Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
-
Молекулярно-генетические механизмы реакции организма на облучение в малых дозах 13
-
Генетическая нестабильность и старение 22
-
Генетический контроль апоптоза у дрозофилы 27
-
Апоптоз и старение 42
1.5. Старение у дрозофилы 52
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 67
-
Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 67
-
Условия содержания дрозофилы 70
-
Условия экспериментального воздействия 71
-
Условия облучения 71
-
Условия обработки этопозидом 71
-
Получение материала в экспериментах по продолжительности жизни 73
-
Статистическая обработка результатов по продолжительности жизни 74
-
Оценка скорости окукливания личинок дрозофилы 75
-
Оценка уровня гибели клетки в нервной системе личинок третьего возраста 76
-
Возраст-зависимая динамика нервно-мышечной активности имаго дрозофилы 77
-
Генетический анализ р53-зависимого апоптоза у Drosophila melanogaster 78
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 79
3.1. Сравнение действия малых и больших доз облучения на продолжительность жизни
и физическую активность линий дрозофилы 79
-
Влияние хронического облучения в малых дозах и острого облучения в больших дозах на показатели продолжительности жизни и старения самцов лабораторной линии дрозофилы дикого типа Canton-S 82
-
Влияние хронического облучения в малых дозах и острого облучения в больших дозах на показатели продолжительности жизни и старения самцов лабораторной линии 4015 с дефектом супероксиддисмутазы 85
-
Влияние хронического облучения в малых дозах и острого облучения в больших дозах на показатели продолжительности жизни и старения лабораторных линий дрозофилы с дефектами репарации 88
-
Самцы линии rad54 88
-
Самцы линии mus209 91
-
Самцы линии тш210 94
-
Самцы линии 4236 99
-
Самки линии 4236 102
-
Самки линии те і- 41т 106
-
Самцы линии mei-F 108
-
Самцы линии 5660 109
3.1.4. Влияние хронического облучения в малых дозах и острого облучения в
больших дозах на показатели продолжительности жизни и старения лабораторных
линий дрозофилы с нарушением регуляции апоптоза 113
-
Самцы линии 1576 113
-
Самцы линии 12093 116
-
Самцы линии 5053 120
-
Самцы линии 10390 122
-
Самцы линии 11179 125
3.1.4.6. Самцы линии 11041 127
-
Изменчивость продолжительности жизни самцов линии дикого типа Canton-S в поколениях после хронического облучения ионизирующей радиацией 130
-
Изменчивость продолжительности жизни самцов линии дикого типа GB-39 в поколениях после хронического облучения ионизирующей радиацией 144
-
Сравнение продолжительности жизни лабораторных линий дрозофилы после воздействия хронического облучения и этопозида 158
-
Самцы линии Canton-S 158
-
Самцы линии 1576 161
-
Самцы линии 5053 162
-
Самцы линии 10390 163
-
Самцы линии 11179 164
-
Самцы линии wg1'7 165
-
Самцы линии wg7L74 166
3.5. Скорость окукливания личинок третьего возраста лабораторных линий дрозофилы
после воздействия острого и хронического облучения 168
-
Линия Canton-S 168
-
Линия rad54 170
-
Линия 4236 171
-
Линия тш210 172
-
Линия mus209 173
-
Линия 5660 174
-
Линия 12093 175
-
Влияние малых доз ионизирующей радиации на уровень программированной гибели клеток в нервных ганглиях личинок третьего возраста 176
-
Возраст-зависимая динамика нервно-мышечной активности имаго после хронического облучения на предимагинальных стадиях 178
3.8. Генетический анализ р53-зависимого апоптоза у Drosophila melanogaster 184
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 187
4.1. Радиационно-индуцированное изменение продолжительности жизни 189
4.1.1. Действие малых и больших доз облучения на продолжительность жизни линий
дрозофилы 193
-
Линия дикого типа Canton-S 193
-
Линия 4015 197
-
Линия rad54 200
-
Линия тш209 202
-
Линия mus210 204
4.1.1.6 Изменение продолжительности жизни лабораторных линий с мутациями
генов теі-41 итеі-9 205
-
Линия 1576 209
-
Изменение продолжительности жизни лабораторных линий с мутациями гена ингибитора апоптоза diap-1 (th) 210
-
Изменение продолжительности жизни лабораторных линий с мутациями гена каспазы апоптоза Dcp-І 211
4.1.1.10. Линия 11041 212
4.1.2 Влияние хронического облучения в малых доза на продолжительность жизни в
поколениях лабораторных линий дрозофилы дикого типа 214
4.1.3. Изменение продолжительности жизни после воздействия облучения и
этопозида у линий с дефектами регуляции апоптоза 217
-
Возрастная динамика нервно-мышечной активности после хронического облучения малыми дозами ионизирующей радиации у линий дрозофилы с нарушением апоптоза 226
-
Скорость окукливания личинок после облучения 232
4.4. Генетический анализ р53-зависимого апоптоза у Drosophila melanogaster 234
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 235
ВЫВОДЫ 245
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 249
Введение к работе
Актуальность проблемы. На протяжении всей истории жизни на Земле, ионизирующая радиация в низких дозах выступает в качестве одного из средовых факторов, изменяет скорость эволюционных процессов. В результате Чернобыльской аварии, деятельности химкомбината «Маяк», испытаний ядерного оружия, аварии на атомной станции Три Майл Айленд, значительные территории подверглись радиоактивному загрязнению, живая природа оказалась под воздействием хронического облучения (Шевченко, 1997). Несмотря на то, что облучение низкой интенсивности не приводит к соматической гибели организма, оно способно модифицировать клеточно-тканевые процессы, что в конечном итоге приводит к изменению такого комплексного показателя, как продолжительность жизни (Зайнуллин, 1988, 1998; Пелевина и др., 1999).
Исследование влияния ионизирующей радиации на продолжительность жизни ведется уже несколько десятилетий. В результате накоплены данные как об уменьшении, так и об увеличении этого показателя. Однако до сих пор нет единого мнения по поводу того, что является ключевым механизмом изменения продолжительности жизни организма при действии радиации.
Проблема наследования продолжительности жизни потомков, родители которых были подвергнуты облучению, является одним из слабо разработанных разделов радиационной генетики и биологии старения. И практически не исследовано с этой точки зрения влияние малых доз. Теоретический аспект данной проблемы очевиден: он касается выяснения роли наследственного аппарата при формировании такого важного индивидуального и популяционного показателя, как продолжительность жизни. В связи с антропогенной нагрузкой на экосистемы резко возросло и практическое значение подобных исследований (Измайлов и др., 1990).
Несмотря на обилие гипотез о механизмах радиационной модификации скорости старения, ни одна из них не заняла лидирующего положения. На наш взгляд, многие из накопленных ныне отрывочных данных и гипотез выстраиваются в целостную картину, охватывающую процесс радиационно-индуцированного изменения продолжительности жизни с молекулярного до органно-тканевого уровня. Предполагая важную роль дестабилизации генома и апоптотической гибели клетки в качестве ключевых звеньев в контроле над продолжительностью жизни, мы считаем, что непосредственная или отсроченная индукция данных процессов ионизирующей радиацией может существенно изменить скорость естественного старения.
В последние несколько лет явление запрограммированной гибели клетки (апоптоза) стало одной из наиболее актуальных тем биологических исследований. Столь значительный интерес к данной проблеме связан с тем, что апоптоз служит многоклеточным организмам в качестве одного из главных механизмов, участвующих в развитии, тканевом гомеостазе и старении, а также в клеточном ответе на повреждение ДНК. Индукция программы апоптоза может осуществляться разнообразными воздействиями, в частности, ионизирующей радиацией. Показателем важности данного направления исследований является присуждение Нобелевской премии 2002 года Роберту Хорвицу за открытие основных регуляторов апоптоза.
Весьма существенная роль в регуляции апоптоза у млекопитающих принадлежит фосфопротеину р53, контрольные функции которого распространяются на такие процессы как транскрипция, прохождение клеточного цикла, репарация и репликация ДНК и поддержание стабильности генома. Достаточно сказать, что около 50% форм злокачественных опухолей человека несут мутацию гена этого белка. В нормальных клетках р53 активирует программу апоптоза, в то время как мутации в гене р53 сопряжены с появлением рака молочной железы, толстого кишечника и т.д. (Хансон, 1998). В 2000 году М.Г. Бродским был идентифицирован гомолог р53 млекопитающих у дрозофилы -Dmp53. Этот белок непосредственно регулирует экспрессию проапоптозных генов у дрозофилы, играя определяющую роль в радиационно - индуцированном апоптозе (Brodsky et al., 2000; Ollmann et al., 2000).
Стоит отметить, что в целом механизм р53-зависимой индукции апоптоза остается невыясненным. В связи с этим представляет большой интерес изучение этого механизма, используя коллекции трансгенных линий дрозофилы с измененной экспрессией генов белков апоптоза, репарации и контроля клеточного цикла дрозофилы, что позволит отследить роль тех или иных генов и контролируемых ими механизмов в р53-индуцированном апоптозе.
Удобным объектом для исследования механизмов старения и продолжительности жизни, в том числе и радиационного старения, является дрозофила. Форма кривых выживания различных видов животных, представленная в безразмерных величинах, практически одинакова. Этот факт свидетельствует об универсальности фундаментального механизма старения (Акифьев и др., 1997). Поскольку соматические ткани имаго дрозофилы состоят из постмитотических клеток (исключение составляют некоторые интерстициальные клетки), она подходит как модель механизмов старения в постмитотических клетках (Brack et al., 1996). Постмитотическое состояние соматических тканей взрослых дрозофил в опытах по изучению радиационного старения позволяет избежать внедрения в результаты таких нежелательных факторов как злокачественные опухоли или лучевая болезнь (Акифьев и др., 1997), а также обусловливает более наглядно выраженную роль апоптотической гибели клетки в старении у данного организма (Зайнуллин и др., 1999). Другие ее преимущества: короткий, по сравнению с другими видами животных, жизненный цикл и продолжительность жизни (3-4 недели), относительная легкость содержания в лабораторных условиях, удобство проведения генетических экспериментов.
Секвенирование генома дрозофилы показало наличие у нее около 13600 генов. Примерно половина из них является гомологами генов человека, в том числе более половины генов заболеваний человека (Landis, 2001). Используя трансгенные линии дрозофилы, несущие измененную экспрессию различных генов, отвечающих за генетическую стабильность и апоптоз, можно выявить роль тех или иных генов в старении, в том числе радиоиндуцированном. Дрозофила является в этом плане уникальным объектом, поскольку подобные исследования на человеке невыполнимы, а на млекопитающих - очень дорогостоящие.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в изучении продолжительности жизни имаго дрозофилы после облучения ионизирующей радиацией в зависимости от генотипа исследуемых линий. Для решения поставленной проблемы были определены следующие задачи: исследовать динамику смертности имаго лабораторных линий Drosophila melanogaster в условиях хронического воздействия ионизирующей радиацией на предимагинальные стадии; оценить роль межлинейных отличий по дефектам системы репарации ДНК, по генам белков антиоксидантной защиты и апоптоза в радиационно-индуцированном изменении продолжительности жизни, физической активности и скорости окукливания личинок; сопоставить эффекты хронического облучения малыми дозами и острого облучения большими дозами ионизирующей радиации; оценить уровень клеточной гибели у дрозофилы после хронического воздействия малыми дозами ионизирующей радиации; исследовать воздействие этопозида, а также комбинированное действие этопозида и облучения на продолжительность жизни различных линий дрозофилы; исследовать механизмы р53-зависимой регуляции апоптоза, показать возможную роль генов апоптоза и поддержания генетической стабильности в р53 - зависимом пути.
Положения, выносимые на защиту: облучение приводит к изменению продолжительности жизни в зависимости от генотипа; облучение в малых дозах вызывает изменение продолжительности жизни, отличное от действия облучения в высоких дозах; дерегуляция генетического контроля апоптоза и репарации изменяет скорость старения.
Научная новизна. Впервые в комплексных экспериментах in vivo исследована роль определенных путей апоптоза и репарации ДНК в старении целостного организма.
Впервые осуществлена оценка динамики смертности в поколениях после хронического облучения малыми дозами ионизирующей радиации. Показано, что увеличение продолжительности жизни происходит только в первых поколениях облучения, тогда как в последующих она постепенно снижается.
Впервые исследовано влияние индуктора апоптоза этопозида на продолжительность жизни модельного объекта.
Впервые выявлен рецессивный эффект мутации теі-41 в контроле старения.
Предложен механизм радиационно-индуцированного изменения продолжительности жизни и нервно-мышечной активности, согласно которому индуцированный апоптоз преимущественно клеток со сниженной репаративной способностью и антиоксидантной защитой на предимагинальных стадиях является причиной замедления старения имаго.
Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты показывают, что Drosophila melanogaster может применяться в качестве удобной тест-системы для оценки действия факторов радиационной и нерадиационной природы на продолжительность жизни и старение. Данные, свидетельствующие о наличии статистически значимых эффектов в ряду поколений, являющихся потомками облученных поколений, могут быть использованы при оценке отдаленных последствий действия ионизирующей радиации.
Еще раз подтвержден факт различий отдаленного действия малых и больших доз ионизирующей радиации.
В экспериментах in vivo получены новые факты, свидетельствующие об участии механизмов индуцированной генетической нестабильности и апоптоза в радиационно-индуцированном изменении продолжительности жизни и старении, а также в естественном старении. Комплексный анализ линий, несущих различные дефекты апоптоза и репарации ДНК, позволил расширить понимание механизмов регуляции продолжительности жизни и старения (в том числе и радиационно-индуцированного).
Материалы диссертационной работы используются при чтении лекционных курсов на химико-биологическом факультете Сыктывкарского государственного университета и Коми филиала Кировской государственной медицинской академии (г. Сыктывкар), а также на кафедре экологической медицины и радиобиологии Международного государственного экологического университета им. А.Д. Сахарова (г. Минск).
Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Автор самостоятельно планировал экспериментальную работу, участвовал в сборе материала (оценка смертности, нервно-мышечной активности, скорости окукливания, уровня клеточной гибели, генетического взаимодействия р53), осуществлял первичную обработку данных, формулировал положения и выводы работы.
Представленная работа является частью исследований, проводимых лабораторией радиационной генетики Отдела радиоэкологии Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на I Международной научно-практической конференции "Экология и молодежь" (Гомель, 1998), I Международной конференции "Биоразнообразие наземных и почвенных беспозвоночных на севере" (Сыктывкар, 1999), II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), Международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Дубна, 2000), Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000), Международной конференции «Биорад-2001» (Сыктывкар, 2001), XI Международном симпозиуме по биоиндикаторам (Сыктывкар, 2001), IV съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001), 31 ежегодном съезде Европейского общества радиобиологов (Дрезден, 2001), 6 международной Вольфсбергской конференции по молекулярной радиационной биологии и онкологии (Эрматинген, 2002), 32 ежегодном съезде Европейского общества радиобиологов (Льеж, 2001), Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» (Москва, 2002), III международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III съезде по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология) (Киев, 2003), II международном семинаре «Радиационная безопасность при пилотируемой марсианской экспедиции» (Дубна, 2003), II съезде геронтологов и гериатров России (Москва, 2003), Международном конгрессе по защите окружающей среды от воздействия ионизирующей радиацией 2003 под эгидой МАГАТЭ (Стокгольм, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 работ, в том числе 1 монография и 15 статей в рецензируемых журналах.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения), выводов и списка литературы. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста и содержит 11 таблиц и ПО рисунков. Список литературы включает 346 источников, из них 285 на иностранном языке.
