Содержание к диссертации
стр.
Основные обозначения и сокращения 5
Введение 6
Глава 1 .Обзор литературы: Основные типы повторяющихся
последовательностей в геноме высших эукариот
1.1. Сатсллитная ДНК 9
1.1.1. Общая характеристика и структурная организация
тандемно организованных повторов и составляющих
их элементов 9
-
Основные классы сателлитной ДНК в геноме человека 10
-
Альфа-сателлитная ДНК — доминирующий класс
цептромериых ДНК 12
-
Иерархическая организация а-сателлитной ДНК 12
-
Происхождение и эволюция тандемно организованных
повторов 14
1.1.6. Значения для генома 17
1.2. Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности.
-
Общая характеристика рассеянных по геному повторяющихся элементов 19
-
ДНК-транспозоны 19
-
Ретротранспозоны 20
-
LTR-содержащие ретротранспозоны 21
-
Длинные ретропозоны 23
-
Короткие ретропозоны 27
-
7SL-РНК родственные КР 30
-
Происхождение и эволюция 7SL РНК-родственных КР 31
-
Малые РНК и их гены, ведущие происхождение от 78Ь-родственных КР 36
1,2.10, Значение КР для генома 37
^ 1,2,11. Перспективы использования КР в филогенетических
исследованиях 39
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы и реактивы, использованные в работе
-
Ферменты и наборы 40
-
Плазмидные векторы 40
-
Другие реактивы 40
-
Материалы 41 2.1.5.Приборы 41
-
Животные, ткани и ДНК 42
-
Выделение геномной ДНК 43
-
Дот-гибридшащін 43
-
Гибридизация по Саузсрну 44
-
Электрофорез ДНК в агарозном геле 44
2.6.1.Выделение ДНК из геля 45
-
Полимсразная цепная реакция (ПЦР) 45
-
Радиоактивное мечение ДНК 46
-
Создание геномных библиотек и их скрининг 46
-
Выделение плазмидной ДНК 48
-
Секвенирование ДНК 49
2.11.1. Секвенирование с использованием модифицированной
Т7 ДНК-полимеразы (секвеназы) 49
-
Секвенирование с использованием Taq-полимеразы 50
-
Секвенирующий электрофорез в ПААГ 51
2.12. Компьютерный анализ 51
Глава 3. Результаты
3.1. Изучение распространения 7SL РНК-родственных
SINE среди млекопитающих 53
-
Клонирование и секвенирование 75Ь-родственпых КР 55
-
Обнаружение и клонирование высоконовторнющихся последовательностей генома Tupaia glis 61
-
Основной короткий ретропозоп генома тупай 61
3.5. Основная тандемная последовательность генома Tupaia glis 67
Глава 4. Обсуждение результатов
-
Тапдемный повтор 72
-
78Ь-родственные короткие ретропозоны 72
-
Основной короткий ретронозон генома тупай 78 Выводы 82 Благодарности S3 Список литературы 84
Основные обозначения и сокращения
ДЭАЭ-иембрана
кДНК
ПААГ
ЭДТА
7SL-KP
LINE
SINE
FLAM
FRAM
диэтиламиноэтил-целлюлозпая мембрана
комплементарная ДНК
полиакриламидный гель
открытая рамка считывания
этилеидиаминтетрауксусная кислота
стандартный солевой раствор
додецилсульфат натрия
signal recognition particles
длинный ретропозон
короткий ретропозон
7SL РНК-родственные ретропозоны
long terminal repeats
long interspersed elements
short interspersed elements
fossil AIu monomer
free left Alu monomer
free right Alu monomer
proto Bl
Endogenous retroviruses
J>
Введение к работе
Несмотря на значительные успехи в исследованиях повторяющихся последовательностей ДНК, они остаются одним из наиболее загадочных компонентов геномов эукариотических организмов. Особый интерес представляют их происхождение и эволюция, а также роль в жизни и эволюции самих организмов. Повторяющиеся последовательности составляют значительную долю геномов эукариот и подразделяются на два основных класса — тандемные и рассеянные по геному. Тандемные повторы (сателлитная ДНК) занимают очень протяженные области в цеитромерных и прицентромерных частях хромосом. Длина повторяющейся единицы (мономер) сателлитной ДНК может варьировать у разных видов от 5 до нескольких сотен п.н. Число мономеров сателлитных последовательностей в геноме обычно исчисляется миллионами копий. В пределах одного биологического вида копии мономеров значительно меньше отличаются друг от друга, чем от сателлитных мономеров, выделяемых из родственных видов. Это происходит благодаря процессу так называемой согласованной (concerted) эволюции, основанной на неравном кроссинговере. В эволюции происходит довольно быстрая смена одних сателлитных ДНК другими, поэтому виды, принадлежащие разным родам, могут не иметь общих сателлитных последовательностей (Henikoff et al., 2001). Сателлитная ДНК, вероятно, вовлечена в формирование хромосомных центромер и, тем самым, должна играть определенную роль в митозе и мейозе (Lamb and Birchler, 2003).
Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности представлены, главным образом, различными видами мобильных генетических элементов, среди которых выделяют ДНК-транспозоны, ретротранспозоны (или LTR-co держащие транспозоны), а также длинные (ДР) и короткие ретропозоны (КР), более известные под названиями LINEs (long interspersed elements) и SINEs (short interspersed elements) соответственно (Deininger and Batzer, 2002; Smit, 1999). Мобильные элементы, за исключением ДНК-транспозонов, используют для размножения процесс обратной транскрипции. Причем, если ретротранспозоны и ДР кодируют свои собственные обратные транскриптазы, то КР используют обратную транскриптазу ДР. В геноме млекопитающих имеется лишь одно семейство активных ДР — L1 (не считая Bov-B крупного рогатого скота), тогда как КР разнообразны, и к настоящему времени известно не менее 30 семейств активных КР млекопитающих. КР (100-400 п.н.) значительно меньше, чем полноразмерпые копии других мобильных генетических элементов (4-7 т.п.н.). Обычно геном содержит от одного до трех семейств КР (Kramerov and Vassetzky, 2005) и каждое семейство, как правило, представлено 105-10б копиями. За исключением Alu-элементов приматов и В1-элементов грызунов, которые произошли от 7SL РНК (малой цитоплазматической РНК, участвующей в синтезе секретируемых белков), КР ведут свое происхождение от тех или иных видов тРНК. На 5'-конце таких КР располагается район, обладающий сходством с тРНК и содержащий промотор РНК-полимеразы III, который состоит из боксов А и В, расположенных на расстоянии 30-35 п.н. друг от друга. За тРНК-родственным районом следует участок неизвестного происхождения, специфичный для каждого семейства КР. На З'-конце КР находится А-богатая последовательность (млекопитающие и растения) или участок, состоящий из нескольких очень коротких прямых повторов (рептилии и рыбы). Многие свойства КР, как и других мобильных генетических элементов, свидетельствуют об их паразитической природе. Однако существование каждого семейства КР в геноме в течение многих миллионов лет делает их важными факторами эволюции. Например, встраиваясь около генов или в их интроны, они могут изменять транскрипцию и сплайсинг генов (Makalowski, 2000). КР могут играть важную роль в защите клеток от стресса (Allen ei al., 2004).
КР оказались хорошими филогенетическими маркерами, поскольку независимое возникновение одинаковых семейств КР событие крайне маловероятное (Serdobova and Kramerov, 1998; Shedlock and Okada, 2000). КР сохраняются в геноме на протяжении десятков и даже сотен миллионов лет. Поэтому все виды, имеющие данное семейство КР должны быть филогенетически более близки друг другу, чем тем видам, которые этим семейством не обладают.
Тупайи — группа млекопитающих, внешне напоминающих белок, состоящая из 5 родов и 18 видов, обитающих в Юго-Восточной Азии. Первоначально тупай относили к отряду насекомоядных, позднее стали считать наиболее примитивным семейством отряда приматов. (Этот взгляд остается весьма распространенным в отечественной литературе (Соколов, 1988; Фридман, 1979)). Затем их выдели в отдельный отряд - Scandentia (Butler, 1972; Павлинов, 2003). Однако до сих пор филогенетическое положение этих интереснейших млекопитающих остается неясным.
Тупайи (Т. giis и Т. belangeri) часто используются как лабораторные животные в физиологических и медицинских исследованиях (более 300 публикаций в год). Ценность тупай в этом отношении состоит в том, что они, видимо, ближе к приматам, чем любые другие лабораторные животные, а их содержание проще и дешевле, чем содержание приматов. Поэтому изучение генома тупай представляется, несомненно, важным для
> дальнейшего развития медико-биологических исследований, проводимых на этом модельном лабораторном животном. До сих пор об их генах и геноме было известно очень мало. Проведенный в данной работе анализ основных повторяющихся последовательностей ДНК Т. glis может послужить отправной точкой для дальнейшего развития геномики и молекулярной биологии тупай.
Цель и задачи исследования
Исходной целью данной работы было выяснение того, какие группы млекопитающих содержат в своих геномах 7SL РНК-родственные КР (В1 и Alu). Такие данные позволили бы сделать вывод о филогенетическом родстве этих млекопитающих. Также целью работы было охарактеризовать наиболее богато представленные в геноме Tupaia glis повторяющиеся последовательности. Работа проводилась в рамках проекта, целью которого было проверить гипотезу о том, что КР имеются в геномах млекопитающих всех отрядов. В ходе исследования планировалось решить следующие экспериментальные задачи. Используя гибридизацию ДНК, детектировать 7SL РНК-родственные КР в геномах млекопитающих, в частности предполагалось проверить, характерны ли они для многочисленных семейств отряда грызунов. Клонировать и секвенировать 7SL РНК-родственные КР из ряда видов, где они ранее не были описаны. Провести сравнительный анализ структур 7SL РНК-родственных КР из разных видов. Обнаружить, клонировать и секвенировать многокопийные повторяющиеся последовательности генома Tupaia glis. Провести анализ их нуклеотидных последовательностей.
