Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы 9
1.1. Рибосомные РНК и гены, их кодирующие 9
1.2. Структурно-функциональная организация МГС 12
1.3. Субповторы МГС 12
1.4. Функция субповторов 17
1.5. Промоторы генов рРНК 19
1.6. Проксимальный терминатор генов рРНК 21
1.7. Регуляция транскрипции генов рРНК 22
1.8. Метилирование цитозиновых остатков в CG и CNG последовательностях
1.9. Филогенетические взаимоотношения в трибе пшеницевых 34
ЧАСТЬ 2. Объекты и методы исследований 39
2.1. Выделение и очистка ДНК растений 39
2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК 40
2.3. Обработка ДНК метабисульфитом натрия 42
2.4. Получение одноцепочечной ДНК 43
2.5. Расщепление ДНК рестриктазами 44
2.6. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях 44
2.7. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 45
2.8. Полимеразная цепная реакция 46
2.9. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПЦР 47
2.10. Лигирование векторной ДНК с амплифицированной ДНК 47
2.11. Подготовка компетентных клеток E.coli 48
2.12. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 49
2.13. Секвенирование ДНК ферментативным методом 49
2.14. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез)
2.15. Выявление полиморфизма однонитчатых цепей ДНК 52
2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 53
2.17. Бактериальные штамы 53
2.18. Реактивы и материалы 54
2.19. Составы использованных стандартных растворов 55
ЧАСТЬ 3. Результаты исследования 56
3.1 .Выяыление промоторов генов рРНК, присущих геномам А у ди и полиплоидных пшениц
3.2. Нуклеотидные последовательности участков МГС рДНК диплоидной пшеницы Triticum sinskajae генома А, тетраплоидной пшеницы T.timopheevii (субгеномы А и G) эгилопсов предполагаемых доноров субгеномов В, G и D 57
3.3. Нуклеотидные последовательности МГС рДНК субгенома AT. 71
aestivum и генома А Т. urartu после обработки растений 6- бензиламинопурином и дезаминирования ДНК при помощи метабисульфита натрия
ЧАСТЬ 4. Обсуждение результатов 80
4.1. Эволюция промоторных областей МГС рДНК пшеницевых 80
4.2. Установление филогенетических взаимоотношений в пшенично-эгилопсном альянсе путем сравнения нуклеотидных последовательностей промоторных областей МГС рДНК
4.3. Метилирование цитозиновых остатков промоторных областей 97
МГС рДНК субгенома А Т. aestivum и Т. urartu после обработки
растений 6-бензиламинопурином.
Выводы 104
Список литературы 106
- Субповторы МГС
- Регуляция транскрипции генов рРНК
- Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях
- Нуклеотидные последовательности участков МГС рДНК диплоидной пшеницы Triticum sinskajae генома А, тетраплоидной пшеницы T.timopheevii (субгеномы А и G) эгилопсов предполагаемых доноров субгеномов В, G и D
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес, проявляемый к структурной организации и особенностям регуляции транскрипции рДНК неудивителен, так как кодируемые ими молекулы рРНК являются одними из важнейших компонентов рибосом. Гены рРНК находятся в определенных участках хромосом, называемых ядрышковыми организаторами, в виде расположенных "голова к хвосту" тандемных повторов, где кодирующие участки генов разделены некодирующими последовательностями - спейсерами. Межгенный спейсер (МГС), отделяющий повторы рДНК друг от друга, включает в себя все элементы, необходимые для инициации, терминации и регуляции транскрипции генов рРНК, где промотор выполняет ключевую роль.
Считается, что существует несколько уровней регуляции транскрипции рДНК, один из которых связан с модификацией белковых факторов, входящих в состав транскрипционного комплекса РНК полимеразы I. Другой уровень регуляции транскрипции генов рРНК обеспечивается обратимыми превращениями транскрипционно-активного эухроматина в транскрипционно-неактивный гетерохроматин и обратно путем изменения структуры хроматина в зоне локуса рДНК. При этом отличия гетерохроматина от эухроматина заключаются в степени метилирования цитозинов в CG и CNG последовательностях, степени ацетилирования гистонов и в плотной упаковке хроматина, делающего его недоступным для РНК полимеразы [Lee et al., 1993]. Предполагается, что модификация гистонов [Owen-Hughes, Workman, 1994] и метилирование ДНК [Martienssen, Richards, 1995] непосредственно задействованы в установлении транскрипционного статуса локуса генов рРНК.
Дифференциальная экспрессия генов рРНК у полиплоидных пшениц, проявляющаяся в ядрышковом доминировании одних локусов над другими, давно и хорошо известна, однако причины, ее вызывающие, до сих пор до конца не ясны. Секвенирование МГС рДНК локусов NorB2 и NorD3 мягкой пшеницы Triticum aestivum [Barker et al., 1988; Lassner et al., 1987], а также характеризующейся слабым ядрышковым организатором (ЯОР) диплоидной пшеницы T.urartu [Вахитов и др., 1989] и обладающего наиболее сильным ЯОР диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata [Куликов, Вахитов, 1995], позволили обнаружить у этих видов серьезные отличия в структурной организации всего МГС и промоторной области в частности, включая сайт инициации транскрипции [Ахунов и др., 1997; Akhimov et al., 2001], во многом объясняющие феномен ядрышкового доминирования. Однако, роль метилирования конкретных цитозинов, находящихся в промоторной области рДНК пшениц, в дифференциальной экспрессии этой генной системы остается неизвестной, хотя одна из гипотез связывает ядрышковое доминирование с особым состоянием гистоновых белков и метилированием цитозиновых остатков. Выявленные ранее у T.urartu и Ae.umbellulata (путем блот-гибридизации тотальной ДНК этих видов, расщепленных комбинациями рестрикционных эндонуклеаз-изошизомеров Mspl/Hpall и EcoRU/Mval, по-разному чувствительных к метилированию) отличия в метилировании цитозиновых остатков в рДНК в целом [Фатхутдинова и др., 1998] лишь констатировали данный факт.
Благодаря заметной вариабельности некоторых участков рДНК и в тоже время высокой эволюционной консервативности этой генной системы исследование МГС представляет еще и дополнительный интерес ввиду возможности использования сравнения его нуклеотидных последовательностей для выявления филогенетических связей между родственными видами, включая пшенично-эгилопсныи альянс, поскольку в нем остается еще довольно много неясных моментов. Цель работы заключалась в выяснении особенностей структурно-функциональной организации промоторных областей МГС рДНК отдельных субгеномов полиплоидных пшениц и геномов диплоидных пшениц и эгилопсов - доноров и потенциальных доноров A, D, В и G субгеномов полиплоидных пшениц, а также в установлении филогенетических взаимоотношений в трибе пшеницевых и выявлении (уточнении) предполагаемых доноров субгеномов для полиплоидных пшениц.
Задачи исследования. Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: определить нуклеотидные последовательности промоторных областей МГС рДНК пшениц и эгилопсов T.timopheevii, T.sinskajae, Ae.speltoides, Ae.longissima, Ae.sharonensis, Ae.aucheri, Ae.bicornis, Ae.searsii, Ae.tauschii ssp. tauschii и Ae.tauschii ssp. strangulata; провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов МГС рДНК исследуемых видов и других представителей трибы пшеницевых и составить консенсусные коровью промоторы; определить характер и степень метилирования цитозиновых остатков в промоторных областях МГС рДНК субгенома A T.aestivum и генома А T.urartu как у растений, не подвергавшихся воздействию фитогормоном, так и после их обработки 6-бензиламинопурином.
Научная новизна и практическая значимость. Клонированы и секвенированы участки МГС рДНК Ae.speltoides, Ae.longissima, Ae.sharonensis, Ae.aucheri, Ae.bicornis, Ae.searsii, Ae.tauschii ssp. tauschii, Ae.tauschii ssp. strangulata, T.sinskajae, T.timopheevii. Причем для T.timopheevii были получены сведения об обоих субгеномах и, таким образом, впервые оказался секвенированным фрагмент рДНК, принадлежащий субгеному А в составе полиплоидного вида пшеницы. Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей промотора МГС рДНК позволил составить консенсусные варианты коровых промоторов для пшеницевых и злаков. Множественное выравнивание фрагментов МГС рДНК пшениц и эгилопсов от положений -138/-140 до +124/+125/+127 относительно старта транскрипции позволило построить филогенетическое древо, свидетельствующее о том, что наиболее вероятным донором субгенома А полиплоидных пшениц ряда timopheevii была диплоидная пшеница T.sinskajae, а субгеномов В и G - диплоидный эгилопс Ae.speltoides.
Определены нуклеотидные последовательности промоторов МГС рДНК субгенома A T.aestivum и генома A T.urartu после обработки растений БАП с последующим дезаминированием ДНК при помощи метабисульфита натрия, что позволило выявить изменения характера и степени метилирования конкретных цитозиновых оснований под действием этого фитогормона.
Полученные результаты расширяют представления о механизмах регуляции транскрипции рДНК у растений и помогают более полно раскрыть филогенетические взаимоотношения в пшенично-эгилопсном альянсе, причем последнее крайне важно для создания новых видов и сортов, обладающих лучшими хозяйственными свойствами.
Субповторы МГС
Принято считать, что МГС это нуклеотидная последовательность, расположенная между З -концом 25S рРНК и 5 -концом 18S рРНК. Его разделяют на нетранскрибируемый и внешний транскрибируемый спейсеры. Граница внешнего транскрибируемого спейсера начинается с нуклеотида, соответствующего старту инициации транскрипции, и простирается до начала последовательности, кодирующей 18S рРНК. Выделение нетранскрибируемого спейсера как отдельной части МГС не совсем правильно, особенно для тех случаев, когда нетранскрибируемый спейсер оказывается транскрибируемым. Например, МГС у Xenopus (Moss, 1983) и у дрозофилы (Tautz et al., 1986) транскрибируется. Кроме того, в нетранскрибируемом участке спейсера обнаружены так называемые спейсерные промоторы, нуклеотидные последовательности которых гомологичны коровому промотору и с которых тоже, как показано в системах транзиентной экспрессии в протопластах и in vitro, происходит процесс инициации транскрипции (Doelling et al., 1993), а значит и весь участок, расположенный далее по ходу транскрипции, тоже транскрибируется. В некоторых случаях, как это обнаружено для пшеницы, РНК полимераза I, не терминируя транскрипцию предыдущего повтора рДНК перед внешним транскрибируемым спейсером, вступает во второй цикл транскрипции следующего повтора (Vincentz, Flavell 1989).
Практически у всех изученных на сегодняшний день видов (организмов МГС примерно на половину состоит из тандемно организованных коротких субповторяющихся последовательностей. Размеры этих субповторов варьируют у разных видов. Например, для рДНК пшеницы характерны субповторы длиной 135 пн (Appels, Dvorak, 1982; Barker et al., 1988), у Viciafaba субповторы имеют длину около 325 пн (Yakura et al., 1983), у кукурузы (Toloczyki, Feix, 1986) и редиса (Tremousayge et al, 1988) в МГС встречаются субповторы длиной 200 и 100 пн, соответственно. Самые короткие субповторы длиной 21 пн были обнаружены в МГС рДНК у представителей семейства крестоцветных Brassica и Arabidopsis thaliana, у которых они организованы в несколько блоков, называемых А повторами (Gruendler et al., 1991; Bhatia et al., 1996). Помимо блоков А субповторов в МГС рДНК у крестоцветных обнаружены еще несколько типов субповторов большего размера, обозначенных как В, С и D. Субповторы В и С расположены в транскрибируемой части МГС рДНК (Gruendler et al., 1991). Причем за счет инсерций, делеций или дупликаций у одного и того же вида или внутри группы близкородственных видов может существовать несколько вариантов субповторов с разной длиной. Например, у эгилопсов обнаружены два основных типа субповторов длиной 120 и 135 пн (Куликов, Вахитов, 1995). Аналогичный субповтор длиной 120 пн был также обнаружен в МГС генов рРНК, локализованных в NorD3 локусе гексаплоидной пшеницы Т. aestivum (Lassner et al., 1987), а в локусе рДНК NorB2 у того же вида обнаружены субповторы длиной 135 пн (Barker et al., 1988). Главные различия в длине этих субповторов у пшениц связаны с делецией или инсерцией нуклеотидной последовательности длиной 12 пн, расположенной в центральной части субповтора.
Причем, 12 субповторов, расположенных в центре, почти идентичны друг другу, а фланкирующие их два субповтора содержат небольшие делеции. Семейство В субповторов представлено тремя прямыми повторами, отличающимися друг от друга как длиной, так и нуклеотидной последовательностью. В1 и В2 субповторы имеют длину 152 и 150 пн, соответственно, а ВЗ субповтор - 107 пн. С-субповторы, локализованные в транскрибируемой части МГС, состоят из двух прямых повторов длиной 172 и 174 пн, которые в свою очередь могут быть подразделены на несколько более коротких субповторов длиной от 17 до 20 пн. D субповторы представлены двумя повторами длиной 30 пн. Кроме того, короткие мотивы входящие в состав С субповторов, встречаются несколько раз в области, расположенной между С субповторами и началом гена 18S рРНК. В отличие от NorB2 локуса, МГС рДНК, расположенный в NorD3 локусе, имеет различия в области А субповторов, которые представлены семью повторами длиной 120 пн (Lassner et al., 1987). У Ае. umbellulata образуется еще один тип коротких Е -субповторов длинной 26 пн (Куликов, Вахитов, 1995).
У риса другой принцип организации субповторов МГС рДНК: в МГС присутствуют три повтора длиной 253-264 пн, каждый из которых в свою очередь может быть подразделен на три субсубповтора длиной 150, 60 и 40 пн, где элементы одинаковой длины обладают очень высокой степенью гомологии. Степень гомологии между целыми субповторами несколько ниже, но можно предположить, что они произошли из предкового субповтора длиной 150 пн за счет процессов дупликации, делеции и гомогенизации посредством конверсии генов и неравного кроссинговера (Cordesse et al., 1993).
Регуляция транскрипции генов рРНК
Обнаружены,- по крайней мере, шесть различных связанных с метилированием модификаций нуклеотидов, которые были идентифицированы в заметных количествах в ДНК прокариот, эукариот, бактериофагов и вирусов. Наиболее часто встречающимся, в том числе у растений, является 5-метилцитозин, который имеет важное значение для многих процессов, протекающих в клетке. Одноклеточные эукариоты содержат в своей ДНК 6-метиладенин и 5-гидроксиметилурацил. 6-метилурацил и 7-метилгуанин обнаружены у насекомых и человека (Rein et al., 1998). У прокариот наиболее часто встречаются 6-метиладенин, 5-метилцитозин и намного реже детектируется 4-метилцитозин. Также обнаружен 5-гидроксиметилцитозин и его гликозилированная форма. Все эти модифицированные нуклеотиды влияют на рестрикцию и модификацию ДНК, а 6-метиладенин участвует в регуляции репликации и репарации ДІЖ.
Выявлено.что у растений ДНК метилирована в большей степени (до 25% цитозиновых остатков несут метильную группу), чем ДНК животных. И у растений, и у животных цитозин метилируется преимущественно в дуплетах CG и триплетах CNG, имеющих диадную симметрию (Graebaum et al., 1981). Причиной этого, по-видимому, служит метилирование новых цепей ДНК, возникающих при репликации, при помощи специфической метилтрансферазы, узнающей наполовину 23 метилированные сайты.
Влияние метилирования на уровень транскрипции генов рРНК еще недостаточно исследовано. В основном метилирование цитозина изучалось у млекопитающих в связи с раком, репрессией деятельности гена и импринтингом, хотя в настоящее время также исследуется влияние метилирования на молчание генов внесенных в трансгенные организмы (Babinger et al., 2001). Однако, в целом, наблюдается взаимосвязь между уровнем метилирования и активностью генов: более высокая степень метилирования ДНК соответствует более низкому уровню транскрипции генов, находящихся в этом участке (Kass et al., 1997; Jones et al., 1999; Baylin et al., 2000.). У животных распределение метилированных цитозинов не так равномерно, поскольку большая часть генома является GC-бедной, но некоторые части генома обогащены CG-последовательностями, так называемыми CG-островками, которые часто окружают первый экзон гена (Yoder et al., 1997). А у растений и грибов метилирование цитозина обнаруживается, главным образом, в транспозонах и других повторяющихся элементах (Rabinowicz et al., 1999). Также важно отметить, что у высших растений, помимо метилирования по симметричным сайтам в дуплетах CG и триплетах CNG, встречается и асимметричное метилирование (Babinger et al., 2001). Эти различия, вероятно, отражают "колонизацию интронов" млекопитающих транспозонами и другими "паразитными" последовательностями, скорее всего, метилирование происходит по краям экзонов (Colot et al., 1999). Было показано, что метилирование ДНК может способствовать увеличению количества мутаций (Rideout et al.,1990) и молчанию генов, чьи промоторы связаны с CG-островками (Jones, 1996, Baylin et al., 1998).
Важные данные получены по изучению РНК-направленного ДНК метилирования, которое заключается в метилировании почти всех 24 цитозиновых остатков внутри области взаимодействия комплементарных участков РНК и ДНК и вызывает посттранскрипционное молчание генов. Чаще всего РНК-направленное ДНК метилирование и посттранскрипционное молчание генов встречается если двунитчатая РНК содержит промоторные последовательности (Aufsatz et al., 2002)
Интересный опыт был проведен на линии клеток мыши (ЮТ 1/2), которые обрабатывали 5-азацитидином. Такая обработка привела к появлению двух типов дифференцированных клеток с фенотипами мускульных и жировых клеток (Taylor, Jones, 1979). Эти изменения наследовались в следующих поколениях. ДНК, выделенная из таких вариантов, была способна к стимулированию дифференцирования при трансфекции ее в недифференцированную родительскую линию (Jones, 1985). Схожие данные получены при изучении гена L-гистидин декарбоксилазы, они показывают корреляцию между метилированием ДНК и дифференцированием клеток (Satsuki et al., 2000). Также было выяснено, что 5-азацитидин и его дезокси версия 5-аза-2-дезоксицитидин приводят к потере метальных групп с каждым актом деления клетки (Juttermann et al., 1994). Это объясняется тем, что 5-азацитидин или его дезоксианалог препятствуют образованию ковалентной связи между цитидином и ДНК-метилтрансферазой.
Возможно, что метилирование влияет на транскрипцию косвенно, через изменение структуры хроматина, поскольку для генов рРНК X.laevis показано, что полностью метилированный промотор, с той же эффективностью что и неметилированный, способен инициировать транскрипцию генов рРНК in vitro (Reeder 1984). Однако, в опытах на трансгенных растениях было показано, что при метилировании цитозина в промоторной области внесенных генов транскрипция этих генов не происходила или была крайне мала.
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях
Электрофорез проводили в приборах подводного типа GNA-200 (Pharmacia, Швеция) или аналогичных приборах, изготовленных в инструментальной мастерской Уфимского научного центра РАН. Толщина используемых в различных экспериментах гелей варьировала незначительно от 2 до 4 мм. Гребенки для формирования колодцев имели толщину 1,5 мм и отличались шириной зубчиков (от 3 мм до 8 мм). Источниками питания служили прибор фирмы Bio-Rad модели 250/2.5 (США). В зависимости от размера разделяемых фрагментов использовали 0,5 - 2%-ные гели агарозы в трис-ацетатном буфере, рН 7,8. При разделении мелких фрагментов ДНК (до 2 тпн) градиент напряжения был 8-10 V на см геля. Это способствовало сокращению времени электрофореза и уменьшению диффузии (Sealey, Southern, 1982). В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК фага X после расщепления рестриктазами Eco9ll (изошизомер рестриктазы BstEII). После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл) в течение 20 мин. Одноцепочечную форму ДНК фагмид окрашивали акридиновым оранжевым (30 мкг/мл) в течение 30 мин, затем отмывали водопроводной водой в течение 1 час. Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе ТМ-36 (UV Products, Inc., США) или UVT 1 (Biokom, РФ).
Элюцию фрагментов ДНК из препаративного геля проводили из легкоплавкой агарозьг (Sealey, Southern, 1982). Предварительно разделенные в обычной агарозе фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием, и локализовали нужный фрагмент. Впереди него в агарозе вырезали лунку соответствующего размера, в которую заливали 1,5% легкоплавкую агарозу с добавленным к ней бромистым этидием. Последующим электрофорезом переводили нужный фрагмент ДНК из обычной агарозы в легкоплавкую. Скальпелем вырезали нужный фрагмент и проводили элюцию следующим способом. К расплавленной на водяной бане при 68С агарозе добавляли равный объем дистиллированной воды и раствор ацетата аммония до конечной концентрации 0,5М, встряхивали с фенолом и расслаивали в центрифуге К-24 (либо в микроцентрифуге MPW-50 (Польша)) при 12000 об/мин в течение 5 мин. Фенол удаляли встряхиванием с равным количеством хлороформа и последующим центрифугированием. Водно-солевой слой, содержащий ДНК, осаждали 2 объемами этанола при температуре -70С. Сформировавшийся осадок собирали центрифугированием, растворяли в соответствующем объеме воды и качество препарата проверяли путем аналитического электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле.
ПЦР проводили в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НСІ, 16,6 мМ (NH4)2S04, 1,5 мМ MgC12, 0,01% Tween-20, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 единицу ДНК-полимеразы. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94С, 2 мин); 20-30 циклов амплификации: 1) денатурация - 94С, 40 сек; 2) отжиг - от 50 до 65С, 1 мин (температура изменялась в зависимости от длины и нуклеотидных последовательностей используемой пары праймеров, подоборанных индивидуально для разных геномов); 3) элонгация - 72С, 1 мин; заключительное достраивание цепей ДНК - 72С в течение 4 мин.
После амплификации 10-20 мкл реакционной смеси, содержащей амплифицированную ДНК, фракционировали методом электрофореза в 1,0 - 1,5% агарозном геле в буфере ТАЕ при 10 V/см В течение 1-2 час. В качестве маркеров использовали ДНК фага лямбда, расщепленную рестриктазой BstEll.
Компетентные клетки E.coli штамма XL 1-Blue готовили по методу Ханахана (Hanahan, 1983). 1 мл ночной культуры определенного штамма E.coli штамма вносили в колбу на 500 мл со 100 мл LB (содержащей для штамма XL 1-Blue 12,5 мкг/мл тетрациклина) и наращивали клетки до D55o=0,3 при 37С, при интенсивной аэрации на орбитальном встряхивателе УВМТ 12-250. Затем собирали клетки центрифугированием в стерильных центрифужных стаканах в центрифуге К-23 при 3000 об/мин, 10 мин. Удаляли супернатант и осторожно суспендировали клетки в 25 мл холодного (4С) буфера I (10 мМ СаС12, 50 мМ МпС12 , 100 мМ КС1, ЗОмМ ацетат калия, рН5,8). Повторно проводили центрифугирование при 2500 об/мин, 10 мин. Удаляли супернатант как можно более полно и также мягко суспендировали клетки в 5 мл холодного буфера II (75 мМ СаС12, 10 мМ КС1, 15%-ный глицерин, 10 мМ MOPS, рН6,5). Оба буфера стерилизовали автоклавированием. Расфасовывали клеточную суспензию по 200 мкл в предварительно охлажденные стерильные полипропиленовые микропробирки и замораживали при -70С. Следует отметить, что все выше перечисленные операции неукоснительно выполнялись на льду в стерильных условиях в ламинарном боксе горизонтального типа (Flow, Шотландия).
Нуклеотидные последовательности участков МГС рДНК диплоидной пшеницы Triticum sinskajae генома А, тетраплоидной пшеницы T.timopheevii (субгеномы А и G) эгилопсов предполагаемых доноров субгеномов В, G и D
Также довольно коротким оказался секвенированный участок МТС рДНК диплоидной пшеницы T.sinskajae. Его размер составил всего 262 пн, из которых на долю пре-рРНК пришлось чуть меньше половины (125 пн), а область предшествующая старту транскрипции ( была секвенирована до положения-132 пн.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов были амплифицированы, клонированы и секвенированы фрагменты промоторных областей рДНК 10 представителей трибы шненицевых, из которых 6 видов принадлежат секции Sitopsis, 2 - секции Vertebrata, одним видом были представлены диплоидные пшеницы и для тетраплоидного вида пшеницы T.timopheevii оказались секвенированными оба его субгенома - А и G. Секвенированный участок пре-рРНК для эгилопсов и субгенома G T.timopheevii был равен 124 пн, но у Ae.tanschii ssp. strangulata он составил 127 пн. Как можно видеть, нуклеотидные последовательности МТС рДНК различных представителей эгилопсов и субгенома G Т. timopheevii отличаются по протяженности, за счет имеющихся вставок и делеций. Также различия в длине секвенированных фрагментов данной части промотора у секвенированных видов объясняются, во-первых, различающимися местами отжига тех или иных видоспецифичных праймеров, а также имеющими место делециями или вставками отдельных нуклеотидов или их блоков. У диплоидной пшеницы T.sinskajae секвенированные участки простирались до +125 пн благодоря дополнительному гуанину в положении +5. И для субгенома А тетраплоиднои пшеницы T.timopheevii тоже была секвенирована зона пре-рРНКдо+125пн.
7-ми- дневные проростки Т. aestivum и Т. urartu подвергали воздействию цитокинина (6-бензиламинопурин, БАП) в течение 18-ти часов, причем для Т. aestivum использовали концентрации 0,1 мкМ и 1 мкМ, тогда как для Т. urartu концентрации брали на порядок выше - 1 мкМ и 10 мкМ. Выбор данных концентраций БАП был сделан на основе наших экспериментов по измерению объема ядрышек у ди- и полиплоидных пшениц. Из обработанных и необработанных (контроль) растений выделяли тотальную ДНК, которая была дезаминирована метабисульфитом натрия (Na2S205). Время обработки подбиралось экспериментально и составило 4, 5, 6 или 8 часов. После этого очищенную от метабисульфита и прочих реагентов ДНК амплифицировали, используя праймеры meth 2А и meth 2, комплементарные кодирующей цепи ДНК с учетом ее дезаминирования. Эти праймеры амплифицировали участок длиной 247 пн, охватывающий область от -153 до +94 пн относительно СИТ в МГС рДНК. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле. Удовлетворительная амплификация была получена только при 4-х/часовой обработке, тогда как в остальных случаях амплификация не происходила. Полученные амплификаты денатурировали и разделяли вертикальным электрофорезом в полиакриламидном геле для выявления их полиморфизма (SSCP-анализ). Гель окрашивали нитратом серебра или в случае разделения меченных "горячими" нуклеотидами амплификатов радиоавтографировали на рентгеновскую пленку РА.
Для Т. urartu были получены следующие результаты. Амплификаты контрольных образцов дали только две полосы, немного отличающиеся по интенсивности. Эти полосы соответствовали разным цепям одного ПЦР-продукта. Для образцов Т. urartu, обработанных БАП в концентрациях мкМ и 10 мкМ, были получены четыре и шесть полос, что соответствовало двум и трем группам фрагментов ДНК, различающимся по конформации нитей (рис.3.3.1).
Сходные результаты были получены и для А-субгенома T.aestivum, где в контроле также выявлись две полосы. Для образцов T.aestivum, обработанных БАЛ в концентрациях ОД мкМ и 1 мкМ, были получены четыре и шесть полос (рис.3.3.2.).
Полученные полосы ДНК элюировали из геля и реамплифицировали. Продукты повторной ПЦР подвергали электрофорезу в агарозном геле с последующей элюцией интересующих нас полос. Элюированные из геля фрагменты ДНК были клонированы в векторе pBluescript II KS(-) с выступающими dT-концами. После чего полученные конструкции были трансформированы в штамм E.coli XLl-Blue, и высеяны на среду, содержащую IPTG и X-gal. Белые колонии анализировались на наличие вставок. Далее из полученных клонов были выделены одноцепочечные фагмиды, использованные в дальнейшем для секвенирования ДНК.
Были секвенированы участки МГС рДНК T.urartu и субгенома А T.aestivum после обработки растений БАП и без обработки (контроль), дезаминированные при помощи метбисульфита натрия.
Фрагмент МГС рДНК Xurartu, расположенный в области от 118 до +88 пн, дезаминированный при помощи метабисульфита натрия (полоса N1 - контроль). А - радиоавтограф секвенирующего геля. Б - нуклеотидная последовательность
Для растений Т. urartu, обработанных БАП в концентрации 1 мкМ, при SSCP-анализе выявлено две полосы (N1 и N2) и определены соответственно их нуклеотидные последовательности, одна из которых совпала с контрольной последовательностью, а другая отличалась от нее.
