Содержание к диссертации
Введение
1. Материалы 55
1.1. Химические реактивы и ферменты 55
1.2. Буферы 56
1.3.Среды 56
1.4. Бактериальные штаммы, векторы и плазмиды использованные в работе 57
1.5. Принадлежности и приборы 58
2. Методы 60
2.1.Методы генной инженерии и микробиологии 60
2.2.Выделение и очистка белков 67
2.3.Выделение и очистка РНК. 69
2.4. Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков. 72
2.5. Получение и анализ РНК-белковых комплексов in vitro 74
2.6. Получение и кристаллизация РНК-белковых комплексов 75
3 . Получение и кристаллизация рнк-белковых комплексов для структурных исследований 76
3.1 .Конструирование фрагментов мРНК. 77
3.2 Клонирование генов специфических фрагментов мРНК. 81
3.3. Получение фрагментов мРНК в препаративных количествах. 83
3.4 Определение сродства фрагментов мРНК к рибосомному белку 84
3.5. Выделение и очистка рибосомных белков Ы 85
3.6. Приготовление комплексов LI-РНК для кристаллизации 87
3.7. Кристаллизация РНК-белковых комплексов белка L1 со специфическими фрагментами мРНК 88
3.8. Структура комплексов MjaLl-мРНК и TthLl-мРНК. 90
3.9. РНК-белковое узнавание. 93
4. Получение мутантных форм белка ы с измененными рнк-связывающими свойствами 95
4.1. Стратегия сайт-направленного мутагенеза. 98
4.2. Тестирование термостабильности. 98
4.3. Взаимодействие мутантных форм белка Ы со специфическими фрагментами 23SрРНК и мРНК. 99
4.4. Кристаллизация мутантных форм белка MjaLl с измененными РНК-связывающими свойствами. 104
Выводы 108
- Буферы
- Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков.
- Определение сродства фрагментов мРНК к рибосомному белку
- Взаимодействие мутантных форм белка Ы со специфическими фрагментами 23SрРНК и мРНК.
Буферы
лизирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl (рН25с=7.6), 800 мМ NaCl, 100 мМ MgCb, 5мМ Р- меркаптоэтанол, 0.1 мМ PMSF; буфер для образцов для электрофореза в присутствии ДСН (5-кратный): 60% сахароза, 10% ДСН, 300 мМ Трис-HCl (рН25с =6.8), 10% р-меркаптоэтанол; электродный буфер для электрофореза в присутствии ДСН (10-кратный): 1.9 М глицин, 250 мМ Трис-HCl (рН25с =8-5), 1% ДСН; ТБЭ буфер (10-кратный): 0.9 М Трис, 0.9 М борная кислота, 25 мМ ЭДТА, (рН25с =8.3); ТА буфер (10-кратный): 0.4 М Трис, 0.4 М уксусная кислота (рН25с =8.0); ТАЕ буфер: 40мМ Трис-ацетат, рН 8.0; 0.2мМ ЭДТА; ТЕ буфер: ЮмМ Трис-HCl, рН25с =8.0; 1мМ ЭДТА; ТВ буфер: Hepes ЮмМ (рН=6.7), СаС1215мМ, КС1250мМ, МпС12 55мМ; TFB буфер: K-Mes ЮмМ (рН=6.3), СаС12 40мМ, КС1 ЮОмМ, МпС12 45мМ, гексамин СоС13 ЗмМ. 1.3.Среды LB: 1% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl; SOB: 2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, ЮмМ NaCl, 2.5 мМ КС1, ЮмМ MgCl2, 10MMMgSO4; Среда для выращивания ауксотрофных по метионину штаммов: 17 мМ Na2HP04, 22 мМ КН2Р04,19 мМ NH4C1, 8.5 мМ NaCl, 2 мМ MgS04, 0.2 мМ СаС12, 1 нМ FeCh, 0.4% глюкозы, витамины (биотин, фолиевая кислота,никотинамид (РР), D- пантотенат (Вз), перидоксаль (Вб), холинхлорид - по 0.1 мг/л, рибофлавин - 0.01 мг/л, тиамин - 0.05 мг/л), аминокислоты - по 40 мг/л каждой, селенометионин - 40 мг/л. 1.4. Бактериальные штаммы, векторы и плазмиды использованные в работе Штаммы Штамм Е. coli Генотип Ссылка TG2 Діас-pro, supE, thi", г", recA, F traD36, Gibson (1984) proA+B+,ladq,lacZAM15 B834(DE3) F ompT hsd SB (ГЬ" ть") gal, dcm, met Wood (1966) Содержит ген Т7-11ЫА-полимеразы в хромосоме, находящейся под контролем lacUV-промоторов, индуцируемых с помощью IPTG BL21(DE3) F ompT rb"mb- (X СІ857 indl Sam7 nin5 Studier & Moffatt (1986) lacUV7genel) Содержит ген Т7-11ЫА-полимеразы в хромосоме, находящейся под контролем lacUV-промоторов, индуцируемых с помощью IPTG Векторы Плазмида Устойчивость Размер Источник, ссылка pETl la-PL Ампициллин 5,7kb pETlla (Studier et al, 1990), модифицированный (G. Baier LaJolla Institute, California, USA): вставлен полилинкер: BamHI-Notl-XhoI-Sall. pLysS Хлорамфеникол 4,9kb pACYC (184) (Studier, 1991) pUBS520 Канамицин 5,4kb Bnnkmann et al. (1989); Вектор содержит ген для tRNAArg AGA/AGG из E. coli под промотором, индуцируемым IPTG. PUC18/19 Ампициллин 2,7kb Norrander et ah, 1983 Yanisch-Perrone/a/., 1985 Рекомбинантные плазмиды Плазмида pMjaLl .4 pACA-Ll pTthL1.4 PTthLlK127M.4 Описание 0,7kb PCR-фрагмент (NdeIPCR/XhoIPCR), содержащий ген белка LI из M.jannaschii 0,7kb PCR-фрагмент, содержащий ген белка L1 из T.thermophilus 0,7kb PCR- фрагмент (NdeIPCR/ HindIIIPCR), содержащий ген белка LI из T.thermophilus 0,7kb PCR- фрагмент (NdeIPCR/ HindIIIPCR), содержащий ген белка LI из T.thermophilus с заменой Lys 127 на Met Ссылка Kohrer etal. (1998) Osina etal. (1995) В данной работе В данной работе Фирменные наборы для выделения ДНК - QIAquick PCR Purification Kit, QIAquick Gel-Extraction Kit, QIAprep Spin Miniprep/Maxiprep Kit. Для диализа образцов белка и РНК использовали диализные мембраны на 10 кДа фирмы Serva (Германия). Для фильтрования применяли нитроцеллюлозные фильтры MILLIPORE (США) и стекловолокнистые фильтры GF/A Whatman (Великобритания).
Хроматографические процедуры проводили, используя хроматографическую систему Econo System (BIO-RAD, США). Для измерения оптической плотности белков и РНК использовали спектрофотометр "Hitachi 150-20" (Япония). Амплификацию фрагментов ДНК методом ПЦР осуществляли с использованием амплификатора Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Сингапур). Электрофоретический анализ образцов белка, РНК и РНК-белковых комплексов осуществляли, используя комплект оборудования для электрофореза Mini Protean II (BIO-RAD, США) и источник питания Biometra Р-25 (Biotron, Германия). Для разрушения клеток использовали ультразвуковой дезинтегратор Sonic Dismembrator 550 (Fisher Scientific, США) и French Press (Thermo Electron Corporation, Англия). В работе использовали низкоскоростные центрифуги К-23, К-24 (Janetzky, ГДР), J2-21 (Beckman, США), BR4i (Jouan, Франция), eppendorf 5415С и Mini Spin (Eppendorf, Германия), высокоскоростную центрифугу TL-100 (Beckman, США), весы ВЛКТ-500-М, ВЛА-200-М (СССР), SA 80 (Scientech, США), термостат MLW UH (MLW, ГДР), твердотельный термостат БИС 205 (БИС, Россия), термостатированный шейкер innova 4000 (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, США), ультрафиолетовый трансиллюминатор Cole-Parmer (Cole-Parmer Instrument Company, Франция), магнитные мешалки ММ2А (ЧССР), рН-метр Accumet 20 (Fisher Scientific, США). 2.1.Методы генной инженерии и микробиологии 2.1.1.Выделение и очистка плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК в препаративных количествах проводили методом щелочного лизиса. Отдельную колонию инокулировали в 3 мл среды LB с ампициллином и растили в течение дня при 37С. Инокулировали выращенные клетки в 1 л среды LB с ампициллином и растили в течение ночи при 37С. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин при 4С и ресуспендировали в 10 мл буфера ТЕ, содержащем лизоцим в концентрации 2 мг/мл. Затем добавляли 20 мл лизирующего раствора, содержащего 0.2 М NaOH, 1% ДСН и перемешивали, аккуратно переворачивая колбу, до просветления суспензии. После этого добавляли 15 мл ЗМ ацетата калия (рН5.2), аккуратно перемешивали и инкубировали во льду 15 мин, после чего центрифугировали (14000g, 15 мин, +4С).
Супернатант отбирали, и нуклеиновые кислоты осаждали добавлением равного объема изопропанола и инкубацией при комнатной температуре в течение 15 мин. После центрифугирования (14000g, 10 мин) при комнатной температуре, осадок промывали 80% этанолом и высушили 10 минут в вакуумном шкафу. Осадок ресуспендировали в 5 мл буфера ТЕ и добавляли РНКазу А до концентрации 20 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при +37С. ДНК осаждали прибавлением 1/10 объема ЗМ ацетата калия рН 5.2 и 3 объема этанола. Осадок растворяли в 1 мл буфера ТЕ. Для очистки ДНК от белков использовали фенольную депротеинизацию. Раствор ДНК смешивали с равным объемом фенола и тщательно встряхивали до образования однородной эмульсии. Для разделения фаз эмульсию центрифугировали (14000g, 2 мин). Депротеинизацию проводили 5-6 раз до полного исчезновения интерфазы. Водную фазу отбирали и смешивали с равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1). После перемешивания и центрифугирования водную фазу отбирали, а затем смешивали с равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24/1) и центрифугировали. К верхней фазе добавляли равный объем 13% раствора ПЭГ 6000, содержащего 1.6М NaCl. Затем смесь инкубировали 1 час во льду. После центрифугирования (14000g, ЗОмин, +4С) и тщательного удаления раствора ПЭГ, осадок ДНК промывали 80% спиртом и растворяли в деионизировашюй воде. Полученную плазмиду анализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле. В аналитических количествах плазмиды выделяли из клеток Е. coli штамма TG2, выращенных на питательной среде LB в присутствии селективного антибиотика, с использованием QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH, Germany). Процедура выделения плазмиды с использованием QIAprep miniprep основана на щелочном лизисе бактериальных клеток с последующей абсорбцией ДНК на силике в присутствии высокой соли (QIAprep Miniprep Handbook, March 2003). Очищенные плазмиды хранились при 4С.
Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков.
Состав геля: акриламид (при длине РНК 30-60 нуклеотидов - 15%, а при длине 60-150 - 10%; сшивка 19:1), 8М мочевина, IX ТАЭ. Использовали электродный буфер IX ТАЭ. Образцы растворяли в буфере, содержащем IX ТАЭ буфер, 8 М мочевину, 0.1% БФС, и наносили на гель. Режим электрофореза 150 В до выхода БФС. После окончания электрофореза гель красили в течение 3-5 минут при комнатной температуре в растворе, содержащем 0.25% толуидина, 5% уксусную кислоту, 10% этанол. После окрашивания гель отмывали в холодной воде. Для визуализации небольших количеств РНК гель красили бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и анализировали под ультрафиолетовым светом. Окраска толуидиноам менее чувствительна (50 нг/полосу), чем бромистым этидием (10 нг/полосу), но гели, окрашенные толуидиновым синим могут быть высушены и сохранены. Р-меченные фрагменты РНК (400000-450000 срт/образец) визуализируются с помощью авторадиографии. Время экспозиции рентгеновской пленки (Hyperfilm MP, Amersham Pharmacia Biotech) составляло 3-4 минуты. 2.3.5.Нативный электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ. Электрофорез РНК и РНК-белковых комплексов проводили в пластинах размером 8x12 см в аппарате фирмы Bio-Rad. Использовали 10% акриламидный гель (сшивка 19:1), содержащий 5мМ MgCb и 1хТБ буфер. В качестве электродного буфера использовали однократный ТБ буфер. Образцы растворяли в 30% сахарозе, приготовленной на однократном ТБ буфере, содержащей 0.25% бромфенолового синего. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 100 В, гели окрашивали 0.25% раствором толуидина в 10% этаноле и 5% уксусной кислоте. 2.4. Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков. 2АЛ. Определение концентрации нуклеиновых кислот Для определения количества нуклеиновой кислоты в образце используют принцип абсорбции ультрафиолетового света при 260нм. Измерение абсорбции проводилось на спектрофотометре "Hitachi 150-20" (Япония). Концентрации определялись по следующим формулам: Двуспиральная ДНК [мкг/мл] разведение х 50 OD260 РНК [мкг/мл] разведение х 40 х OD260 Одноцепочечная ДНК/олигонуклеотиды [мкг/мл] разведение х 30 OD260 Для оценки качества образца необходимо так же измерить поглощение при 230 и 280нм, чтобы оценить вклад полисахаридов и белков.
Оптимальное соотношение оптических плотностей для РНК при 230,260 и 280 нм составляет 1:2:1. 2.4.2. Определение концентрации белка. Для более точной оценки концентрации белка были использованы спектрофотометрический и колориметрический методы. 2.4.2.1. Определение концентрации белка с помощью абсорбции в ультрафиолетовом свете (280 нм). Ароматические аминокислоты абсорбируют ультрафиолетовый свет при 280 нм. Абсорбция зависит от количества Туг и Тгр в белке (и совсем мало от количества Phe и дисульфидных связей). Поэтому поглощение Аг8о сильно варьирует в различных белках. Закон Beer-Lambert гласит: А (поглощение) = є С I Где е- коэффициент экстинкции, с- концентрация в моль/литр и /- длина оптического пути в см. Поэтому, если известен коэффициент экстинкции, то концентрация определяется напрямую (Kirschenbaum, 1975). Реальное значение коэффициент экстинкции рассчитывается по следующей формуле: А2го (1 мг/мл) = (5690л w + 1280«у + 120лс)/М = є; где «w, «у, и пс количество остатков Тгр, Туг и Cys в полипептиде массой М; 5690, 1280 и 120 - коэффициенты экстинкции для этих остатков, соответственно (Scopes, 1974). 2.4.2.2. Калориметрическое определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли с помощью реагента фирмы Bio-Rad. Определение концентрации определялось в соответствии с протоколом Bio-Rad Microassay (Bio-Rad Protein Assay Handbook, 1994). Обычно в качестве стандарта использовался рибосомный белок (из того же семейства белков) с известной концентрацией. Иногда в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин, поставляемый вместе с набором Bio-Rad Protein Assay Kit. Калибровочные кривые строились с учетом рекомендаций производителя. 2.5. Получение и анализ РНК-белковых комплексов in vitro. 2.5.1.Эксперименты по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах. В данных экспериментах смешивали следовые количества радиоактивно меченой РНК с белком в различных концентрациях, а затем смесь фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр. При условии использования следовых количеств РНК Kd может быть определена по следующей формуле: Rb Ro_n ібелокі "tot KfX [белок] где Re - эффективность сорбции; Rb - количество меченой РНК, связавшейся с фильтром в присутствии белка; Ro - количество меченой РНК, связавшейся с фильтром в отсутствии белка oH);Rtot - общее количество РНК, наносимое на фильтр (с поправкой на фон). Для определения Kd использовали ТМК- С1 буфер, содержащий 50 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 20 мМ MgCl2, 350 мМ КС1, 1 мМ р-меркаптоэтанол и 0.04% BSA. Белки L1 и РНК инкубировались отдельно в течение 5 минут при 65С и 45 минут при 40С в буфере для связывания для разворачивания структур обоих партнеров. В общем объеме 50 мкл смешивали фиксированное количество РНК (12000-15000 ерш) с увеличивающимся количеством белка (10 пМ-10мкМ) и инкубировали 15 минут при 40С и затем 15 минут при 0С. РНК-белковые комплексы сорбировали на нитроцеллюлозные мембраны (Protran ВА83, Schleicher&Schuell) с помощью фильтрации. Фильтры промывали 350 мкл буфера для связывания.
Радиоактивность измерялась на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Beckman LSI801). Фоновое значение сорбции РНК в отсутствии белка (в норме 1.5-7% от общего количества РНК) вычиталось при построении графиков и расчете Kd. Каждая кривая связывания строилась как минимум из двух экспериментов с помощью нелинейной регрессии с использованием пакета программ "SPSS 11.5.1 for Windows" (SPSS Inc., 2002). Сходный метод может быть использован и для измерения стехиометрии РНК-белкового комплекса, только тогда РНК и белок должны быть в стехиометрических количествах. Если более одной молекулы белка связывается с одной молекулой РНК, то это указывает на неспецифическое связывание или на то, что часть белка находится в неактивной форме. Однако с помощью метода связывания на фильтрах нельзя сказать точно, что именно явилось причиной, но анализ изменения подвижности комплексов в геле может разрешить эту проблему (Kjems et ah, 1998). Анализ изменения подвижность в геле основан на разнице подвижностей РНК и РНК-белковых комплексов в ПААГ в нативных условиях (Draper et al., 1988). Увеличенный размер и положительный заряд РНК-связывающего белка дает разницу в подвижности. Данный метод дает возможность напрямую оценить стехиометрию РНК-белкового комплекса. Анализ изменения подвижности комплексов рибосомного белка L1 с РНК проводились в 10% ПААГ (акриламид:бис-акриламид; 19:1) в 1хТАЭ буфере, как описано в главе 2.2.3.3. 2.6. Получение и кристаллизация РНК-белковых комплексов. Оптимальные условия зарождения и роста кристалла очень сложно предсказать, поэтому скрининг является очень эффективным и быстрым методом проверки широкого спектра условий (рН, соли и растворители) в малом объеме макромолекулярного препарата. Для поиска условий кристаллизации в данной работе были использованы следующие наборы: Crystal Screen kit и Crystal Screen 2 kit (Hampton Research Corp., USA; Jankarik and Kim, 1991, Cudney et al., 1994), содержащий 98 уникальных реагентов; Natrix kit (Hampton Research Corp., USA; Scott et al, 1995), содержащий 48 уникальных реагентов; и PEG/ion screen kit (Crystallization Research Tools, Hampton Research, 2001), содержащий 24 уникальных реагента.
Определение сродства фрагментов мРНК к рибосомному белку
Сродство фрагментов мРНК к рибосомному белку L1 определяли с помощью экспериментов по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах. Для этого фрагменты мРНК метили с использованием а-[ P]-UTP. Стандартная кривая связывания изображена на рисунке 43. Все использованные нами для кристаллизации фрагменты мРНК связывали MjaLl так же хорошо, как и более длинные фрагменты мРНК. При использовании в экспериментах по связыванию стартового фрагмента мРНК (рис.39, А) процент насыщения был очень низким (20-25% от общего количества РНК), поэтому этот фрагмент не был использован для кристаллизации. В работе по кристаллизации РНК-LI комплексов использовались белки из термофильных организмов (MjaLl и TthLl). Для каждого из этих белков был выделен дикий тип и белок с заменами метионинов на селенометионины (для определения фаз при решении структуры методом мульти волновой аномальной дисперсии). Гены белков L1 из M.jannaschii и T.thermophilus экспрессировались в системе Штудиера (Studier et al, 1990). В качестве штамма-хозяина использовались клетки Е. coli BL21(DE3). Для экспрессии архейных белков эти клетки содержали плазмиду pUBS520. Экспрессионные векторы pMjaL1.4 (Kohrer et al, 1998) и pACA-Ll (Osina et al, 1995) несли гены белков MjaLl и TthLl, соответственно. Белки выделялись, как описано в главе М 2.2.1 (рис. 44). Иногда после хроматографии на смоле CM-Sepharose препарат белка не имел примесных белков Е. coli, но содержал примесь нуклеиновых кислот, от которых мы освобождались используя хроматографию на смоле Heparin-Sepharose. Использование такой методики (полу-аффинная хроматография) позволяет получить препарат белка с чистотой до 98% (рис. 45). В рентгеноструктурном анализе для решения проблемы фаз при определении пространственной структуры белков часто нужны кристаллы, содержащие тяжелые атомы.
Один из методов введения их в кристалл - замена метиониновых остатков на селенометиониновые в аминокислотной последовательности белка. В данной работе были выделены белки, в которых метионины заменены селенометионинами с целью использования аномального рассеивания на нескольких длинах волн (MAD) для определения фаз. Для выделения модифицированных белков с заменами метионинов на селенометионины использовали штамм-суперпродуцент Е. coli B834(DE3) ауксотрофный по метионину. Биомасса была выращена на минимальной среде, содержащей селенометионин. Во все растворы добавляли 2 мМ DTT для предотвращения окисления селенометионина. В ходе экспериментов по кристаллизации были использованы не только гомологичные, но и гибридные комплексы, содержащие РНК и белок из разных организмов. Использование гибридных комплексов возможно, поскольку белки L1 из разных организмов структурно и функционально взаимно заменимы (Baier et al., 1989; Hanner et al., 1994). Это указывает на то, что РНК-связывающий участок на белке и белок-связывающий участок на РНК структурно консервативны. Более того, гибридные комплексы иногда обладают большей способностью кристаллизоваться, чем гомологичные комплексы. Так кристаллы комплекса белка S8 из M.jannaschii с фрагментом рРНК из T.thermophilus, а так же комплекса белка L1 из Sulfolobus acidocaldarius (SacLl) с фрагментом рРНК из T.thermophilus отражали рентгеновские лучи лучше, чем кристаллы гомологичных комплексов из T.thermophilus (Garber et al., 2002; Nikulin et al., 2003). Причина, по-видимому, в том, что комплексы, содержащие архейный белок, более стабильны. Первичный поиск условий кристаллизации вели с помощью набора Natrix (Hampton research Inc., USA). Кристаллизация велась методом диффузии паров в висячей капле. Обычно смешивали 2 мкл комплекса Ll-мРНК с 2 мкл реагента и уравновешивали против резервуара, содержащего тот же самый реагент из набора Natrix. Все кристаллы появлялись в таких условиях, когда осаждающий агент состоял из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и моновалентных ионов. После получения первых мелких кристаллов мы оптимизировали условия, меняя концентрации каждого компонента в капле, немного изменяли рН и температуру, а так же вносили различные добавки (соли тяжелых металлов, глицерин, МПД и т.д.). Условия кристаллизации комплексов представлены в таблице 2. Условия роста кристаллов достаточно близкие. Во всех случаях мы использовали в качестве осадителя ПЭГ 8 или 10т, а буфером был какодилат Na, рН 5.5-7.0. Глицерин, соли ртути и 2-метил-2,4-пентандиол (МПД) улучшали качество кристаллов. Оптимальной температурой для роста кристаллов комплекса TthLl/мРНК было 4С, а кристаллы комплекса MjaLl/мРНК росли как при 4С, так и при комнатной температуре. Для замораживания в жидком азоте кристаллы комплексов переносили в криораствор, содержащий 21% бутан-2,3-диол, 1.5% ПЭГ Ют, бОмМ КС1, 50 мМ какодилата Na, рН 6.0.
Мелкие кристаллы переносили непосредственно в криораствор, крупные же кристаллы переводили в криораствор, постепенно добавляя его к маточному раствору. 1.8. Структура комплексов MjaLl-мРНК и TthLl-мРНК. 1.8.1 Комплекс MjaLl-мРНК. Кристаллы комплексов белка MjaLl с короткими фрагментами мРНК отражали рентгеновские лучи до 5-10 А и часто были разупорядочены. Наилучшие результаты были получены для комплексов белка MjaLl с наиболее крупными фрагментами мРНК (содержащими полный боковой спирально-петельный участок): кристаллы гомологичного комплекса MjaLl-мРНК (49 нт) отражали рентгеновские лучи до 3.4 А. Дифракционные данные были собраны на синхротроне Desy в Гамбурге (Германия) с кристаллов, содержащих белок L1 с заменами метионинов на селенометионины. Структура комплекса была определена методом мультиволновой аномальной дисперсии. Модель гомологичного комплекса белка L1 со специфическим фрагментом мРНК длиной 49 нт из M.jannaschii представлена на рис. 47. Структура белка MjaLl в комплексе с мРНК близка структуре белка в свободном состоянии. В обоих случаях белок находится в «открытой» конформации, и при образовании комплекса структура каждого домена не подвергается значительным конформационным изменениям. Белок взаимодействует с мРНК в основном за счет домена I. Кристаллы комплексов белка TthLl с фрагментами мРНК из М. vannielii, представленными на рис.39 В и Г, отражали рентгеновские лучи до 2.6 и 2.1 А, соответственно. Комплексы кристаллизовались в пространственных группах P2i и P6s22. Первоначально кристаллы комплексов имели значительную мозаичность (более 1). Этот недостаток был преодолен добавлением в каплю солей ртути. Хотя мы не видели сигнала от ртути при съемке и не обнаружили ее в структурах комплексов, она положительно влияла на рост кристаллов и снижала их мозаичность. Наборы дифракционных данных с кристаллов комплексов были собраны на синхротроне Desy в Гамбурге (Германия). Структура комплекса белка TthLl с 38 нт фрагментом мРНК была определена методом молекулярного замещения и уточнена до разрешения 2.6 А (рис. 49). В комплексе TthLl находится в «открытой» конформацші, подобно архейным белкам L1, тогда как в изолированном состоянии его домены сближены и контактируют друг с другом, образуя «закрытую» конформацию.
Взаимодействие мутантных форм белка Ы со специфическими фрагментами 23SрРНК и мРНК.
Изучение РНК-связывающих свойств мутантных форм белка L1 осуществляли in vitro с помощью метода связывания на нитроцеллюлозных фильтрах (М 2.5.1). Плазмиды, содержащие гены специфических фрагментов рРНК и мРНК, были получены ранее в медицинском университете г. Инсбрука (Австрия) для изучения РНК-связывающих способностей архейных белков LI (Mayer et ah, 1998; Kohrer et al, 1998; Kraft et ai, 1999/ Длина специфического фрагмента 23S рРНК из М. jannaschii составляла 125нт (нуклеотиды с 2189-2312); длина специфического фрагмента мРНК составляла 104нт. Ранее было показано, что неспецифическое связывание MjaLl с любой РНК достаточно велико (Кй=5х\0 5 М, Kraft, 2000). Поэтому для контроля неспецифического связывания мы использовали 145 нуклеотидный фрагмент 16S рРНК, содержащий участок связывания MjaS8 (Gruber et al, 2004). В ходе данной работы мы сравнивали сродство мутантных форм белка L1 к специфическим фрагментам РНК со сродством белков дикого типа к тем же специфическим фрагментам РНК (положительный контроль). Эти эксперименты проводились в стандартном TMK-Cbso буфере, как описано в главе М 2.5.1. По способности связываться с 23 S рРНК и мРНК по сравнению с белком дикого типа все полученные мутантные формы белка L1 можно поделить на три группы: 1) белки, связывающиеся с рРНК с такой же аффинностью, как и белок дикого типа, но имеющие пониженное сродство к мРНК, 2) белки с пониженным сродством как мРНК, так и к рРНК; 3) белки, не связывающиеся ни с рРНК, ни с мРНК. На рис. 54 представлены стандартная кривая связывания белка дикого типа с фрагментом 23 S рРНК и кривые связывания представителей каждой группы мутантных форм белка MjaLl. Константы диссоциации для комплексов, образованных с 23S рРНК белком L1 дикого типа и его мутантными формами, представлены в таблице 3. В большинстве случаев мы не видим влияния единичных аминокислотных замен на связывание белка с рРНК, однако, иногда наблюдается снижение сродства. Отсутствие связывания с рРНК является результатом замены консервативного маленького остатка треонина в РНК-узнающем модуле на крупный остаток фенилаланина или при одновременной замене двух консервативных остатков РНК-узнающего модуля (глутаминовой кислоты 27 и треонина 204 на аланины).
В большинстве случаев замены консервативных аминокислотных остатков, входящих в предполагаемый узнающий модуль белка MjaLl, приводят к значительному снижению сродства белка к мРНК (вплоть до отсутствия связывания) и мало влияют на сродство белка к рРНК. Отсутствие связывания с рРНК наблюдается только при замене консервативного Thr204 в РНК-узнающем модуле на фенилаланин (Thr204Phe) или же при одновременной замене двух консервативных остатков РНК-узнающего модуля (Glu27Ala и Thr204Ala). В первом случае, по-видимому, происходит значительное искажение рельефа поверхности белка, ответственного за узнавание РНК, во втором случае способность недоступных растворителю полярных атомов РНК образовать водородные связи с белком оказывается нереализованной, что ведет к дестабилизации комплекса. Эти эксперименты находятся в хорошем соответствии со структурными данными, поскольку в регуляторном комплексе L1 взаимодействует с мРНК практически только доменом I. Мутации в области, занятой консервативными аминокислотными остатками этого домена, критичны для регуляторного комплекса и практически не оказывают влияния на рибосомный комплекс. Мутации Phe22Arg, Met205Gly и Met205Asp приводят, по-видимому, к значительным, хотя и не катастрофическим, как в случае замены Thr204Phe, изменениям в рельефе поверхности узнающего модуля белка и возможному проникновению растворителя внутрь контактной области, что примерно на порядок ухудшает сродство MjaLl к рРНК. В этом случае, скорей всего, белок не может опознать свое место на РНК. Отдельно следует остановиться на замене Lysl68Ser в области междоменного контакта. Этот остаток не принадлежит к узнающему модулю, но, тем не менее, его замена оказывает влияние на сродство MjaLl как к мРНК, так и к рРНК. Можно предположить, что эта замена понижает вероятность существования конформации белка, пригодной для связывания с РНК. Уменьшение доли такой конформации в общем пуле конформации свободного MjaLl приводит к увеличению равновесной кажущейся константы диссоциации. Комплекс бактериального белка TthLl с фрагментом рРНК оказывается значительно более чувствительным к одиночным мутациям в узнающем модуле, чем комплекс архейного белка. Это можно объяснить тем, что в домене II бактериального белка отсутствует сильно заряженная спираль, которая, взаимодействуя со структурой, образованной петлями А и В 23S рРНК, стабилизирует архейный комплекс. Как упоминалось ранее, контакт между первым доменом белка L1 и РНК определяет взаимное узнавание этих молекул.
Для подтверждения того, что строго консервативные аминокислотные остатки домена II белка не важны для специфического связывания с РНК нами были сделаны замены аминокислотных остатков Argl26 и 134 в MjaLl и TthLl, соответственно, а так же получен изолированный домен I белка L1 из T.thermophilus. Хотя в данном случае мы проводили точечные замены только расположенных на поверхности белка аминокислотных остатков, тем не менее, нельзя было быть уверенным в том, что эти мутации не приведут к существенному изменению структуры участка связывания и нарушению комплементарности взаимодействующих поверхностей белка и РНК. Для выяснения того, что реально происходит со структурой в результате мутаций в белке, необходимо было получить кристаллы хотя бы нескольких мутантных форм. 2.4. Кристаллизация мутантных форм белка MjaLl с измененными РНК-связывающими свойствами. Поскольку точечные замены любого аминокислотного остатка могут привести к значительным изменениям в структуре белка L1, для выявления таких изменений необходимо было получить кристаллы и определить пространственные структуры соответствующих мутантных форм. Наибольший интерес представляют формы, потерявшие сродство к мРНК, или к мРНК и рРНК одновременно. Для кристаллизации были выбраны белки MjaLl, содержащие замены Glu27Ala, Thr204Phe, Thr204Ala, Glu27Ala/Thr204Ala, Met205Asp, и TthLl с заменами Phe371e, Ser211Ala,Thr217Ala. Кристаллизация велась методом диффузии паров в висячей капле при 6 С (мутантные формы MjaLl) и 22 С (мутантные формы TthLl). В случае мутантных форм белка MjaLl капля содержала 3 мкл раствора белка (18мг/мл) в какодилате Na (рН=7.5), 1.5 мкл преципитирующего раствора и 1 мкл 15% МПД. Преципитирующий раствор содержал 6-10% ПЭГ Ют или 8т, 22% ММЕПЭГ 5т, 0.012% МПД рН 7.0-8.5. Противораствор состоял из 33% ПЭГ Ют, 0.1М Hepes/NaOH, рН 7.5. Кристаллы появлялись через 2-3 дня и росли до максимального размера 0.3 мм х 0.2 мм х 0.1 мм в течение 1 недели (рис.56). Кристаллы были очень нестабильны в различных сохраняющих растворах, поэтому мы их фиксировали в парах 0.25% раствора глутарового альдегида. Такие кристаллы были успешно использованы для сбора дифракционных данных. Перед заморозкой в жидком азоте кристаллы мутантных форм белка MjaLl переносили в раствор 21 % бутан-2,3-диола, 1.5 % ПЭГ 10т., 50 mM Hepes/NaOH, рН 7.5.
