Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Особенности метаболизма аминокислот в организме при старении 15
1.1.1. Теории старения организма 15
1.1.1.2. В озрастные изменения метаболизма аминокислот... 17
1.1.2. Влияние пептидов на структурно-функциональные характеристики лимфоидной ткани 19
1.2. Молекулярные механизмы пролиферации и апоптоза клеток 27
1.2.1. Программированная клеточная гибель 27
1.2.2. Влияние цитостатиков на клеточные процессы в тканях 35
1.2.3. Функциональная роль рецепторов нейротрофических факторов в процессах клеточной пролиферации и апоптоза 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Органотипическое культивирование тканей 46
2.2. Подготовительные операции для культивирования тканей 47
2.2.1. Состав и приготовление питательной среды 47
2.2.2. Получение коллагена и коллагеновой подложки 48
2.2.3. Выделение тканей для культивирования 49
2.3 Морфологические и морфометрические методы исследования эксплантатов
2.3.1. Морфометрическая оценка индекса площади эксплантатов
2.4 Иммуногистохимические методы исследования эксплантатов 51
2.4.1. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений
2.5. Определение эффективных концентраций синтетических пептидов 54
2.6. Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта аминокислот 55
2.7. Моделирование эксперементально пренатальной гомоцистеинемии 56
2.7.1. Биохимические исследования антиоксидантных ферментов 57
2.8. Статистическая обработка результатов исследований 61
Глава 3. Результаты исследования 62
3.1. Скрининг кодируемых аминокислот в органотипической культуре лимфоидной ткани молодых и старых крыс 62
3.1.1. Влияние аминокислот на экспрессию проапоптозного белка р53 и PCNA в культуре лимфоидной ткани 63
3.2. Определение ведущих путей апоптоза, задействованных в реализации эффекта аминокислот 68
3.2.1. Исследование митохондриального пути апоптоза при действии 2,4 — динитрофенола в культуре лимфоидной ткани 68
3.2.2. Исследование рецепторно-опосредованного пути апоптоза при действии фактора роста нервов и антител к нему в культуре лимфоидной ткани 72
3.3. Влияние пептидов АВ 17 и пинеалона на интенсивности антиоксидантных ферментов 84
3.4. Изменения зоны роста эксплантантов селезенки в культуре ткани при действии циклофосфана и аминокислот . 87
3.4.1. Изменения зоны роста эксплантатов селезенки старых крыс в культуре ткани при действии циклофосфана и тимусных пептидов 94
3.4.2. Сочетанное влияние циклофосфана и пептида АВ 17 на развитие лимфоидной ткани в
органотипической культуре 94
3.4.3. Сочетанное влияние циклофосфана и АВ 17 и пептида на развитие лимфоидной ткани
в органотипической культуре селезенки старых крыс
3.4.4. Изменение зоны роста эксплантатов селезенки в 97
культуре ткани при действии циклофосфана
Глава 4. Обсуждение результатов исследования
Выводы
Практические рекомендации
Литература
- Влияние пептидов на структурно-функциональные характеристики лимфоидной ткани
- Биохимические исследования антиоксидантных ферментов
- Влияние аминокислот на экспрессию проапоптозного белка р53 и PCNA в культуре лимфоидной ткани
- Изменения зоны роста эксплантантов селезенки в культуре ткани при действии циклофосфана и аминокислот
Введение к работе
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание специалистов в области физиологии, биохимии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. Идет постоянный поиск биологически активных веществ, которые позволят направленно корректировать структурные изменения и функциональную активность клеток, снижающиеся при возрастной патологии. При старении организма происходит замедление регенерации, связанное с нарушениями, как процессов клеточной пролиферации, так и апоптоза. Не менее важной проблемой, чем снижение регенерационных способностей тканей, является развивающаяся при старении организма тканевая гипоксия. Поэтому восстановление органов и тканей организма на клеточном уровне при их геронтологической дисфункции является актуальной задачей.
Регуляторные пептиды, влияющие на процессы клеточного роста и развития, широко распространены в живых организмах и выделяются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии функций органа или ткани. Кроме того, они образуются в результате ограниченного протеолиза высокомолекулярных белков, находящихся в гуморальной среде. Эти низкомолекулярные олигопептиды (до 10 аминокислотных последовательностей) обладают широким спектром биологического действия и координируют выполнение биологических функций различными органами и тканями. Одной из функций биорегуляторных пептидов является осуществление воздействия на репаративные процессы в тканях организма
за счет стимуляции клеточной пролиферации или ее торможения в процессе апоптоза. Пептиды в свою очередь гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в последнее время, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Белокрылов Г.А. и соавт., 1997; Чалисова Н.И. и соавт., 2000, 2007]. Кроме того, исследования, проведенные Л.С. Козиной и соавт. (2008), показали, что некоторые короткие регуляторные пептиды, например вилон, обладают выраженными антигипоксическими свойствами. Поэтому актуальной является проблема поиска пептидных препаратов, способных усиливать процессы регенерации в тканях и обладать антиоксидантными свойствами, что позволит создать базу для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.
Процесс выделения индивидуальных пептидов и определения их биологической активности является чрезвычайно трудоемким, требует оценки активности многих сотен пептидов, что практически, трудно осуществимо в течение короткого периода времени. В связи с этим важной является задача создания синтетических пептидов, что способствует более быстрому получению пептидов с различными свойствами, но без использования дорогостоящего сырья и длительных методов очистки. В Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН для их получения был применен новый методический подход [Хавинсон В.Х. и др., 1999, 2000, 2006]. После аминокислотного анализа комплекса полипептидных фракций какой-либо ткани млекопитающих отбирали аминокислоты, присутствующие в соответствующих препаратах в наибольшем количестве. При конструировании первичной структуры пептида учитывали данные расчетов энергетически выгодных конформаций для ионизированной молекулы. Такой подход позволил разработать технологию получения пептидных регуляторов функциональной активности различных тканей. Были синтезированы дипептиды: вилон (Lys-Glu) и его
аналог АВ17, трипептид пинеалон [Хавинсон В.Х. и др.2006]. Способность влиять на скорость основных клеточных процессов — пролиферацию и апоптоз, - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток, по сравнению с контролем, является одним из общих свойств пептидов млекопитающих, а также 20 кодируемых аминокислот. Поэтому исследование способности пептидов АВ-17 и пинеалона стимулировать клеточную пролиферацию и антиоксидантную активность является актуальным для поиска препаратов, обладающих геропротекторными свойствами.
Наиболее адекватным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ является органотипическое культивирование фрагментов тканей [Калюнов В.Н., 1986; Чалисова Н.И. и соавт., 2003; Levi-Montalchini R., 1982].Этот метод обладает рядом преимуществ, связанных с отсутствием в культуре ткани нервных, гуморальных и других влияний, которые присутствуют в целостном организме. Количественное изменение клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности. При этом становится возможным выяснить, какие пути апоптоза (рецептор-опосредованные или митохондриальные) задействованы при влиянии олигопептидов и аминокислот на клеточную пролиферацию. Можно предположить, что олигопетиды и аминокислоты обладают также протекторными свойствами при действии повреждающих агентов, нарушающих синтез и репарацию ДНК. Использование цитостатиков в онкологии, гериартрии является, к сожалению, недостаточно избирательным методом, т. к. при таком воздействии на организм повреждаются и нормальные клетки, вследствие чего часто наблюдаются побочные эффекты [Барыкина О.М. и соавт., 2004]. Большинство цитостатических веществ прямо или косвенно подавляют удвоение ДНК в S-фазе клеточного цикла, блокируя при этом процессы транскрипции
и репликации, поэтому актуальным является исследование возможных протекторных свойств олигопептидов и аминокислот на фоне воздействия цитостатиков на эксплантаты тканей от молодых и старых животных.
Развитие процессов апоптоза, или программированной клеточной гибели, также тесно связано с нарушениями репарации ДЬЖ. В связи с этим представляется чрезвычайно важным выясненить, какие пути апоптоза задействованы при влиянии олигопептидов и аминокислот на клеточную пролиферацию. Известно, что на поверхности субпопуляции лимфоцитов и мононуклеарных клеток селезенки и лимфатических узлов, а таюке на тучных клетках существуют низкоаффинные рецепторы к фактору роста нервов (ФРН) - NGFR р75 , имеющие структурное сходство с рецепторами к фактору некроза опухоли. Ранее рецепторам NGFRp75 отводилась роль модуляторов для высокоафинных тирозин киназных рецепторов ФРН. Однако недавно с помощью моноклональных антител и антисмысловых олигонуклеотидов установлено, что рецепторы NGFRp75 являются индукторами программированной клеточной гибели по митохондриальному пути в нервной и лимфоидной тканях, регулируя экспрессию генов Вс1-2, Bcl-xl, Fas. Блокада этих рецепторов приводит к ослаблению их апоптоз-индуцирующей активности. Исследование сочетанного действия олигопептидов и аминокислот с нейротрофинами в органотипической культуре лимфоидной ткани является чрезвычайно важным для выявления их участия в процессах клеточной пролиферации и апоптоза. Для верификации ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта пептидов и аминокислот, может использоваться такой селективный регулятор митохондриального пути апоптоза как 2,4-динитрофенол, который разобщает окисление и фосфорилирование и блокирует синтез аденозинтрифосфата в митохондриях. Достаточно сложно определить роль олигопептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный
ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.
Одной из важных причин возникновения тканевой гипоксии, наблюдающейся при старении организма, является гипергомоцистеинемия. Поэтому адекватным методом для изучения антиоксидантного действия пинеалона и пептида АВ-17 in vivo является модель пренатальной гипоксии, одним из факторов возникновения и развития которой является гипергомоцистеинемия. Модель пренатальной гипергомоцистеинемии у крыс, беременность которых протекает в условиях пищевой нагрузки метионином, является инструментом исследования молекулярного действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты in vivo [Козина Л.С. и соавт.2008]. На поздних стадиях беременности гипергомоцистеинемия является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии плода. Возможное устранение гипоксической патологии с помощью пептидов АВ-17 и пинеалона имеет большое значение для лечения таких состояний. Выявление антиоксидантных свойств олигопептидов в данной модели позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме, что может служить базой для создания новых геропротекторных препаратов. Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в изучении влияния 20 кодируемых аминокислот и коротких пептидов на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс и на активность антиоксидантных ферментов у крыс in vivo. Для достижения
11 указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. Исследовать влияние 20 кодируемых аминокислот на клеточную
пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре селезенки молодых
и старых крыс.
2. Определить влияние 20 аминокислот в присутствии селективного
регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-динитрофенола, а также
в присутствии антител к NGFR 75 на развитие органотипической культуры селезенки крыс разного возраста.
Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот в присутствии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.
Изучить влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона при действии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.
5. Исследовать влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона на
общую антиокислительную активность, антирадикальную активность
и активность антиоксидантных ферментов при гипергомоцистеинемии, вызванной метиониновой нагрузкой у крыс.
Научная новизна работы
Впервые проведено систематизированное исследование
20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс и установлено, что 16 аминокислот обладают активностью в отношении процессов клеточной пролиферации и апоптоза в эксплантатах от молодых крыс, в то время как в эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается до пяти. Установлено, с помощью антител
к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов и селективного регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-динитрофенола, что аминокислоты с заряженным радикалом (глутаминовая кислота, лизин) только стимулируют клеточную пролиферацию, не регулируя процессы апоптоза. Гидрофобные аминокислоты могут действовать по рецепторному пути апоптоза, гистидин и аргинин - по митохондриальному. Впервые при исследовании влияния дипептида АВ-17, трипептида пинеалона и кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс в присутствии циклофосфана и установлено, что эти вещества могут отменять ингибирующее действие цитостатика у молодых и старых крыс.
С помощью моноклональных антител к проапоптозному белку Р53 впервые выявлены пути развития апоптоза в лимфоидной ткани. Впервые показано, что введение пинеалона и пептида АВ-17 крысам оказывает антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы при экспериментальной гипергомоцистеинемии.
Практическая значимость работы
Выявленная отмена действия цитостатика под влиянием пептидов АВ-17 пинеалона и аминокислот в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс могут стать основой для использования их в клинической практике для лечения пациентов, получающих цитостатическую терапию, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом. Антиоксидантный эффект пептидов АВ-17 и пинеалона, позволит усилить эффект терапевтических воздействий, что открывает перспективы целенаправленного изучения три- и тетрапептидов для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.
Положения, выносимые на защиту
1. 20 кодируемых аминокислот влияют различным образом на
процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре
лимфоидной ткани селезенки крыс в зависимости от возраста.
В эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается с 16 до пяти аминокислот по сравнению с эксплантатами от молодых крыс.
Аминокислоты с заряженным радикалом только стимулируют клеточную пролиферацию, не участвуя в регуляции процессов апоптоза, регуляция которых осуществляется в основном гидрофобными аминокислотами.
Дипептид АВ-17, трипептид пинеалон и аминокислоты устраняют цитостатическое действие циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс, что создает базу их терапевтического использования для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков.
4. Пептиды пинеалон и АВ-17 оказывают антиоксидантный эффект,
препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и
глутатионпероксидазы в ткани селезенки при гипоксии у крыс, что создает
основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств,
предназначенных для профилактики и лечения патологических процессов, в
том числе ассоциированных с возрастом.
Связь с планом НИР института
Диссертационная работа выполнена по теме основного плана НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной
комиссии Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований, и 6 тезисов.
Апробация и реализация диссертации. Материалы диссертации доложены
на конгрессе «VI Europen Congr. of Intemat. Association of Gerontology and
Geriartrics», С-Петербург, 2007; 2-м Санкт-Петербургском Международном
Экофоруме, С-Петербург, 2008; на конференции «Донозология»,
С-Петербург, 2008; на IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» С-Петербург, 2008.
Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 137 страницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирован 29 рисунками. Список литературы содержит 238 источников, из них отечественных - 82, зарубежных -156.
Влияние пептидов на структурно-функциональные характеристики лимфоидной ткани
Известно, что лимфоидной ткани, составляющей основу иммунной системы, присущи внутри- и межсистемные связи. Все субпопуляции лимфоцитов находятся в тесном взаимоотношении друг с другом, так как любая реакция в иммунной системе осуществляется только при условии их кооперации. Изменения в какой-либо части лимфоидной системы вызывают изменения во всей системе и в других системах организма. Установлено, что в органах лимфоидной системы происходит пролиферация предшественников иммунокомпетентных клеток и дифференцировка их в зрелые клетки. Генетически детерминированный характер иммунного надзора во многом зависит от морфофункциональных особенностей различных популяций лимфоцитов и их оптимального баланса, то есть от особенностей анатомо-физиологической организации лимфоидной ткани [Green G, Bach, J., 1979]. Процессы пролиферации и дифференцировки в лимфоидной ткани обеспечивают постоянное поддержание ее клеточного состава и осуществление защитных функций. Пролиферация лимфоцитов занимает центральное место в упорядоченном и генетически запрограммированном процессе сохранения гомеостаза в лимфоидной системе. Каждая субпопуляция лимфоцитов находится под контролем пептидных регуляторов, продуцируемых различными органами и клетками иммунной системы. Особенности жизнедеятельности лимфоидной системы, оптимальное соотношение различных популяций лимфоцитов, соответствие структуры и функции лимфоидных органов обусловлены в первую очередь комплексом процессов пролиферации, дифференцировки, кооперации, миграции и гибели лимфоцитов, их сбалансированности по времени и уровню. Нарушение этого комплекса, изменение интенсивности указанных процессов может привести к развитию иммунопатологических процессов [Труфакин В.А и соавт. 1977, Труфакин В.А., 1983].
В разные возрастные периоды человек и животные имеют определенную иммунологическую реактивность, что связано с процессами селекции лимфоцитов в тимусе и формированием иммунологической толерантности в ходе неонатального развития [Miller J. F., 1993].
Преобладание в лимфоидном органе тех или иных популяций лимфоцитов, находящихся на определенной стадии дифференцировки и имеющих определенные функциональные свойства, обусловливает морфофункциональные особенности данного органа. Селезенка - вторичный периферический лимфоидный орган мезенхимного происхождения с лимфоидными фолликулами. Ввиду особенностей расположения различных типов ретикулярных клеток, Т - и В - лимфоцитов в лимфатических фолликулах селезенки различают определенные зоны, имеющие структурно-функциональные признаки. Строму селезенки составляют отростчатые ретикулярные клетки. В тяжах ретикулярной ткани белой пульпы расположены лимфоциты и плазматические клетки 20-40 % лимфоцитов селезенки являются Т-клетками на разных стадиях развития. Т-клетки контактируют с ретикулярными клетками. Количество В-лимфоцитов в селезенке 40-60%, доля плазматических клеток не более 2-3%, бластных - не более 1-2% от общего числа клеток [Васильев Н.В. 1975].
В петлях ретикулярной стромы красной пульпы находятся эритроциты, лейкоциты, лимфоциты и макрофаги. В селезенке под влиянием гуморальных факторов тимуса и ее внутриорганного микроокружения происходит дифференцировка клеток. В-клетки пролиферируют и дифференцируются в плазматические клетки. С возрастом в селезенке также, как и в тимусе, происходит уменьшение лимфоидных структур, увеличение соединительнотканной стромы [Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996.] и изменяется функциональная активность составляющих ее клеток.
В последнее время из тимуса выделено много различных иммунологически активных веществ, для большинства известны аминокислотные последовательности, очень многие синтезированы полностью или их фрагменты [Белокрылов Г.А. и соавт., 1993]. Различные гуморальные тимусные факторы способствуют пролиферации, дифференцировки лимфоцитов, способствуют появлению на мембранах клеток специфических маркеров и их расселению во вторичные лимфоидные органы и завершают свое действие вне него (в крови, в периферических лимфоидных органах) [Willis-Carr J, 1978]. Известно, что разные гуморальные факторы тимуса оказывают различное действие на отдельные этапы пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. В зависимости от времени введения по отношению к антигену и от дозы могут либо стимулировать, либо блокировать пролиферацию и дифференцировку. Возможно, это обусловлено исходным состоянием уровня митотической активности лимфоцитов [MacManus J.P., Whitfield J.F., 1969], уровня экзогенного и эндогенного цАМФ, Са, ингибиторов и стимуляторов фосфодиэстеразы [Winchoach R. et. al., 1978]. Кроме того, стимулирующее действие гуморальных факторов тимуса на дифференцировку клеток может зависеть от количества на мембране лимфоцитов специфических участков аденилатциклазы [Федоров, Н.А. 1977]. Установлено, что гуморальные факторы тимуса являются инициаторами различных иммунных реакций. Основная их функция - придание лимфоцитам свойств иммунокомпетентности. Это позволило использовать препараты на основе гуморальных факторов в клинической практике при лечении иммунодефицитных состояний [Лопухин Ю.М. и соавт.1974;Тоигаіпе et. al., 1975]. Однако применение гуморальных факторов ввиду их комплексного действия на различные этапы дифференцировки Т - клеток требуют более тщательного анализа состояния иммунокомпетентной системы и разработки дозировок вводимого препарата.
Биохимические исследования антиоксидантных ферментов
Для проведения биохимических исследований (определение интенсивности ПОЛ, антирадикальной активности, активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы - СОД и глутатионпероксидазы — ГП) готовили 10%-ный гомогенат селезенки крыс на 60 мМ раствор КН2РО4 буфера, содержащего 105 мМ КС1, рН 7,4. Для получения супернатанта гомогенат, используемый при определении перечисленных показателей, центрифугировали 15 мин. при 12 тыс.об./мин. Определение общей антиокислительной активности (ОАА)
В основу метода положена регистрация индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) в присутствии перекиси водорода и сульфата железа лежит каталитическое разложение перекиси ионами металлов переходной валентности (реакция Фентона). Образующиеся при этом НО радикалы реагируют с ненасыщенными жирными кислотами и переводят их в свободнорадикальное состояние, тем самым инициируя появление неустойчивые тетрооксидов, распадающихся с выделением кванта света. Для регистрации ХЛ в измерительную кювету хемилюминометра БХЛ-06 М (Нижний Новгород, Россия) вносят 490 мкл фосфатного буфера, 10 мкл центрифугата селезенки и 400 мкл раствора FeS04. Все реактивы готовятся на деионизированной воде. Для инициации процесса в пробу быстро вносят 200 мкл раствора перекиси водорода. Сигнал регистрируется в течение 50 секунд и график о получаемой информации в виде непрерывной кинетической кривой выводится на дисплей компьютера. Интенсивность процесса СР окисления определяется по величине светосуммы за 30 секунд и измеряется в условных единицах. Антиоксидантный потенциал пробы (ОАА) коррелирует с величиной tg угла наклона кривой на стадии максимального убывания вспышки и измеряется в условных единицах.
Для определения антирадикальной активности в гомогенатах селезенки или печени использовали безбелковый супернатант, полученный после осаждения белка из 0,25 мл гомогената фосфорно-вольфрамовой кислотой в соотношении 1:1. После отстаивания при 4-8 С0 (в холодильнике) в течение 3-х часов объем фильтрата доводят до 1,5 мл дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. К супернатанту добавляют 3 мл раствора свободного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ) в этаноле с оптической плотностью 0,7 - 0,75 при длине волны 517 нм. Пробы хорошо перемешивают и через 7 мин добавляют 4 мл толуола и встряхивают. Для разделения фаз смесь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Оптическую плотность верхнего окрашенного слоя измеряют спектрофотометрически при 517 нм против толуола. Контрольная проба содержит 1,5 мл воды. Результаты выражают в эквивалентах мкМ аскорбиновой кислоты, по которой строят калибровочный график. Определение активности глутатионпероксидазы Глутатионпероксидаза катализирует расщепление гидроперекиси третбутила, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион. Реактивы: Трис-HCl буфер, ОД М (рН 8.5), содержащий 0,34 мМ ЭДТА; Трис-HCl буфер, 0,1 М (рН 8.5), содержащий 0,078% азида натрия и 0.01% глутатиона восстановленного; Гидроперекись третичного бутила, приготовленный ex tempore: 5 мкл трет-бутила добавляют к 2.5 мл дистиллированной воды; ТХУ, 20% раствор; Реагент Эллмана, разведенный метанолом до концентрации 10 мМ. В исследованиях используют 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную. Опытная проба содержит 0.1 мл реактива 1 , 0,2 мл центрифугата селезенки и 0.73 мл реактива 2. Стандартная проба содержит 0,1 мл реактива 1 , 0,2 мл центрифугата ткани, 0.73 мл реактива 2 и 0,2 мл ТХУ. Контроль содержит 0,83 мл реактива 1, 0,2 мл центрифугата ткани и 0,2 мл ТХУ. Все пробы инкубируют на водяной бане при температуре 37 в течение 10 минут для подготовки к началу реакции. Реакцию запускают добавлением 0.07 мл гидроперекиси третичного бутила. После 5 минут инкубации при температуре 37 реакцию останавливают 0.2 мл 20% раствора ТХУ, выдерживают 10 минут и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Для регистрации оставшегося глутатиона используют реактив Эллмана. К 2.62 мл реактива 1 добавляют 0.1 мл супернатанта и 0.025 мл реактива 4. Образуется окрашенное соединение с максимум поглощения при 412 нм, которое регестрируют спектрофотометрически. Активность фермента выражают в ммолях GSH/ мин./ мг белка. Определение активности супероксиддисмутазы Принцип метода основан на подавлении образцом восстановления нитросинего тетразолия, происходящего в модельной системе, генерирующей супероксидные радикалы. Образец 10%-гомогената селезенки, приготовленного на 0,15 М Na-фосфатного буфере (рН 7,8), предварительно обрабатывается смесью-хлороформ - этанол (1:2) для освобождения от избытка белка. Осадок центрфугируют 10 мин при 3000 об./мин., в опыт берут 0,05 мл супернатанта. За условную единицу активности СОД принимается то количество образца, которое на 50% тормозит контрольную реакцию. Спектрофотометрическое измерение восстановления нитросинего тетразолия производится при 540 нм. В кювету помещают 2 мл реагента, содержащего 3,1 мг ЭДТА, 25 мг нитросинего тетразолия, 46 мг феназинметасульфата в 50 мл 0,15 М Na-фосфатного буфера (рН 7,8). В контрольную пробу добавляется буфер, не содержащий остальных компонентов. Реакцию запускают, добавляя в кювету 0,1 мл раствора 0,05 мМ раствора НАДН. Через 3 мин отмечают нарастание оптической плотности, которое регистрируют спектрофотометрически. Определение белка в гомогенатах селезенки осуществляли микробиуретовым методом при помощи набора фирмы «Konelab», концентрация белка в гомогенатах селезенки составляла от 14 до 18 г/л.
Влияние аминокислот на экспрессию проапоптозного белка р53 и PCNA в культуре лимфоидной ткани
Выделяют два пути реализации апоптоза: митохондриальный и рецепторно-опосредованный. Митохондриальный путь свойственен патологически изменённым клеткам и опосредуется цитохромом с разрушенных митохондрий. Тогда как рецепторно-опосредованный путь типичен для неповреждённых клеток и опосредуется особыми рецепторами цитоплазматической мембраны. Для определения ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных L-аминокислот, были использованы химические вещества - селективные регуляторы митохондриального и рецепторно-опосредованного путей апоптоза: 2,4-динитрофенол и молочная кислота.
Для избирательной активации митохондриального пути апоптоза используются химические вещества, разобщающие процессы окисления и фосфорилирования, протекающие на внутренней митохондриальной мембране. Хорошо изученным представителем группы разобщителей окислительного фосфорилирования является 2,4-динитрофенол. В определённых концентрациях разобщители окислительного фосфорилирования полностью блокируют синтез аденозинтрифосфата в митохондриях и запускают митохондриальный путь апоптоза. В связи с отсутствием литературных данных о влиянии 2,4-динитрофенола на апоптоз в органотипической культуре селезенки были проведены предварительные опыты, направленные на определение наиболее эффективной концентрации используемого разобщителя окислительного фосфорилирования. Результаты предварительных экспериментов, проведенных в органотипической культуре селезенки крыс, продемонстрировали выраженный проапоптотический эффект 2,4-динитрофенола в диапазоне концентраций от 10мкг/мл до 100 мкг/мл. Культуральная среда с концентрацией 2,4-динитрофенола 10 мкг/мл угнетает рост органотипической культуры селезенки на 24±4% (п = 23, р 0,05). Индекс площади при использовании 2,4-динитрофенола в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл составил -26±6% (п = 22, р 0,05) и -29±3% (n = 22, р 0,05) соответственно.
При введении в органотипическую культуру селезенки смеси, состоящей из эффективных аминокислот (аргинин, глутаминовая кислота) и 2,4-динитрофенола, индекс площади через трое суток культивирования был достоверно больше, чем индекс площади при изолированном применении 2,4-динитрофенола (табл. 2). Например, индекс площади органотипической культуры селезенки при добавлении в культуральную среду смеси из эффективных концентраций L-аргинина и 2,4-динитрофенола, составил 21±6% (n = 22, р 0,05), что достоверно больше индекса площади, полученного при избирательном добавлении в культуральную среду 2,4-динитрофенола в концентрации 50 мкг/мл (—26±6%, n = 22, р 0,05). Аналогичные эффекты снятия угнетающего эффекта 2,4-динитрофенола и увеличения ИП продемонстрированы для валина, треонина, триптофана, тирозина, а также глицина. Значения индекса площади органотипической культуры селезенки молодых крыс через трое суток культивирования в присутствии сверхмалых доз эффективных аминокислот и 2,4-динитрофенола составили: 26±2% для смеси "L-валин + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 57±5% для смеси "L-треонин + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 55±5% для смеси "L-триптофан + 2,4-динитрофенол" (п = 23, р 0,05), 31±2% для смеси "L-тирозин + 2,4-динитрофенол" (n = 23, р 0,05), что достоверно больше индекса площади, полученного при изолированном введении в культуральную среду 2,4-динитрофенола в концентрации 50 мкг/мл (-26±6%, п = 23, р 0,05). Таким образом, можно предположить, что антиапоптотический эффект указанных аминокислот связан с ингибированием митохондриального пути апоптоза. Эксперименты по изучению совместного влияния L-гистидина и 2,4-динитрофенола не продемонстрировали статистически достоверного отличия от индекса площади, полученного при монокомпонентном использовании эффективной концентрации 2,4-динитрофенола. Если индекс площади органотипической культуры селезенки через трое суток культивирования при добавлении 2,4-динитрофенола равен -26±6% (n = 22, р 0,05), то введение в культуральную среду смеси 2,4-динитрофенола с L-гистидином уменьшает индекс площади на 20±4% (n = 23, р 0,05). Таким образом, антипролиферативный эффект L-гистидина, вероятно, связан с активацией митохондриального пути апоптоза.
Изменения зоны роста эксплантантов селезенки в культуре ткани при действии циклофосфана и аминокислот
Выраженное снятие ингибирующего эффекта циклофосфана происходило и при сочетанном применении с АВ-17 на эксплантатах селезенки старых крыс, когда ИП был на 28±5% (п=23, р 0,05) выше контрольного значения ИП (п=18), т.е. в эксплантатах при таком сочетанном действии вилона и цииклофосфана происходила стимуляция роста эксплантатов.
Данные, полученные при исследовании сочетанного действия циклофосфана и АВ-17 на индекс площади эксплантатов старых крыс, отражены в таблице 4, где также видно устранение ингибирующего влияния циклофосфана под действием АВ -17.
Таким образом, при изучении совместного влияния повреждающего агента циклофосфана и пептидов тимуса на развитие эксплантатов лимфоидной ткани получены данные, свидетельствующие о протекторных свойствах пептидов тимуса при ингибирующем влиянии цитостатиков.
В 1-й серии опытов исследовалось изолированное влияние циклофосфана или трипептида пинеалона на развитие эксплантатов в органотипической культуре лимфоидной ткани. Для изучения действия циклофосфана на эксплантаты селезенки 3- и 24-месячных крыс в питательную среду вводили циклофосфан в концентрациях 0. 1-10 мг /мл. Обнаружено, что уже начиная с концентрации 0.1 мг/мл начиналось частичное ингибирование зоны роста, что приводило к статистически достоверному уменьшению ИП на 18± 3% (п=20, р 0,05), по сравнению с контрольными значениями (п=22) у молодых крыс и на 21± 5% (п=25, р 0,05), по сравнению с контрольными значениями (п=23) у старых крыс.
При дальнейших увеличениях концентраций рост эксплантатов ингибировался еще больше. При концентрации циклофосфана 0.5 мг/мл ИП эксплантатов уменьшался уже на 25± 5% (п=21, р 0,05), по сравнению с ИП в контроле (п=23). При введении циклофосфана в культуральную среду в концентрации 1 мг/мл всегда возникало статистически достоверное угнетение развития эксплантатов селезенки крыс обоего возраста, выражавшееся в снижении ИП на 23-30% по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. При изолированном введении в культуру лимфоидной ткани пептида пинеалона наблюдалось увеличение ИП эксплантатов на 25-38% у молодых животных и на 20-32% у старых животных, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.
Во 2-й серии опытов в культуре ткани селезенки от 3-месячных крыс при введении циклофосфана в культуральную среду в концентрации 1 мг/мл развивалось статистически достоверное угнетение развития эксплантатов селезенки крыс на 25±5% (п=21, р 0,05), по сравнению с контрольными значениями ИП (п=23). При иммуногистохимическом исследовании выявлено, что экспрессия проапоптозного белка Р53 увеличилась на 32%±7% (п=22, р 0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (таблица). Изолированное введение в культуральную среду трипептида пинеалона приводило к увеличению ИП на 26%±7%, (п=20, р 0,05), по сравнению с контрольными значениями ИП (п=21). При этом экспрессия проапоптозного белка Р53 уменьшалась на 27± 5%, по сравнению с контрольными эксплантатами. Однако при сочетанном действии ингибирующего агента циклофосфана с пептидом пинеалон в эффективных концентрациях, происходило устранение угнетающего эффекта в эксплантатах. Отсутствие ингибирующего влияния циклофосфана выражалось в том, что происходило увеличение зоны роста эксплантатов селезенки на 4±1% (п=22, р 0,05), что сравнимо с контрольными значениями индекса площади (п=22). Исчезало также увеличение экспрессии белка Р53 , значения площади его экспрессии были на уровне контрольных.
Введение в культуральную среду эксплантатов селезенки от старых 24-месячных крыс циклофосфана в концентрации 1 мг/мл вызывало статистически достоверное угнетение развития на 24±5% (п=20, р 0,05) ниже контрольного значения (п=21), экспрессия белка Р53 при этом увеличивалась. При изолированном введении в культуральную среду пептида пинеалон наблюдалось увеличение ИП на 23%±3%, (п=20, р 0,05), по сравнению с контрольными значениями ИП (п=21), а экспрессия белка Р53 уменьшалась на 24± 3, по сравнению с контролем. При сочетанном действии в культуре ткани селезенки 24-месячных крыс циклофосфана в концентрации 1 мг/мл с пептидом пинеалон в эффективной концентрации, происходило устранение угнетающего эффекта цитостатика в эксплантатах (рис.29). Наблюдалось лишь статистически не достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов селезенки, сопоставимом с контрольными значениями индекса площади. Экспрессии белка Р53 находилась на уровне контрольных значений (табл. 5).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при изолированном действии циклофосфана в лимфоидной ткани эксплантатов селезенки молодых и старых крыс происходит угнетение клеточной пролиферации за счет усиления процессов апоптоза.
Экспериментальные данные показывают, что трипептид пинеалон, состоящий из аминокислот с заряженным боковым радикалом, - кислым у аспарагиновой и глутаминовой кислоты и основным у аргинина, способен устранять ингибирующий эффект циклофосфана в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки молодых и старых крыс, при этом снижается экспрессия проапоптотического белка Р53.
![Влияние дипептидов на адаптивное и половое поведение самцов крыс разного возраста [Электронный ресурс]](/i/i/4471/198033.png "Влияние дипептидов на адаптивное и половое поведение самцов крыс разного возраста [Электронный ресурс] Кудрявцева Татьяна Анатольевна")
