Содержание к диссертации
I. Введение. 6
1.1. Сигнальные пути, регулирующие продолжительность жизни, образование дауэрларвы и метаболизм в С elegans. 10
1.1.1. Инсулиноподобный сигнальный путь регулирует продолжительность жизни и образование дауэрларвы. 10
1.1.2. TGF-P сигнальный путь регулирует образование дауэрларвы. 13
1.1.3. Гены elk регулируют метаболизм и продолжительность жизни. 15
1.1.4. Репродуктивные сигналы регулируют продолжительность жизни. 17
1.1.5. Сенсорные нейроны регулируют продолжительность жизни. 18
1.1.6. Серотониновый сигнал регулирует продолжительность жизни. 18
1.1.7. Потребление калорий регулирует продолжительность жизни. 19
1.1.8. S1R-2, диацетилаза коровых гистонов, регулирует продолжительность жизни у дрожжей и C.elegans. 20
1.1.9. Роль окислительного стресса в старении. 20
1.2. Молекулярная генетика семейства линкерных гистонов НІ у C.elegans. 22
1.3. HI может быть специфическим регулятором генной транскрипции. 24
1.3.1. НІ у Tetrahytnena thermophila. 24
1.3.2. НІ у позвоночных. 25
1.3.3. НІ у Saccharomyces cerevisiae. 27
1.3.4. НІ у растений. 28
1.3.5. НІ у Ascobolus immersus. 28
II. Методы. ЗО
2.1. Конструирование НІ :;GFP соединений. 30
2.2. Трансформация. 31
2.3. RT-PCR анализ уровня his-41 мРНК в червях. 32
2.4. his-41 ::GF P мутантные конструкты. 32
2.5. Измерение продолжительности жизни взрослой особи. 33
2.6. РНКовая интерференция (RNAi). 33
2.7. Экспрессия his-41 под контролем различных промотеров. 34 Ш. Результаты. 35
3.1. Экспрессия генов НІ у С. elegans, выявленная с помощью
GFP - связанных трансгенов. 35
3.1 Л, Экспрессия HI ::GFP в сытых червях дикого типа. 36
3.1.2. Экспрессия H1::GFP в голодных червях дикого типа и дауэрларвах. 3.2. Регуляция his-41. 39
3.2.1. Индукция his-41 во время голодания не зависит от феромона. 39
3.2.2. Дауэр-конститутивные мутации в DAF-2/AGE-1 инсулиноподобном и DAF-7/DAF-1/DAF-4 TGF-p
сигнальных путях активируют his-41 у сытых червей. 40
3.2.3. Дауэр-дефективные мутации в Forkhead белке DAF-16, но не в DAF-3/SMAD или DAF-12, блокируют аккумуляцию HIS-41, вызванную голоданием. 41
3.2.4. Долгоживущие мутанты в генетически различных сигнальных путях, регулирующих продолжительность жизни, индуцируют his-41 в различных тканях. 42
3.2.5. Уровень экспрессии kis-41 ::GFP является надёжным показателем активности ндогенного гена his-41. 45
3.2.6. Поиск возможных регуляторних элементов, необходимых для индукции his-41. 45
3.3. Функциональный анализ his-4lB увеличении продолжительности жизни. 47
3.3.1. his-41 необходим для увеличения продолжительности жизни. 48
3.3.2. his-41 достаточен для увеличения продолжительности жизни. 50
3.3.3. Ингибиция his-41 супрессирует эмбриональную летальность
daf-2(e979). 53
3.4. Основные выводы. 55
IV. Обсуждение результатов и будущие изыскания. 57
Рисунки 63
Литература
Введение к работе
Старение - это неизбежный биологический процесс, универсальный для эукариотических организмов, и механизмы, лежащие в его основе в настоящее время интенсивно изучаются. Важным моментом в исследовании старения является изучение факторов окружающей среди или мутаций, которые задерживают процесс старения. Наиболее заметным среди них является калорийные ограничения. Калорийным ограничением называется 50-70 процентное уменьшение потребления пищи животными относительно контрольных животных, питающихся ad libitum. Эффекты калорийного ограничения зависят от уменьшения доступных калорий, а не от ограничения специфических питательных веществ. (Jazwinski, 2002). Калорийное ограничение это не недостаток в питании, поскольку все существенные компоненты диеты присутствуют (Masoro, 1990). Ограничения в диете с достоверностью увеличивает как среднюю, так и максимальную продолжительность жизни многих видов, включая млекопитающих - до 80 процентов (Masoro, 1995). Калорийное ограничение также откладывает большинство физиологических проявлений старения, включая болезни, сопровождающие старение. Например, калорийное ограничение задерживает спонтанное образование опухолей в мышах с р53-делетированным геном (Hursting et al., 1994). От 80 до 90 процентов из 300 связанных с возрастом изменений, исследованных в грызунах, находящихся на диете с калорийным ограничением, включая изменения в поведении, обучении, иммунном ответе, экспрессии генов, ферментативной активности, действии гормонов, непереносимости глюкозы, репарации ДНК и белковом синтезе показывали задержку в проявлении (Sohal & Weindruch, 1996).
Все еще неясно каким образом калорийное ограничение увеличивает продолжительность жизни. Было предложено, что калорийное ограничение действует через уменьшение скорости метаболизма, по существу приводя к уменьшению скорости жизни (Miquel et al., 1976); по-видимому, это не так. Хотя потребление энергии при ограничении в диете сокращено, никакого уменьшения в скорости метаболизма у животных не наблюдается и они остаются такими же активными, как и те, которых кормят ad libitum (McCarter & McGee, 1989). Другая возможность заключается в том. что калорийное ограничение вызывает изменение в метаболизме, которые уменьшают окислительный стресс и разрушения, вызванные реактивными радикалами кислорода (Sohal & Weindruch, 1996). Грызуны, подвергшиеся калорийному ограничению, демонстрируют ослабление в связанном с возрастом увеличении скорости генерации Q-{ и Н2О2 в митохондриях (McCarter & McGee, 1989), уменьшение продукции алканов (Matsuo et al., 1993) и уменьшенную потерю текучести мембран (Chen & Yu, 1994). Калорийное ограничение уменьшает подверженность тканей острому окислительному стрессу m vitro. Наибольшая степень окислительного разрушения, так же как и его ослабление с помощью ограничений в питании происходит в таких тканях, как мозг, сердце, скелетная мышца, которые в основном состоят из долгоживущих постмитотических клеток. Эти ткани также являются мишенями нескольких связанных с возрастом дегенеративных процессов, вызванных окислительным стрессом (Sohal & Weindruch, 1996).
Наряду с физиологическими изменениями, такими как пониженные уровни глюкозы и холестерола в сыворотке, увеличение чувствительности к инсулину и уменьшение температуры тела, калорийное ограничение также вызывает значительное изменение в экспрессии генов. Многочисленные эксперименты, основанные на технологии «микроэррэй», на Drosophila melanogaster (Zou et al., 2000), мышах (Lee et al., 1999) и обезьянах (Kayo et al., 2001) показали, что старение сопровождается уменьшением уровня транскрипции генов, вовлеченных в репродукцию, метаболизм и круговорт белков. Большинство изменений в экспрессии генов были либо полностью, либо частично предотвращены с помощью калорийного ограничения. Кроме того, калорийное ограничение ассоциируется с уменьшением экспрессии многих генов, вовлеченных в ответы на стресс, метаболическую детоксификацию и репарарацию ДНК (Zou et al., 2000). Таким образом, поддержание сбалансированной экспрессии многих генов может быть критично для удлинения продолжительности жизни.
Экспрессия генов зависит от состояния хроматина. Следовательно, отношение между значительными изменениями в экспрессии генов и старением предсказывает, что факторы, регулирующие организацию хроматина, могут также контролировать активность генов и воздействовать на продолжительность жизни. В соответствие с этой гипотезой Lin et al (Lin et al., 2000b) показали, что в дрожжах увеличение продолжительности жизни вызванное калорийным ограничением зависит от двух генов nptl и sir2. nptl кодирует фермент, который производит никотинамид аденин динуклеотид (NAD), ключевой промежуточный продукт энергетического метаболизма. Sir2 является NAD-зависимой гистоновой деацетилазой, которая блокирует транскрипцию генов в отдельных локусах (Cockell et al., 2000). Потеря блокировки в часто повторяющихся локусах рибосомальной ДНК (rDNA) является одной из причин старения у дрожжей (Sinclair & Guarente, 1997). Sir2 может модулировать продолжительность жизни у дрожжей путем блокировки rDNA-локуса и изменения генной экспрессии (Kim et al., 1999). Более того, Sir2 способствует образованию компактной хроматиновой структуры и регулирует доступ многих ядерных белков к ДНК (Straight et al., 1999). Зависимость Sir2 от NAD может служить связывающим звеном между активностью Sir2 и энергетическим статусом клетки. Таким образом, потребление пищи может регулировать продолжительность жизни путем модуляции активности Sir2 и задерживания потери генной блокировки. Утрата блокировки хроматина изменяет экспрессию генов, что может снижать способность клетки функционировать и выдерживать стрессы. Например, блокированные гены на Х-хромосоме человека и других локусах реактивируются с возрастом (Surralles et at., 1999), предполагая, что сопровождающая старение утрата блокировки происходит в клетках млекопитающих и может быть одной из причин снижения функциональности и болезней, ассоциированных со старением. Следовательно, можно ожидать, что уровень блокировки хроматина или состояние хроматина в целом вносит вклад в развитие фенотипов, ассоциированных со старением.
Генетические анализы дрожжей, нематод, мухи и мыши выявили гены, которые регулируют продолжительность жизни в этих организмах (Johnson et al., 1999). Группа генов, отвечающих за продолжительность жизни, включает rtg гены, медиаторы ретроградной связи (от митохондрии к ядру) в дрожжах (Liao & Butow, 1993); супероксидную дисмутазу, «уборщик свободных радикалов» (Огг & Sohal, 1994); потенциальный связанный с G-белком рецептор (Lin et al., 1998); chico, субстрат инсулинового рецептора (Clancy et al, 2001) в Drosophila melanogaster и p66shc, ген ответа на окислительный стресс у мышей (MigHaccio et al., 1999). Гены, регулирующие продолжительность жизни в C.elegans включают clk-І, ген, вовлеченный в биосинтез убиквинона в митохондриях (Branicky et al., 2000); tph-1, ген, вовлеченный в биосинтез серотонина (Sze et al., 2000); eat гены, регулирующие функцию фаринкса и потребление пищи (Lakowski & Hekimi, 1998); sir-2, гомолог дрожжевого sir2, который опосредует блокировку хроматина (Tissenbaum & Guarente, 2001), и группу генов, вовлеченных в инсулиноподобный сигнальный путь: daf-2, age-1 и daf-16 (ICenyon et al, 1993; Morris et al., 1996).
