лактат. В опытах на органотипической культуре ткани продемонстри рован выраженный антиапоптотический эффект D-лактата. Причём доказа но, что D-лактат селективно ингибирует рецепторно-опосредованный путь апоптоза семенников, реализуемый через Fas-рецепторы, и не влияет на ми тохондриальный путь апоптоза [Erkkila К. et al., 2002]. Предварительные опыты, проведённые в. органотипической культуре семенников молодых крыс, подтвердили выраженную антиапоптотическую активность D-лактата5 в концентрации 5 ммоль/л. Индекс площади культуры ткани через трое су ток культивирования в питательной среде, содержащий D-лактат в концен трации 5 ммоль/л, составил 18±2% (п = 25, р 0,05), 10 ммоль/л - 26±7% (n = 25, р 0,05), 15 ммоль/л - 24±4% (п = 25, р 0,05), 20 ммоль/л - 29±5% (n = 25, р 0,05) относительно контроля..
При введении в органотипическую культуру семенников молодых крыс смеси, состоящей из эффективных аминокислот и 2,4-динитрофенола, индекс площади через трое суток.культивирования был достоверно больше, чем индекс площади при изолированном применении 2,4-динитрофенола (табл. 6). Например, индекс площади органотипической культуры семенников, при добавлении в культуральную среду смеси из эффективных концентраций L-изолейцина и 2,4-динитрофенола, составил 14±6% (п = 22, р 0,05), что достоверно больше индекса площади, полученного при избирательном добавлении в культуральную среду 2,4-динитрофенола в концентрации мкг/мл (-26±6%, n = 22, р 0,05). Аналогичные эффекты продемонстрированы для L-лизина, L-аргинина, L-лейцина, L-пролина. Значения индекса площади органотипической культуры семенников молодых крыс через трое суток культивирования в» присутствии сверхмалых доз эффективных аминокислот и 2,4-динитрофенола составили: 26±2% для смеси "L-лизин + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 18±5% для смеси "L-аргинин + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 11±5% для смеси "L-лейцин + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 6±2% для смеси "L-пролин + 2;4-динитрофенол" (n = 23, р 0,05), что достоверно больше индекса площади, полученного при изолированном введении в культуральную -среду 2,4-динитрофенола в концентрации 50 мкг/мл (-26±6%, n = 23, р 0,05). Таким образом, можно предположить, что антиапоптотический эффект указанных пяти аминокислот связанх ингибированием митохондриального пути апоп-тоза. Эксперименты по изучению совместного влияния L-гистидина и 2,4-динитрофенола не продемонстрировали статистически достоверного отличия от индекса площади, полученного при монокомпонентном использовании эффективной концентрации 2,4-динитрофенола. Если индекс площади органотипической культуры семенников через трое суток культивирования при добавлении 2,4-динитрофенола равен -26±6% (n = 22, р 0,05), то введение „В КуЛЬТураЛЬНуЮ. Хреду„ СМеСИ . 2,4-ДИНИТр0феН0Ла_С_ LrniCTHflHHOM уменьшает индекс площади на 20±4% (n = 23, р 0,05). Таким образом, анти-пролиферативный эффект L-гистидина, вероятно, связан с активацией митохондриального пути апоптоза.
