Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
Прокариотические рибосом-связывающие сайты и их роль в экспрессии генов 6
2. Обсуждение полученных результатов
Структурночункциональное изучение участков инициа ции трансляции 28
3. Эксперементальная часть
Реактивы и материалы 48
Ферментативные обработки ДНК 51
Электрофорез и детектирование фрагментов ДІЖ 53
Элюция фрагментов ДНК из геля 54
Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация плазмидной ДНК 55
Анализ клонов методом гибридизации с меченными фрагментами ДНК 55
Аналитическое и препаративное выделение плазмидных ДНК 56
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 57
Определение Jb-галактозидазной активности 59
Конструирование ПЛаЗМИД: pLZ2 60
- Структурночункциональное изучение участков инициа ции трансляции
- Ферментативные обработки ДНК
- Анализ клонов методом гибридизации с меченными фрагментами ДНК
- Определение Jb-галактозидазной активности
Введение к работе
В настоящее время интенсивное развитие генетической инженерии позволяет производить в бактериальной системе большое количество важных биологически активных белков, таких как интерферон, инсулин, гормон роста человека и т.п. Для оптимальной экспрессии клонированных генов в бактерии необходимо обеспечить следующие элементы: I. Сильные промоторы, способные активно производить транскрипцию для получения большого количества мЕНК. 2. Эффективные участки инициации трансляции, или рибосом-связы-вающие сайты, обеспечивающие оптимальную трансляцию полученных мРНК в бактериальной клетке. Два этих элемента составляет основу регуляции экспрессии генов на двух уровнях: транскрипция и трансляция. Трансляционная регуляция, главным образом осуществляется на стадии инициации, по объему проведенных исследований и изученности значительно уступает транскрипционной регуляции, хотя она также способна сильно влиять на экспрессию генов. Поэтому актуальной -задачей являются поиск и исследование оптимальных участков инициации трансляции, с помощью которых можно создать более эффективные векторы для экспрессии генов в бактерии.
Такие исследования стали возможными благодаря развитию современных методов генетической инженерии и нуклеотидного синтеза, позволяющих исследователям выделять из генома бактерии или химически синтезировать различные рибосом-связывающие сайты, а также направленно варьировать их размер и нуклеотидный состав.
В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение влияния различных рибосом-связывающих сайтов, химически синтезированных и целенаправленно измененных по величине и нуклеотид-ному составу, на экспрессию клонированного гена.
Для этого необходимо было создать специальную векторную плазмиду, позволяющую легко клонировать и точно определять функциональную активность исследуемых рибосом-связывающих сайтов. В структуру этой векторной плазмиды входят синтетические промотор и участок инициации трансляции, а также lacz, продукт которого- -галактозидаза - легко тестируется биохимически. Штамм E.coii - хозяин для плазмид выбран такой, у которого lac -оперон делетирован и таким образом уровень Jb-галактозидазы в клетке полностью обусловлен экспрессией плазмидного гена. Благодаря наличию удобных рестриктных сайтов в векторной плазмиде можно вводить различные рибосом-связывающие сайты и исследовать их влияние на экспрессию р -галактозидазы.
Диссертационная работа выполнена в период 1982-1985 года и является частью комплексных исследований, проводимых в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР под руководством академика М.Н.Колосова, которому автор искренне признателен за постоянное внимание и поддержку. Автор выражает глубокую благодарность старшему научному сотруднику лаборатории кандидату химических наук В.Г.Коробко за научное руководство настоящей диссертацией и практическую помощь на протяжении всего периода ее выполнения, а также кандидату химических наук В.Н.Добрынину и его сотрудникам за синтез олигонук-леотидов, использованных в этой работе.
Структурночункциональное изучение участков инициа ции трансляции
В настоящее время наряду с исследованиями по клонированию различных структурных генов интенсивно ведутся исследования регуляции их экспрессии в бактериальной клетке. Известно, что регуляция экспрессии генов в основном осуществляется на двух уровнях: транскрипция и трансляция; причем регуляция на уровне трансляции может играть очень существенную роль. Так, различные участки инициации трансляции способны изменять уровень экспресии генов от десяти до тысячи раз / 5, 13, 48, 66, 129 /, поэтому наш интерес к ним был обусловлен поиском оптимальных вариантов с целью их практического применения. На протяжении ряда лет использование современных высокоэффективных методов химического и ферментативного синтеза позволило создать в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН QCCP такие искусственные генетические структуры, как различные промоторы, оператор (сайт связывания белка-іас репрессора), структурные гены гормона брадикинина, пептида дельта-сна, интерферона. Нашей задачей являлось создание методами химико-ферментативного синтеза целенаправленно измененных участков инициации трансляции, а также их клонирование и тестирование. Однако, чтобы тестировать их эффективность при экспрессии генов, необходимо было создать специальную векторную плазмиду. Векторная плазмида PV3 с синтетическим регуляторним участком и полусинтетическим геном ft-галактозидазы E. coli Необходимая для этой цели векторная плазмида должна иметь регуляторный участок (состоящий из промотора и участка инициации трансляции), помещенный перед структурным геном, продукт которого должен быть легко тестируемым. Исходя из этих соображений, мы выбрали в качестве регуляторного участка будущего вектора синтетический регуляторний участок сконструированной ранее в нашей лаборатории плазмиды pwei / 130 /. В качестве тест-гена мы использовали ген lacz, лишенный собственного регуляторного участка и инициирующего кодона, поскольку его продукт - р -га-лактозидаза - легко тестируется стандартным биохимическим методом / 131 /. Источником гена lacz явилась плазмида р198/1 (предоставлена Б.Гроненборном, ФРГ), содержащая в виде ECORI -фрагмента основную часть гена lacz с 13 по 3016 нуклеотид, т.е. лишенного 12 начальных и 59 концевых нуклеотидов кодирующей последовательности. Чтобы использовать его в качестве тест-гена, сначала необходимо было реконструировать его С-концевую часть.
Для этого мы переклонировали этот фрагмент в EcoRi-сайт плазмиды PBR322 и отобрали такие клоны, в которых полученная плазмида PLZI при гидролизе рестриктазой сіаі давала 2 фрагмента длиной приблизительно 2 и 5,5 т.п.о., откуда следует, что в ней вставка lacz 13-3016 имеет полярность, показанную на рис.1а. Затем плазмиду PLZI полностью гидролизовали рестриктазой sail и частично ECORI, больший фрагмент (около 6,7 т.п.о.) выделили электрофорезом в 1% агарозном геле и лигировали с 20-кратным избытком синтетического дуплекса С-концевой части lacz (нуклеотиды 3017-3075, рис.16). Этот дуплекс синтезировали в два этапа лигированием олигонуклеотидов (І)-(Х) в двух десятикомпонентных комплексах, в каждом из которых четыре смежных олигонуклеотида одной цепи 5нфосфорилированы с помощью ІЇ-PJ АТР низкой удельной активности, а остальные шесть олигонуклеотидов не содержали 5н$осфатной группы, причем оба 5-концевых олигонуклее-тида присутствовали в 10$ избытке. Полученные таким образом отдельно 59-членные одноцепочные полинуклеотиды (XI) и (ХП) были выделены электрофорезом в 15% ПААГМ (полиакриламидный гель, содержащий 7М мочевину), 5-фосфорилированы высокомеченньм I "Y- PJ АТР и их нуклеотидные последовательности были доказаны модифицированным методом Максама-Гилберта / 132 /. После трансформации клеток Е.соїі ВМН7ІІ8 были отобраны колонии, гибри- о Я? дизущиеся при 55 С с Р-меченным олигонуклеотидом (XI) (70$ колоний). Выделенные из 6 клонов плазмидные ДНК подвергли рест-риктному анализу; оказалось, что все они имеют по одному сайту ECORI и sail и при совместном действии обеих нуклеаз дают два фрагмента длиной около 3,1 и 3,7 т.п.о. Первичная структура полученной плазмиды PLZ2 была доказана секвенированием от сайтов ECORI и sail. Ген lacz в этой плазмиде находится в виде EcoRi-saii фрагмента длиной более 3,1 т.п.о. без пяти первых кодирующих триплетов, однако его использование в качестве тест-гена вполне возможно, поскольку в работах / 133, 134 / было показано, что отсутствие даже 27 N-концевых триплетов не сказывается на активности Ь-галактозидазы. Для того чтобы поместить этот ген, начинающийся сайтом ECORI, позади регуляторного участка из pwe1, оканчивающегося сайтом ватні, необходимо было на месте ватні -сайта в этой плазмиде образовать сайт ECORI, а прежний ECORI сайт заменить новым уникальным рестриктным сайтом (рис.2). С этой целью сначала мы уничтожили EcoRi-сайт в pw8i путем клонирования по нему синтетического линкера: AATTTAGATCTA, тем самым заменили его новым уникальным сайтом вдш. Новая плазмида обозначена PVI
Ферментативные обработки ДНК
Для выращивания клеток Е.СОІІ использовали среды: XT: і литр содержит 8 г триптона "Васто", 5 г дрожжевого экстракта и 5 г хлористого натрия. М9_: I литр содержит 6 г Na2HPo4, з г КН2РО4 0,5 Г NaCl, I г NH4CI, после автоклавирования добавить 10 мл 0,01 М caci2. Для приготовления чашек добавляли 17 г агара "Васто" на I литр YT -среды. Среды автоклавировали I час при I атм и хранили при комнатной температуре. Индикаторные чашки с x-gai готовили, добавляя по I мкл 4$ раствора x-gai в диметилформамиде на I мл питательного агара при температуре 42-45С. Ампициллин во всех случаях добавляется до конечной концентрации 50 мкг/мл. МЕТОДЫ Ферментативные обработки ДНК а. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции течение 1-2 часов, добавляя на I мкг ДНК I ед.акт.фермента. При расщеплении ECORI И sail концентрация Naci в буфере ВВ составляла 100 мМ. Концентрация ДНК в реакционной смеси составляла обычно 0,1 мг/мл. Полноту гидролиза цроверяли электрофорезом в агароз-ном геле, как описано ниже. б. Введение 5-концевой ЧР-метки в олигонуклеотиды. Реакционная смесь конечного объема 100 мкл содержала: 10 мкл Ю-краткого буфера К, [#-32Р] АТР В 2-3 кратном избытке по отношению к 5-0Н группам олигонуклеотидов, 15-20 ед.акт. полинуклеотидкиназы. Инкубацию проводили I час при 37С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 10 мМ концентрации и меченые олигонуклеотиды отделяли от избытка АТР гель-фильтрацией на сефадексе G-SO в буфере СВ. в. Введение 3-концевой Р-матки В ]Щ. 3-тКонцы ДНК достраивали с помощью ДНК-полимеразы І Е.СОІІ (фрагмент Кленова). В качестве меченого предшественника использовали такой О(-32Р - дезоксинуклеозид-трифосфат, который первым включается в дуплекс (например, ОС-32Р ЙАТР в случае 32 ДОСТрОЙКИ Сайта EcoRI ИЛИ ОС Р dGTP В случае BamHI) . Достройку проводили в течение 30 мин. при І6С в буфере, содержащем 50 мМ трис-нсі рН 7,2, 10 мМ Mgso4, 0,1 мМ DTT или в ВВ буфере. Реакционная смесь содержала 5-Ю пмоль фрагментов ДНК, 3-5 ед.акт. ДНК-полимеразы, 0,5-1,0 мкМ [oC-32pJdNTP и дезоксинуклеозидтрифосфаты, необходимые для окончательного заполнения достраивающегося конца (например, dTTP в случае Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 10 мМ концентрации и смесь подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-SO В СВ-буфере для отделения от избытка меченого трифосфата. г. Лигазное сшивание Лигирование олигонуклеотидов и ДНК проводили в буфере LB или в буфере ВВ.
Концентрация ДНК обычно составляла 10-20мкг/мл, концентрация Т4 лигазы - 1000 е.а./мл в случае сшивания выступающих комплементарных концов ДНК и 5000 е.а./мл - в случае ровных концов. Реакцию лигирования липких концов проводили при П-13С, а для ровных концов - при 20С. Время реакции во всех случаях составляло 3-5 часов. Электрофорез и детектирование фрагментов ДНК Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в пластинках акриламидного и агарозного геля, которое готовили как описано в / 140 /. Для акриламидного геля использовали обычно ТВЕ, для агарозного - ТАЕ. Концентрацию ШАГ и его размеры выбирали в зависимости от молекулярного веса разделяемых фрагментов ДНК. Обычно для разделения фрагментов от 30 до 3000 п.о. использовали 5-8$ ШАГ длиной 20-40 см. Соотношение акриламид:метилен-бисакриламид во всех случаях составляло 30:1. Для анализа плазмидных ДНК и продуктов их лигазных сшивок использовали 0,8$ агарозный гель в горизонтальных пластинах размером 120 х 80 х 5 мм. При анализе первичной структуры ДНК использовали пластинки денатурирующего 12-20$ ШАГ размером 40 х 30 х 0,04 см или Фрагменты ДЖ после окончания электрофореза выявляли окрашиванием геля в растворе бромистого этидия (I мкг/мл) и фотографировали в отраженном УФ свете (266 нм) на пленку иМикрат-300" ("Тасма") через красный светофильтр. Меченые фрагменты ДНК выявляли радиоавтографией на рентгеновской пленке PM-I ("Свема") с использованием усиливающих экранов ЭУ-ВЗ у 4,2 (Московский химзавод им.Семашко). Элюпия фрагментов ДНК из геля По авторадиографии полосы олР-меченых фрагментов ДНК вырезали из ПААГ, измельчали и инкубировали 3-12 час. при 37С в 400 мкл буфера Е. Частицы геля отделяли центрифугированием и фрагменты ДНК осаждали этанолом в присутствии 20 мкг носителя тРНК и дважды переосаждали спиртом из 0,ЗМ ацетата натрия (рН 5,5). Дважды промытый спиртом осадок высушивали в вакуумном эксикаторе. При электроэлюции фрагментов ДНК из агарозных и полиакрил-амидных гелей использовали аппарат для концентрирования образцов фирмы "isco". Электроэлюцию проводили 1-3 часа при 250В в 0,1 х ТВЕ буфере. ДНК концентрировали на диализной мембране либо на диске ДЕАЕ-бумаги DESI . в первом случае снятый с мембраны раствор ДНК (100-200 мкл) очищали спиртовым переосаждением или гель-фильтрацией на сефадексе G-50,-a во втором очистку ДНК проводили, промывая бумажный диск несколько раз в воде и СПИрте С ПОСЛедущеИ Десорбцией раСТВОрОМ, СОДержаЩИМ I М NaCl, 10 мМ EDTA,0,I# SDS в течение 45 мин. при 65С.
Анализ клонов методом гибридизации с меченными фрагментами ДНК
I мл ночной культуры клеток E.coii, выращенной на YT бульоне, инокулировали в 100 мл той же среды и выращивали на качалке при 37С до мутности о600 = о,5, затем охлаждали 20 мин при 0С и клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 5000 об/мин. После суспендирования в 50 мл охлажденного стерильного раствора 0,ІМ caci2 клетки выдерживали не менее 30 мин при 0С и подвергали повторному центрифугированию. Суспензию осажденных клеток в 5 мл свежего раствора 0,ІМсасі2 хранили при 0С и в течение 3-5 дней использовали для трансформации. В 150 мкл клеточной суспензии добавляли 10-100 нг векторной ДНК из лигазной смеси и инкубировали 40 мин при 0С, 2 мин при 42С, после чего добавляли 3 мл YT среды и растили клетки I час при 37С. Клетки собрали центрифигурированием и высевали на агар с x-gai и ампициллином. Анализ клонов методом гибридизации с мечеными фрагментами ДНК Анализ клонов, содержащих рекомбинатные плазмиды, проводили по методу / 141 / с некоторыми модификациями. Нитроцеллюлозный фильтр накладывали на агар с трансформантами, выдерживали 5 мин, делали ориентировочные метки на фильтре иглой, после чего снимали так, чтобы практически вся клеточная масса осталась на фильтре. Чашку с агаром помещали в термостат при 37С для подращивания клеток. Нитроцеллюлозный фильтр располагали на фильтровальной бумаге, смоченной 0,5N раствором ыаон и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Затем фильтр нейтрализовали на фильтровальной бумаге, пропитанной буфером, содержащим 0,2М трис-нсі рН 7,5 и ІМ Naci. Фильтр выдерживали 15-20 мин и отмывали в растворе, содержащем 2 х ssc, 0,05М ЭДТА, 0,02М к2НР04 рН 7,0, после чего высушивали 1 час при 60С на воздухе. Перед гибридизацией фильтр инкубиро вали 30 мин в растворе, содержащем 2 х ssc, о,4$ SDS, о,04$ фиколл-400, 0,04$ поливинилпирромидон, 4 МТ/МЛВЗА, ЮО мкг/мл ДЕК из молок лосося. Гибридизацию с Р-меченым олигонуклеоти- дом проводили в 4 х ssc буфере, а концентрацию остальных ком понентов снижали в два раза по сравнению с предыдущим раствором. Температуру гибридизации можно приблизительно определить по следующей формуле: уЬг.= 4(G+C) + 2(А+Т) Где (G+c) -суммарное число G И С нуклеотидов в данном зонде -олигонуклеотиде, а (А+Т) - суммарное число А и Т. Время гибридизации обычно составляло 2 часа, после чего фильтр отмывали 2 х ssc, содержащим 0,2$ SDS. Отмывку проводили 2 раза по 10 мин при комнатной температуре и 30 мин при 37С, после чего фильтр сушили и подвергали радиоавтографии. Исходную чашку с подросшими колониями совмещали с радиоавтографом и интересующие клоны отбирали для анализа плазмид-ной ДНК.
Аналитическое и препаративное выделение плазмидных ДНК Клетки E.coii для аналитического выделения плазмидных ДНК из интересующих клонов выращивали в 10-20 мл YT -среды с ампициллином до стационарной фазы при 37С. Клетки осаждали центрифугированием/ и плазмидную ДНК выделяли по методу / 142 /. Препаративное выделение осуществляли аналогично, выращивая клетки в объеме 1-2 л бульона. В качестве дополнительной стадии очистки от РНК проводили РНК-азную обработку в течение 30 мин при 37С (концентрация фермента составляла 20 мкг/мл) с последующей гель-фильтрацией на биогеле A-I5m или А 5т в буфере, содержащем 0,5М Naci, 20 нМ трис-нсі рН 8,0 , 1мМ ЭДТА. Фракцию плазмидной ДНК, которая выходит сразу после исключенного объема, концентрировали спиртовым осаждением, растворяли в ТЕ буфере и хранили при - 20С. Определение нуклеотидной последовательности. ДНК Первичную структуру ДНК определяли твердофазным методом, разработанным С.АЛувпило и В.В.Кравченко / 132 /. Этот метод представляет собой модифицированный вариант метода Максама-Гил- берта / 143 /. Подготовка образца. Р-меченый фрагмент ДНК иммобилизовали на ионнообменной бумаге ДЕ8І (диск диаметром 5 мм) в процессе электроэлюции из полиакриламидного или агарозного геля. По окончании элюции диск промывали, помещая его с помощью пинцета на 1-2 сек в дистиллированную воду, и переносили на лист фильтровальной бумаги. Операцию повторяли 3-4 раза. Аналогичную промывку проводили в 96$ этаноле, после чего диск ДЕАЕ-бумаги высушивали на воздухе или в вакуумном эксикаторе, разрезали на четыре равные части, маркировали и использовали для проведения химических реакций. При большом числе образцов промывку бумажных полосок и дисков удобно проводить на пористой подложке воронки для вакуумного фильтрования, используя цромывалки водой и 96$ этанолом. Химическая модификация, G-специфическую модификацию проводили в 1% растворе диметшюульфата в 50 мМ формиат-аммонийном буфере (рН 3,5), A+G - модификацию в 66$ муравьиной кислоте, С + Т - модификацию в гидразин-гидрате, С - модификацию в гидразин-гидрате насыщенном Naci и содержащем 0,25N ыаон. Сухие бумажные полоски помещали на стекло или лавсановую пленку и наносили раствор соответствующего реагента в таком количестве, чтобы он полностью без остатка впитался в бумагу (около 4-5 мкл для каждой полоски) и накрывали лавсановой или полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения. По окончании модификации бумажные полоски промывали по 3-4 раза сначала 96$ спиртом, затем водой и снова спиртом, как это было описано выше, и высушивали. Наибольшую осторожность следует соблюдать при отмывке С-специфического реагента, так как резкий перевод бумаги в водную среду может вызвать потери ДНК из-за высокой концентрации Naci в растворе; поэтому в качестве промежуточной промывки здесь следует ввести 80$ этанол.
Определение Jb-галактозидазной активности
Высушенные бумажные полоски после модификации помещали в 1,5 мл пластиковую пробирку с IM водным раствором пиперидина (так, чтобы все полоски находились под слоем жидкости) и выдерживали 30 мин на кипящей водяной бане. Для предотвращения испарения крышка пробирки должна быть плотно закрыта. Пиперидины удаляли описанной выше 4-5 кратной промывкой в воде и спирте. Сухие полоски помещали по отдельности в конические наконечники от автоматической пипетки (на 200 шел), вставленные в полипропиленовые пробирки, объемом 0,4 мл (для удобства наконечники могут быть укорочены в широкой части), в каждый добавляли по 40 мкл Ш раствора Naci, содержащего 10 мМ ЭДТА, 0,1$ SDS И 5 мкг гидролизованной дрожжевой тРНК, инкубировали 20 мин при 65С и подвергали кратковременному центрифугированию для переноса элюционного раствора в пробирку. Десорбцию повторяли еще раз, после чего радиоактивный материал осаждали 96$ спиртом, осадок промывали 80$ спиртом высушивали и растворяли в 2-4мкл формамида, содержащего маркерные красители ксиленцианол FF И бромфеноловый синий. Електрофорез проводили как описано выше. Определение ft-галактозидазной активности Накануне определения клетки Е.СОІІ CSH36(F ) трансформировали плазмидой, несущей ген lacz и на определение брали 10-15 клонов.0,5 мл ночной культуры этих кйонов пересевали в 10 мл свежей среды М9, содержащей глюкозу (0,2$), пролин (20 мкг/мл), ампициллин (50 мкг/мл), витамин BI (2 мкг/мл), M9S04 (ОДмМ ), и выращивали до поздней логарифмической фазы роста ( 0D 600 ==0»8-1»0Ь Клетки охлаждали в ледянной бане 20 мин и j -галактозиднуго активность определяли по методике Миллера / 131 /. Обычно клетки разрушали в объеме 0,8 мл смеси, содержащей 0,75 мл z-буфера, 20 мкл хлороформа, 10 мкл 0,1% SDS, 20 мкл клеточной суспензии и встряхивали 10-15 сек на мешалке vortex. Затем пробирки помещали на 5 мин в водянную баню при 28С, добавляли в каждую пробирку 0,2 мл 0-нитрофенил- -D -га-лактозида (0НФГ, 4 мг/мл) и вновь встряхивали 5 сек. Через 15 мин реакцию останавляли добавлением 0,5 мл IM Na2co3 рН II и пробирки центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. В каждой пробирке измеряли оптическую плотность при 420 нм и вычисляли поглощение 0-нитрофенола, или- в условных единицах - активность фермента, по следующей формуле: Условная активность jb-галактозидазы = I0.OD420 /t.v. OD600, где о42о" оптическая плотность реакционной смеси при 420 нм, OD6oo" плотность клеточной суспензии перед определением, t -время реакции в мин. и v- объем культуры, взятой для определения, в мл.
Эта величина пропорциональна увеличению количества 0-нит-рофенола в I мин на одну бактериальную клетку. После измерения -галактозидазы плазмидная ДЕК из клеточных культур была выделена и анализирована рестриктазой Bspi. Те клоны, у которых обнаружены деления или вставки, были исключены из дальнейшего расчета. Измерение Jb-галктозидазной активности в каждой клеточной культуры проводили с повтором. Уровень экспрессии -галактозидазы для каждой плазмиды определяли усреднением 10-15 таких измерений. Значение стандартного отклонения обычно составляло 4 10% усредненного значения Jb-галактозидазной активности. Конструирование плазмиды PLZ2 10 мкг плазмиды р198/1 в 100 мкл буфера ВВ гидролизовали 20 ед.рестриктазы ECORI В течение I часа при 37С. Продукты гидролиза разделяли в 1% агарозном геле и фрагмент длиной 3 т.п.о. выделяли электроэлюцией. Затем 2 мкг полученного фрагмента, содержащего основную часть гена lacz, лигиро-вали с 2 мкг ECORI -расщепленной плазмиды PBR322 и аликвотой лигазной смеси трансформировали клетки Е.СОІІ ВМН7ІІ8. Выделенные из 6 ампициллин-устойчивых клонов плазмидные ДНК подвергли анализу рестриктазой сіаі,- оказалось, что четыре из них образуют 2 фрагмента длиной приблизительно 2 и 5,5 т.п.о. Полученная плазмида обозначена PLZI; В ней вставка і ас z 13-3016 имеет полярность,показанную на рис.1а. Далее 20 мкг плазмиды PLZI в 200 мкл ВВ буфера полностью гидролизовали рестриктазой sail (40 ед.) и частично ECORI (5 ед.) в течение 30 мин при 37С. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле и больший фрагмент (длиной около 6,7 т.п.о.) выделяли электроэлюцией. После очистки фенол-хлороформной экстракцией 2 мкг этого фрагмента лигировали с I нм нефосфорилированного синтетического дуплекса С-концевой части lacz (нуклеотиды 3017-3075, рис.16). Этот дуплекс синтезировали в два этапа, лигированием олигонуклеотидов (І)-(Х) в двух десятикомпонентных комплексах. В первом из них сначала в объеме 150 мкл LB буфера фосфорилировали олигонуклеотиды (Ш), (У), (УП), (IX) с помощью о Pi АТР низкой активности, затем добавляли остальные не-фосфорилированные олигонуклеотиды и доводили объем LB буфера до 300 мкл; при этом концентрация 5-концевых олигонуклеотидов (I) и (X) составляла 3,5 нмоль, а остальных нуклеотидов - по 3 нмоль. Смесь прогревали 10 мин при 70С и медленно охлаждали до 20С, после чего обрабатывали Т4 ДНК-чЛИгазой и продукты сшивки разделяли в 15$ ПМГМ. В результате был получен 59-член- ный верхний полинуклеотид (XI). Аналогичным образом был получен также 59-членный полинуклеотид (ХП) во втором комплексе, где 5-фосфорилированными были олигонуклеотиды (П), (ІУ), (У1),(УШ), а остальные шесть олигонуклеотидов не содержали 5 -фосфатной группы. Структура 59-членных полинуклеотидов (XI) и (ХП) была доказана модифицированным методом Максама-Гилберта, как описано выше. После лигирования полученного дуплекса, состоящего из полинуклеотидов (XI) и (ХП), с EcoRi-saii фрагментом длиной 6,7 т.п.о. из PLZI аликвотой лигазной смеси трансформировали КЛеТКИ ВМН7118 и ОТОбрЭЛИ КОЛОНИИ, in situ ГИбрИДИ- зующиеся при 55 С с Р-тмеченным олигонуклеотидом (XI) (70$ колонии) (рис.8). Выделенные из 6 клонов плазмидные ДНК подвергли рестриктному анализу, оказалось, что все они имеют по одному сайту ECORI и sail и црИ совместном действии обеих нуклеаз дают два фрагмента длиной около 3,1 и 3,7 т.п.о. Первичная структура полученной плазмиды, PLZ2, была доказана секвенирова- НИЄМ ОТ СаЙТОВ EcoRI И Sail. Конструирование плазмид РУТ И РУ2 10 мкг плазмиды pwsi в 100 мкл буфер ВВ гидролизовали 20 ед.рестриктазы ECORI в течение I часа при 37С. Реакцию останавливали добавлением 4 мкл 0,5 М ЭДТА, прогревали 10 мин при 70С, депротеинизировали экстракцией равным объемом хлороформа, переосаждали из 0,ЗМ ацетата натрия и растворили в 50 мкл ТЕ буфера. Затем I мкг гидролизованной ДНК и 300 нт вдін -линкера в 30 мкл буфера LB лигировали с помощью 60 ед. Т4 ДНКчяи-газы в течение 4 часов при 12С. Лигазную смесь нагревали 10 мин. при 70С и использовали для трансформации клеток вмн 7118.
