Введение к работе
Актуальность исследования
В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения особое внимание специалистов в области биологии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. В последнее время в научной литературе всё чаще встречается информация об увеличении количества заболеваний суставов и позвоночника у лиц старших возрастных групп, что диктует необходимость поиска новых эффективных и безопасных средств для профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата. Регуляторные пептиды, влияющие на процессы развития тканей, широко распространены в живых организмах и продуцируются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии органа или ткани [Хавинсон В.Х. и соавт. 1985; Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986].
Поддержание биологической целостности организма на клеточном уровне регулируется сигналами, которые позволяют сохранять сложное равновесное состояние между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и программируемой клеточной гибелью (апоптозом). Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях выполняют секреторные белки – цитокины [Пальцев М.А., 1996; Ярилин А.А., 1999]. На основании многочисленных экспериментальных и клинических данных стало известно, что пептидные биорегуляторы имеют большое значение в поддержании и координации различных функций организма [Морозов В.Г.и соавт., 2000; Коркушко О.В. и соавт., 2002; Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004]. Пептиды, в свою очередь, частично гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в ряде исследований, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Чалисова и соавт., 2002, 2005].
В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН синтезированы трипептиды, являющиеся аналогами активных групп экстрактов из тканей животных.
Достаточно сложно определить роль пептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.
Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций являются органотипические культуры, которые используются для тестирования биологической активности различных препаратов [Хавинсон В.Х. и соавт., 1998, 1999; Levi-Montalchini R, 1982].
В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента.
В то же время, способность влиять на скорость основных клеточных процессов – пролиферацию и апоптоз и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств пептидов млекопитающих. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов.
Сравнительное изучение в культуре ткани действия пептидов и аминокислот на хрящевую ткань как в молодом возрасте, так и при старении, позволяет более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме при старении. При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на хрящевую ткань при ее патологии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом.
Цель и задачи исследования
Целью работы было изучение влияния аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани на развитие эксплантатов хряща в органотипических культурах тканей молодых и старых крыс.
Для достижения цели исследования были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.
2. Исследовать влияние синтезированных трипептидов Т-31, Т-33, Т-34 и Т-38 на развитие эксплантатов хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.
3. Исследовать действие комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.
4. Исследовать иммуноцитохимическими методами влияние стандартных аминокислот, трипептидов и Хондролюкса на развитие процессов пролиферации и апоптоза в органотипической культуре хрящевой ткани от молодых и старых крыс.
Научная новизна работы
Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса в органотипических культурах тканей хряща, взятых от молодых и старых животных. Установлено стимулирующее влияние шести аминокислот (гистидина, глутамина, аргинина, лейцина, изолейцина и тирозина) на процессы пролиферации в культуре ткани хряща от молодых животных и уменьшение в 6 раз количества стимулирующих пролиферацию аминокислот в эксплантатах от старых животных. Впервые установлено, что трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют развитие эксплантатов хрящевой ткани молодых и старых крыс. Показано отсутствие тканеспецифических свойств трипептидов: короткие пептиды стимулируют процессы пролиферации в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.
Впервые показано, что комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс эффективно стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани, как молодых, так и старых животных. Хондролюкс обладает выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани, не влияя на другие ткани. Комплексные пептиды, экстрагированные из тканей тимуса, головного мозга, шишковидной железы, сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза, не оказывали достоверного влияния на органотипическую культуру хрящевой ткани.
Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов хряща и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации Хондролюксом, трипептидами Т-31 и Т-38 и некоторыми аминокислотами. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов хрящей находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации PCNA и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.
Практическая значимость работы
Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в хрящевой ткани. Напротив, Хондролюкс и трипептиды Т-31 и Т-38 проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении хрящевой ткани у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное тканеспецифическое действие Хондролюкса на хрящевую ткань создает основу для его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом. Установленное стимулирующее действие трипептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике.
Положения, выносимые на защиту
1. Аминокислоты - гистидин, глутамин, аргинин, лейцин, изолейцин и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в хрящевой ткани молодых животных. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации в хрящевой ткани, уменьшается в тканях от старых животных.
2. Трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре хрящевой ткани молодых и старых животных. Трипептиды не проявляют тканеспецифические свойства и стимулируют пролиферативную активность в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.
3. Комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани как молодых, так и старых животных, обладая выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани.
4. Площадь экспрессии маркера пролиферации PCNA находится в положительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 – в отрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов в органотипической культуре хрящевой ткани при введении аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящей Хондролюкса.
5. Трипептиды Т-31 и Т-38 и комплексный пептид из хрящевой ткани Хондролюкс являются перспективными препаратами для изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения возраст-ассоциированной патологии опорно-двигательного аппарата.
Связь с планом НИР
Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 106 страницах, содержит 8 таблиц, иллюстрирован 22 рисунками. Список литературы содержит 122 источника, из них 74 отечественных и 48 зарубежных.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены на VIII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2010» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2010); медицинской академии (Санкт-Петербург, 2010); 6 международной научной конференции «Донозология – 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы» (Санкт-Петербург, 2010); VI научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2010).
