Введение к работе
Актуальность работы. Алкоголизм относится іболее распространенным заболеваниям человека, отягощает или !тся основой различных психосоматических заболеваний. По дан-103, он как причина смерти занимает по частоте третье место, іая только сердечно-сосудистым заболеваниям и элокачествен-швообразованиям.
Проведенные в последние 10-15 лет клинико-генетические ис-івания алкоголизма, включающие изучение близнецов и приемных *, а также экспериментальные работы свидетельствуют о нали-енетических детерминант ряда поведенческих, физиологических зхижческих ответов на этанол, которые имеют потенциальную физиологическую значимость. Результаты современных клиничес-
клинико-генетических исследований алкоголизма и фундаменти . исследований о полигенных заболеваниях показывают, что -олизм относится к мультифакторным болезням, степень прояв-з которых зависит от экзогенных фактороа и генотипических энностей (Анохина И.П.,1976; Морозов Г. В., Иванец Н. Н., 1981; зовГ.В., Анохина И.П. ,1983; Полтавец В.И. ,1985; Иванец Н. Н. ,
НоскаленкоВ.Д. ,1987;Брублееский А. Г., 1988; Семке В.Я., 1988; гнко Л. 9. ,1989;Erwin Y.G.,1976;Bohman М., 1978;Kissin В.,1983; iy R. М. ,1933; Goodwin D., 1984;Eriksson С. J. P., 1984; Alpern H.P.,
Moskalenko V. 0.,1990 и др.)
В экспериментах установлено, что среди общей популяции бе-
или отвергающие его при свободном выборе с высокой и низкой
эантностыо к этанолу (Кампов-Полевой А. Б., 1982; Буров.О. В.,
ринкова Н.М. ,1985). Клинические наблюдения показывают, что
вренцированное отношение и реакции на алкоголь отмечаится и
ковека. При систематическом употреблении алкоголя риск фор-
вания алкоголизма, его тип, тяжесть и прогредиентность, а
э прогноз при лечении различны и в значительной степени эа-
т от типологических особенностей личности (Иванец Н. Н., Иго-
Д. Л. 1983; Полтавец В. И. ,1987). Злоупотребление родителей
тными напитками достаточно часто вызывает у потомства комп-
определенных физических уродств, а также других нарушений,
чая поведенческие, которые являются результатом пренатально-
ействия 'этилового спирта и составляют так называемый феталь-
ный алкогольный синдром (Кирющенков А. П. ,1987;- Jones К. L., Sra 0. И., 1973).
Однако нейрохимические аспекты действия алкоголя, иоле лярно-биологические процессы, протекающие в структурных эдеме тах мозга под влиянием этанола или продуктов его метаболизма также предрасполагающие к потреблении этанола исследованы нед таточно. В еще меньшей мере исследовано, в какой степени мол лярные изменения нейрональных элементов мозга связаны с фарма: логической коррекцией повреждающих факторов. Фармакологичеа коррекция основного симптомокомплекса алкоголизма - синдрома і мены - проводится с использованием производных гамма-аминомас, ной кислоты (ГАМК) и бензодиазепиноа с 1965 r.(Sereny G. ,Kalai 1965; «aim S. С. et.al., 1969; Sellers Е.И. .Kalant H., 1976; Selli E.M. et. al., 1983; 0 Brien J.E. et. al.',1983; . 1983 и др.).
Сам этанол, являясь-депрессантом центральной нервной сие мы по своим фармакологическим эффектам подобен транквилизатор: Имеются аргументированные свидетельства того, что именно анксі литический эффект этанола имеет очень важное значение в разви' привыкания и алкогольной зависимости (Кампов-Полевой А.Б. ,191 Роханец В. В.,1988; Goldstein 0. В.,1978; Snyder S,,Keeler М.Д! Tallman J.F. et. al., 1986; Deltrlch R. A., 1989 и AP-).
Успехи в изучении роли ГАМК в центральной нервной системі в-действии бенэодиаэепиновых транквилизаторов (БЗД) а также э' нола привели к установлений связи ТАМКа- и БЗД^эргической сисі а также действием этанола и функционированием ГАЖа-бензодиазі нового рецепторного комплекса {Braestrup С,Met.al.,-1977; Mohl H.et.al.,1978; Costa E. et. al., 1979; 01 sen R. W. ,1982; TlckuM.I 1983; Rastogy S.K.et. al., 1.986; Allan A.M., Harris R. A., 1986; ! dak P.O.et.al., 1986; PrUchett D. et.al., 1938; TickuH.K., 19( Freund G., Ballinger W. E. ,1989; Buck K. J., Harris R. A., 1990; Aguayo l. G., 1990;Karp l. et.al. ,1991; Korpi E. R. et. al., 1992 и і Однако характер этой связи остается малоизученным.
Исследования ряда авторов (Hemmingsen R..Braestrup С.,19( Mhatre М. et.al., 1988; Ticku Н.К., Kulkarni 5. К., 1988; Buck К.» Harris R. A. ,1990) показали специфические изменения ГАМКа- и Б: рецепторов у чувствительных к алкогол» крыс. В работах 'други) исследователей (Liljequist S. .Tabakoff В. ,1985; Rottenberg Н.,
1985; Rastogy S.K, et. al.,1986; de Vries 0. 0, et. al., 1987;) не выявлено изменений свойств центральных БЗДР при хроническом потреблении этанола.
Исследования влияния этанола и ГАМКа-антагонистов, а также обратных агонистов к бензодиазепиновым рецепторам на поведение мышей с различной чувствительность» к этанолу указывает на возможную роль генетических различий в регуляции хлорного канала, сопряженного с ГАМКа/бЗДР-рецепторним комплексом, в формировании различной чувствительности к этанолу и скорости развития толерантности (Москаленко В. Д. ,1987; McClearn G. і., KaMhana R., 1981; Uusi-OukaHM.,Котрі E. R. ,1991 и др.).
Единичные исследования свойств 63ДР в аутопсийной ткани мозга больных алкоголизмом, не выявили значительных изменений аффинности и плотности бензодиаз-епиновых мест связывания цент- . рального типа по сравнение с контрольной группой, но выявили изменение-плотности мест специфического связывания ЗН-РК 11195 -лиганда к периферическим БЗДР - в мозжечке, фронтальной коре (Tran V.T. et.al., 1981; Freund G., Ballinger W.E. ,1988; 1989; Korpl E.R. et.al., 1992).
В связи с этим представляется актуальным дальнейшее изучение механизма действия этанола, формирования влечения к нему на уровне- бенэодиазепиноаых рецепторов центрального и периферического типов в центральной нервной системе человека и крысы, что может способствовать дальнейшему выяснению патогенеза этого заболевания, дать клкч к поиску новых перспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма.
В настоящей работе приведены результаты оригинальных экспериментальных исследований свойств бензодиазепиновых рецепторов головного мозга у крыс с различной степенью предпочтения к этанолу, у потомства крыс, перенесших алкогольную интоксикацию во внутриутробном периоде развития, а также в аутопсийной ткани различных областей головного мозга пациентов, хронически алкоголиэиро-вавшихся при жизни (по данным анамнеза), с попыткой раскрыть возможные механизмы действия алкоголя.
Учитывая определенные недостатки проведенных в этом направ лении экспериментальных исследований - небольшой период хронического воздействия этанола, исследование рецепторов только одного подтипа, работа с общей популяцией крыс без учета предпочтения к
-> -
этанолу, недостаточное исследование аутопсииного материала мозга человека - в настоящем исследовании были использованы следующие основные подходы: 1) использование экспериментальной модели хронического воздействия алкоголя на крыс, учитывающей генетические факторы предрасположенности к.развитию влечения и зависимости от этанола; 2} длительность воздействия этанола (в течение 6 мес.) - фактор, приближающий экспериментальную модель развития алкоголизма у животных к течению алкоголизма у человека; 3) сравнительное исследование свойств БДР в мозгу крыс с различной предрасположенностью к алкоголю; 4) изучение эффектов хронического воздействия этанола на взрослый мозг крысы и развивающийся.мозг потомства крыс; 5) исследование БДР различных подтипов - "центрального" и "периферического" в различных субклеточных фракциях: синаптосомах и митохондриях соответственно; 6) изучение влияния алкоголизации на свойства БДР в различных структурах мозга человека. ЦЕЛЬ иосновные задачи исследования.'
Целью настоящей работы явилось исследование свойств бензодиазе- , Пановых рецепторов центрального и периферического типов в центральной нервной системе человека и крысы в норме и под влиянием алкоголизации. >
В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:-
-
изучить свойства БЗДР в коре головного мозга у крыс, предпочитающих этанол и отвергающих его;
-
исследовать влияь..е хронического воздействия этанола на свойства БЗДР в коре головного мозга у крыс, предпочитающих эта-
' нол;
3) изучить свойства БЗДР в различных областях головного мозга
потомства крыс в норме И под влиянием этанола в пре- и постна-
тальный период развития;
. 4) оценить состояние БЗДР в различных структурах головного , мозга человека постмортально в контроле и вследствие алкоголизации;
-
дать сравнительную оценку действия этанола на бенэодиа-эепиновые рецепторы головного мозга человека $ крысы;
-
рекомендовать использование новых данных в. поиске перспективных препаратов для профилактики, ц лечения алкоголизма.
Научная' пошла исследования.
Впервые показано, что свойства бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов в коре головного мозга крыс, предпочитающих этанол, отличны от свойств БЗДР у крыс, от-' вергающих этанол. Установлено, что хроническое воздействие этанола приводит к. значительному снижению аффинитета 63ДР, центрального и периферического типов и увеличений числа мест специфического связывания периферического типа у "многопьющих" <рыс. Выя?лены изменения в свойствах БЗДР головного мозга у потомства крыс, подверженных воздействию этанола в пре- и постма-гальный период развития по сравнение с контролем. Показано на іутопсийном материале мозга, человека, что вследствие алкоголиза-іии изменяются свойства 5ДР обоих типов в различных областях юэга. Установлено, что изменения свойств 5ДР головного мозга іеловека и крысы под влиянием алкоголизации однонаправлены, что южет свидетельствовать об общности механизмов биологического .ействия этанола, аучно- практическая значимость работы.
Выявленные изменения свойств бензодиазепиновых рецепторов в оловном мозге человека и крысы под влиянием алкоголизации, а акже особенности 63ДР мозга крыс, предрасположенных к потребле-аю этанола, позволяют рассматривать их участие в формировали алкогольной мотивации, развитии алкоголизма, вовлечение их в дин из основных механизмов Действия этанола, реализации его эф-гктов.
В связи с этим.возможно использование новых данных в поиске рспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма, характеристик радиолигандного связывания в качестве- одного из іказателей в системе поиска и отбора химических соединений ан-іалкогольного профиля. Основные положения, выносимые на защиту:
свойства бензодиазепиновых рецепторов головного мозга крыс, аметрально различающихся между собой по степени предпочтения анола на предпочитающих и отвергающих этанол, различны;
хроническое воздействие этанола вызывает изменение Свойств
. бензодиаэепиновых рецепторов центрального и периферического типов в головном мозгу человека и крысы;
влияние этанола о пре- и постнатальный период развития потомства крыс приводит к значительным изменениям свойств БЗДР в различных структурах головного мозга крысят;
свойства бенэодиазепиновых рецепторов в различных структурах головного мозга человека и крысы различны;
изменения свойств бенэодиазепиновых рецепторов головного мозга человека и крысы однонаправлены;
возможность участий БЗДР в формировании алкогольной мотива ции, вовлечения в один из механизмов действия этанола, реализации его эффектов.
Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертации доложены на научных отчетных сессиях НИИ ПЗ ТНЦ СО РАЖ (Томск, 1S85, 1988 гг.), на Всесоюзной конференции с международным участием "Медике-биологические аспекты психического здоровья" (Томск, 1990 г.), на научно-практических конференциях НИИ ПЗ ТНЦ СО РАЖ (Томск, 1988, 1991 гг.), на Всесоюзной с международным участием научно-практической конференции "Психическое здоровье -региональные аспекты" (Владивосток, 1992), на Симпозиуме с меж -дународным участием "Современные проблемы клинической и экспериментальной психоней'роиммунологми" (Томск, 1992)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, список которых приводится в конце автореферата; 6 рационализаторских предложений.
Обьем и структура диссертации. Материалы диссертации, изложены на страницах, иллюстративный материал содержит( таблиц и рисунков. Диссертация состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждения), выводов и приложения.
Список литературы включает источников отечественных и зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '
Исследования свойств бензодиазепиновых рецепторов: максимально выявляемую плотность и аффинность мест специфического свя-іьюакия селективных лигандов проводили в ткани головного мозга экспериментальных животных - крыс линии Вистар и в аутопсийном материале мозга человека, полученного при срочном вскрытии посмертно вследствие острой сердечной недостаточности в НИИ кардиологии ТНЦ АМН СССР, Всего было исследовано 42 образца ткани головного міззга человека и 2ІЇ образцоо мозга крыс. -
Методической основой изучения роли бвнэодиаоепиноеой рецеп-торной системы мозга в развитии алкоголизма в эксперименте послужила модель, учитывающая как стадийность в развитии болезни, так и генетические факторы предрасположенности к развитии влечения и зависимости от этанола. Модель разработана О. В. Буровым и соавт. в 1960 г. в НИИ фармакологии РАМН (г.Москва).
Для определения храктеристик бензодизепиновых мест связывания в ткани головного мозга крыс а различных группах по окончании экспериментального периода крыс декапитировали и мозг извлекали немедленно. Кору головного мозга и другие структуры (мозжечок, свол, передний мозг у крысят) отделяли и заморажиэали в жидхом азоте, образцы хранили при температуре - 80 С. Грубую фракцию синаптосомальных мембран получали из образцов тканей головного мозга взрослых крыс и потомства крыс.
Препараты мембран хранили при t * - 80 С. Связывание ЗН-флв-нитразепама (84 Ки/ммоль,"Амершам", Англия) проводили при t » О С в.течение 60 мин. по методу, описанному Monler et.al., 1978 а нашей модификации (Кладницкий А.В.,Мухин А.Г. ,1984 и др.)
Неспецифическое связывание определяли в присутствии нерадиоактивного диазепама в концентрации 10 мкМ. Связанный лиганд отделяли фильтрацией через GF/8 фильтры ("Whatman", Англия).
Для исследования свойств су5популяции ЕЗДР головного мозга дифференцированно выделяли и изучали БЗДР центрального и периферического типа коры головного мозга крыс в исследуемых группах. Изучение характеристик связывания бензодиазепиновых рецепторов в коре головного мозга крыс центрального и периферического типов проводили в синаптосомальной и митох*ндриальной фракциях соот- ветста'енно. Препаративное разделение на фракции проводили we-
тодом центрифугирования с использованием комбинированного флота-
ционно-седиментациониого градиента плотности" (по 0. Н. Oones и
A. I.Matus, 1974) в нашей модификации, направленной на оптимиза
ция условий лиганд-рецепторного связывания : связывания селактив-
ных лигандоэ.к бензодиазепиновьм рецепторам с синаптосомальными .
и митохондриальными мембранами ткани головного мозга.
После центрифугирования материал распределялся в качестве осадка на границе каждой фазы: верхний слой - миелин, средний слой - скнатссомальныа мембраны и нижний слой - митохондриальные мембраны. Фракции отбирали, замора*"<вали и хранили при t - - 80 С.
Изучение свойств центральных мест связывания бензодиаэепи-
нов проводили используя селективный лиганд ЗН-флюнитразепам (85
Ки/ммоль, "Амершам", Англия) в синапсотомальной фракции мембран.
Изучение свойств периферических мест связывания бензодиа-^епиноа проводили в митохондриальной фракции мембран коры головного мозга крыс с использованием селективного лиганда 3H-Ro 5-4864 (90 Ки/ммоль, NEN, США).
Изучение характеристик бенэодмаэепиновых мест связывания центрального и периферического типов в синаптосомальной и митохондриальной фракциях некоторых структур мозга человека (кора больших полушарий, кора мозжечка, головка хвостатого ядра) проводили с использованием селективних лигандов: ЗН-флюнитразепама (85 Ки/ммоль,"Амершам", Англия) иЗН-РК Ш95 (83,7 Ки/ммоль, "HEN", США) соответственно..
Образцы указанных структур головного мозга человека бмли' взяты посмертно не позднее, чем в течение 6 часов после наступления смерти вследствие острой сердечной недостаточности, затем их немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре- » - 80 С. Соответствующие фракции синаптосом и митохондрий получали методом препаративного центрифугирования исследуемых образцов в градиенте сахарозы, указанному выше; Белок определяли по методу 8randford (1976).
здмоактивный анализ количества сві.^анного лиганда проводили в сцинтилляционном бета-счетчике "Rak-beta" (LK&, Швеция). Константу диссоциации (Kd) и максимально выявляемое число пест специфического связывания (Б макс) определяли методом ана-
..g -
лиза кривых насыщения в координатах Скзтчарда. Первый показатель выражали в нН, второй в фмоль/мг Белка. Статистичская достоверность изменений изученных показателей вычислялась по критерию КолмаГорова-Смирнова и t-критерию Стьюдента.
