Содержание к диссертации
Введение
2. Ретротранспозоны (обзор литературы) 9
2.1.Классификация мобильных элементов дрозофилы 9
2.2. Строение ретротранспозонов 11
2.2.1. Особенности строения не-ДКП-ретротранспозонов 11
2.2.2. Структурная характеристика ДКП-ретротранспозонов... 14
2.3. Роль ретротранспозоиов в функционировании генома 17
2.3.1. Ретротранспозоны как фактор поддержания целостности генома... 17
2.3.2. Ретротранспозоны как фактор генетической изменчивости 18
2.4. Ретротранспозон МДГ4 и генетическая нестабильность 20
2.4.1. Структура ретротранспозона МДГ4 20
2.4.1.1. Белковые продукты открытых рамок считывания МДГ4. 22
2.4.1.1.1. Ген gag и его продукты 22
2.4.1.1.2. Геи pot и его продукты 23
2.4.1.1.3. Ген елV. 26
2.4.2. Генетическая нестабильность в мутаторной линии MS Drosophita melanogaster. 27
2.4.3. «Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 28
2.4.4. Tenjtamenco - регулятор транспозиции МДГ4 30
2.4.5. Сравнение ретротранспозиционнои активности двух вариантов МДГ4 33
2.4.6. Распределение двух вариантов МДГ4 в различных линиях Drosophita melanogaster. 37
2.5. Линия Г32 Drosophita melanogaster. 38
3.Материалы и методы. 41
3.1. Штаммы Е. coii, использованные в работе 41
3.2. Пранмеры, использованные в работе 41
3.3. Линии D. melanogaster, использованные в работе 41
3.4. Приготовление компетентных клеток 43
3.4.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК ... 43
3.4.2. Приготовление бактерий для заражения бактериофагом X. 44
3.5. Скрининг бляшек бактериофага X методом гибридизации 44
3.5.1. Заражение Е, colt бактериофагом Я 45
3.5.2. Перенос молекул неупакованной ДНК бактериофага X на нейлоновый фильтр 45
3.5.3. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда 46
3.5.4. Гибридизация 47
3.6. Выделение ДНК 48
3.6.1. Выделение плазмидной ДНК. 48
3.6.2. Выделение ДНК фага X. 51
3.6.3. Выделение геномной ДНК из мух 52
3.7. Рестрикция ДНК 53
3.7.1. Рестрикция плазмидной ДНК 53
3.7.2. Рестрикция ДНК бактериофага X... 54
3.73. Рестрикция геномной ДНК дрозофилы 54
3.8. Лиги рова Н и е 55
3.9. Саузерн-блот гибридизация 56
3.9.1. Перенос ДНК с агарозных гелей на нейлоновые фильтры 56
3.9.2. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда 57
3.9.3. Гибридизация на фильтрах по Са> зерну. 57
3.10. Секвенсирование двуцепочечной ДНК. 57
3.10.1. Заливка полиакриламидного геля для секвенирования 57
3.10.2. Секвенирование двуцепочечной ДНК с помощью набора MBI Fermentas reader DNA sequencing kit. 59
3.10.3. Электрофорез в полиакриламидном геле. 61
4. Результаты. 62
4.1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 D, melanogaster... 62
4.2. Структурный анализ отобранных клонов 65
4.2.1. Выявление полноразмерных копий МДГ4 65
4.2.2. Структурный анализ полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32 67
4.2,2.1. Рестрищионный анализ полноразмерных копий МДГ4. 67
4.2.2.2. Секвенирование функционально валеного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированный из линии Г32 68
4.2.3. Исследование структуры неканонических клонов, имеющих гомологию с МДГ4 69
4.2.3.1. Саузерн-блот анализ отобранных кчоноб... 69
4.2.3.2. Рестрищионный анализ отобранных клонов. ... 73
4.2.3.3. Идентификация клонированного мобильного элемента 75
4.3. Ретротранспозон gtwirt 76
4.3.1. Сравнительный анализ структурной организации ретротранспозонов МДГ4 и gtwin 76
4.3.2. Исследование структуры третьей открытой рамки считывания ретротранспозонов gtwin, клонированных из линии Г32 77
4.3.3. Распределение копий ретротранспозона gtwin в линиях дрозофилы.. 78
5. Обсуждение 83
5.1. Распределение полноразмерных вариантов МДГ4 в геноме Drosophila melanogaster. 83
5.2. Мобильные генетические элементы в составе гетерохроматина: распространение и функции 84
5.3. Распространение ретротра неп озона gtwin в геноме дрозофилы, возможные причины амплификации в линии Г32 87
6. Выводы 90
7. Список литературы 92
Благодарности 102
Приложение 1 104
- Ретротранспозоны как фактор генетической изменчивости
- Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК
- Секвенирование функционально валеного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированный из линии Г32
- Мобильные генетические элементы в составе гетерохроматина: распространение и функции
Введение к работе
^ <2- О ?
Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы являются важным компонентом генома эукариот. У Drosophila meianogaster на их долю приходится около 10% геномной ДНК. Взаимодействие мобильных элементов с геномом клетки носит сложный характер: они могут встраиваться в различные участки клеточных генов (в их экзонные, интронные и регуляторные последовательности), что в большей или меньшей степени сказывается на экспрессии этих генов; в свою очередь клетка контролирует транспозиции мобильных элементов, препятствуя их активному перемещению.
Элемент МДГ4 (в англоязычной литературе известный как gypsy) - один из наиболее изученных ретротранспозонов дрозофилы. Особенности его структуры и инфекционные свойства позволяют говорить о МДГ4 как об эндогенном ретровирусе беспозвоночных. Подобно ретровирусам, он содержит три открытые рамки считывания (ОРС), а цикл его транспозиции проходит через стадию обратной транскрипции. Несмотря на то, что эндогенные ретровирусы являются предметом пристального внимания исследователей, в настоящий момент очень мало известно об их генетическом взаимодействии с организмом-хозяином Это обусловлено тем, что обычно в роли хозяина выступают позвоночные - трудные объекты для генетического анализа. Присутствие ретротранспозона МДГ4 в геноме классического модельного объекта D meianogaster дает уникальную возможность для детального изучения взаимоотношений ретровируса и клетки.
Ранее было показано существование двух подсемейств ретротранспозона, имеющих четкие структурпые различия и отличающихся друг от друга способностью к перемещениям Эти подсемейства получили условные названия «активное» и «неактивное».
«Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 различаются на уровне рестриктных
карт. В частности, наличие сайтов Hindlll (4483), Шиї (5335) и Clal (6939) является
характерной особенностью «активного» подсемейства. По всей видимости, «активный»
вариант МДГ4 является эволюционно более молодым и образовался в результате
постепенного накопления точечных мутаций, затрагивающих «неактивный» вариант.
Предполагается, что первым появился рестрикционный сайт Шиї, затем - Clal и, наконец,
Hindlll Такая последовательность событий подтверждается результатами
рестрикционного анализа геномной ДНК 20 исследованных линий мух. Исключением
является линия Г32. В этой линии присутствуют варианты МДГ4, которые содержат сайт
Hindlll, но не содержат сайтов Шиї и/или Clal. „.
Известно, что все копии МДГ4, клонированные^ Ионного
мутагенеза, содержали в кодирующей части сайт рестрикции Hindlll (4483), что позволило рассматривать его как маркер на принадлежность к «активному» подсемейству. В то же время, было показано, что участок, влияющий на ретротранспозиционную активность, расположен между сайтами рестрикции PvuII (2733) и КрпІ (3127). Замещения этого участка в «неактивном» варианте соответствующим участком из «активного» достаточно для повышения ретротранспозиционной активности такого варианта МДГ4 в культуре клеток, несмотря на отсутствие у такой копии сайта рестрикции Hindlll (4483). Таким образом, присутствие необычных копий в линии Г32 вызывает особый интерес. Можно предположить, что они образовались в результате рекомбинационвых процессов, затрагивающих «активный» и «неактивный» варианты, однако нельзя исключать вероятность того, что они относятся к новому, ранее неизвестному подсемейству МДГ4 (gypsy).
Цель и задачи иселедпмшия.
Целью данной работы явилось изучение структурных особенностей различных вариантов ретротранспозона D melanogaster МДГ4 в геноме линии Г32. Данное исследование было предпринято в рамках изучения возможных механизмов эволюции ретротранспозона МДГ4.
В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
Клонировать ДНК из линии Г32 D melanogaster, используя в качестве вектора бактериофаг ШЕМ11.
Провести скрининг геномной библиотеки линии Г32 и отобрать клоны, имеющие гомологию с последовательностью МДГ4 {gypsy).
Используя метод Саузерн-блот гибридизации, провести предварительный анализ выявленных клонов па предмет их соответствия различным областям МДГ4 (gypsy).
Провести детальный структурный анализ клонов, содержащих полноразмерный МДГ4 (gypsy), включая секвенирование функционально значимых участков.
Провести рестрикционный анализ клонов, содержащих последовательности, существенно отличающиеся от канонических.
Исследовать представленность в геноме дрозофилы неканонических полноразмерных ретротранспозонов, имеющих существенную гомологию с последовательностью МДГ4 (gypsy).
Научная новизна и практическая ценность работы.
В настоящей работе клонированы из генома D melanogaster и охарактеризованы 28 различных последовательностей, имеющих гомологию с МДГ4.
Среди них выявлено 4 полноразмерпых копии этого ретротранспозона, две из которых принадлежат к «активному» подсемейству, одна - к «неактивному»; еще одна копия оказалась гибридной У гибридного варианта присутствует сайт рестрикции Hindlll в положении 4483, наличие которого характерно для всех копий «активного» подсемейства, клонированных из систем инсерционного мутагенеза, однако отсутствуют, как у «неактивных» копий, рсстрикционные сайты Ми/ (5335) и Clal (6939). Определение нуклеотидной последовательности функционально важного для ретротранспозиционной активности МДГ4 района, расположенного между сайтами рестрикции PvuII (2733) и КрпІ (3127), показало, что у гибридного варианта она полностью соответствует последовательности «неактивных» копий. Можно предположить, что гибридный вариант возник в результате рекомбинационных процессов между «активной» и «неактивной» копиями, однако нельзя исключать вероятность того, что уникальность обнаруженной копии не ограничивается рестрикционной картой, и мы имеем дело с ранее неизвестным подсемейством МДГ4 (gypsy)-
Впервые были клонированы 4 копии нового неизученного мобильного элемента gtwin, входящего в группу Gypsy ретротранспозонов. Этот мобильный элемент, имеющий три открытые рамки считывания (ОРС), был открыт in silico в начале 2000-х годов. Проведен сравнительный структурный анализ МДГ4 и gtwin, показана их высокая гомология в области второй и третьей ОРС. Особенно интересным представляется тот факт, что наибольшая степень гомологии - до 77% как для нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей этих двух элементов - наблюдается в районе третьей ОРС. Последовательность ОРСЗ ретротранспозонов гомологична ретровирусному гену env, кодирующему компоненты, ответственные за взаимодействие вирусной частицы с мембранными рецепторами клетки Роль гена env эрантивирусов дрозофилы до настоящего времени остается неясной. Наиболее привлекательной кажется гипотеза о том, что продукт третьей рамки обеспечивает способность эрантивирусов к горизонтальному переносу и является аналогом env ретровирусов позвоночных. Для ретротранспозона дрозофилы МДГ4 (gypsy) была прямо показана инфекционность образованных им частиц. Высокая гомология генов env МДГ4 и gtwin позволяет предположить, что открытый недавно ретротранспозон gtwin также обладает инфекционными свойствами.
Исследованы особенности структурной организации третьей ОРС ретротранспозона gtwin, выявлено два варианта этого мобильного элемента, различающихся наличием или отсутствием стоп-кодона в середине третьей ОРС.
Изучено распределение копий ретротранспозона gtwin в геноме рода Drosophila. Показано, что в геноме D virilis и D. hydei копии этого мобильного элемента отсутствуют.
В геноме D melanogaster ретротранспозон gtwin представлен небольшим числом копий (2-6), обнаружена лишь одна линия (Г32), в геноме которой присутствует свыше 20 копий этого мобильного элемента. В культуре клеток ретротранспозон gtwin сильно амплифшщрован.
Полученные результаты открывают широкие возможности для дальнейших исследований эволюционных взаимоотношений в группе Gypsy ретротранспозонов и способности мобильных элементов МДГ4 и gtwin к горизонтальному переносу. Особый интерес представляют дальнейшие исследования линии Г32, в которой ретротранспозон gtwin значительно амшшфицирован.
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на ежегодных отчетных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2002, 2003, 2004 і.) и на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, апрель 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах
Ретротранспозоны как фактор генетической изменчивости
Ретротранспозоны локализуются в геноме как в эухроматине, так и в гетерохроматине, играющем ключевую роль в формировании центромерных и теломерных районов хромосом. Гетерохроматин обладает не только особыми цитологическими свойствами, но и имеет очень разнообразную структуру на молекулярном уровне. Особенностью этого компонента генома эукариот является обилие повторяющихся последовательностей: сильно повторяющихся простых сателлитных ДНК, перемежающихся сложно организованными «островами», значительная часть которых представлена именно ретротранспозонами. Их присутствие в гетерохроматине обнаруживается всегда. Однако их функции в большинстве случаев по-прежнему остаются невыясненными. Исключением можно считать два не-ДКП-ретротранспозона D. melcmogaster - TART и НеТ-А, играющих ключевую роль в формировании теломер [Данилевская. Пардю, 1999; PardueetaL, 1997J.
По существующей модели, поддержание целостности теломерных районов у дрозофилы происходит за счет транспозиции LINE-подобных элементов на концы хромосом. НеТ-А транскрибируется, причем промотор локализован на 3 -конце, обслуживая соседний элемент. Таким образом, получающийся продукт содержит неполные концевые повторы, что позволяет считать НеТ-А переходной формой от не-ДКП-ретротранспозонов к ДКП-ретротранспозонам [Danilevskaya et al„ 1997]. Образующаяся РНК, прочно ассоциированная с белковым комплексом, связывается с 5 -концом хромосомной ДНК, и ревертаза синтезирует цепь ДНК, используя свободный 3-гидроксил ДНК в качестве затравки. В результате наращивается теломерныи участок хромосомы. Синтез второй цепи и лигирование может осуществляться клеточными ферментами системы репарации [Levis et al., 1993J.
Влияние МГЭ на генетическую изменчивость организмов очень значимо. Еще Барбара МакКлинток в ходе работы с контролирующими Ac-Ds элементами у кукурузы показала, что мобильные элементы могут вызывать хромосомные перестройки [McClintock, 1956].
Параллельное расположение мобильных элементов на гомологичных хромосомах в результате рекомбинации может приводить к появлению делеции в одной хромосоме и дупликации - в другой. Рекомбинация между элементами внутри одной хромосомы приведет к выпадению участка в случае параллельной ориентации элементов, и к инверсии - при их антипараллельном расположении.
Интеграза ретротранспозонов, подобно транспозазе ДНК-транспозонов, способна вносить разрывы в ДНК. Достаточно хорошо изучена на молекулярном уровне инверсия в мутации Antp у дрозофилы, в результате которой происходит нарушение нормального развития и антенна преобразуется в ногу [Schneuwfy et at, 1987]. По краям этой инверсии располагаются два LINE-подобных ретротранспозона Doc. ДКП-содержащие ретротранспозоны также участвуют в хромосомных перестройках. На это указывает корреляция между их локализацией в известных местах эктопического спаривания хромосом и местах учащенного образования разрывов в результате облучения рентгеновскими лучами [Tchurikov et al., 1981]. Описаны случаи появления дупликаций и делеции у самок, гетерозиготных по разным аллелям локуса white, причем хромосомные перестройки возникают тогда, когда в одном геноме совмещаются два мутантных аллеля, обусловленных встраиванием одного и того же ретротранспозона в разных местах локуса white [Davis et al., 1987].
Существуют указания на непосредственное участие ретротранспозонов в микроэволюции на примере группы virilis. Различия между видами дрозофилы данной группы связаны с изменениями в структуре кариотипа. В ряде случаев показано присутствие ретротранспозона Penelope в местах разрывов хромосом, что может указывать на возможный механизм перестройки генетического материала, лежащий в основе видообразования [Евгеньев и др., 1998; Evgen ev et al, 2000].
Помимо эктопической рекомбинации между МГЭ, приводящей к хромосомным перестройкам, значимую роль в мутагенезе играет непосредственно транспозиционная активность мобильных элементов. В частности, у дрозофилы порядка половины мутаций с морфологическим эффектом вызваны инсерциями МГЭ [Finnegcm, 1992].
Показано, что повышенная частота перемещений МГЭ в определенных условиях может давать популяции преимущество. В инбредной линии НА, которая в течение долгого времени подвергалась селекции на низкую жизнеспособность, спонтанно возникающая генетическая нестабильность (перемещение целого ряда ретротранспозонов) сопровождалась увеличением жизнеспособности [Pasyukova et al, 1986]. Но все же, считается, что большая часть инсерционных мутаций вредна для организма, причем эффект каждой мутации невелик [Charleworth, 1989].
Тем не менее, повышенная частота транспозиции, в случае ретроэлементов, ведет к накоплению их в геноме хозяина. Это может приводить к учащению эктопических обменов с участием МГЭ. Исходя из предположения, что частоты обычной рекомбинации и эктопических обменов коррелируют между собой, была высказана гипотеза о том, что мобильные элементы должны накапливаться в участках хромосом со сниженной частотой рекомбинации. Более низкая частота обменов снижает риск хромосомных перестроек, следовательно, МГЭ, локализованные в районах с низким уровнем обменов, менее вредны и слабее элиминируются отбором. Эти предположения не нашли широкого подтверждения, тем не менее, существуют экспериментальные доказательства накопления ретротранспозонов в районах, экранированных от рекомбинации - в редких инверсиях [Eanes et al., 1992; Sniegowski, Charlesworth, 1994].
Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК
Из коллекции, хранящейся в жидком азоте, высевали методом истощающего штриха штамм E.coli XLl-BIue на чашку с LB агаром и тетрациклином. Инкубировали чашку при 37С до появления крупных колоний (16 - 20 часов). Переносили 10 колоний в 250 мл среды SOB (на один литр среды: 20 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl; доводили рН до 7,5 с помощью КОН и автоклавировали; непосредственно перед использованием добавляли 20 мл Ш MgS04) в колбу на 2 л (при наращивании клеток очень важна аэрация). Инкубировали при 18-25 С в течение ночи до достижения культурой оптической плотности 0,6 - 1,0 ОЕ при длине волны бООнм. Помещали колбу на 10 минут в снег, перемешивали ее содержимое круговыми движениями. Затем стерильно переносили содержимое колбы в пластиковые центрифужные пробирки на 50 мл. Центрифугировали 10 мин при 4 С на центрифуге К23 при 3 000 об./мин. Осадок суспендировали в 80 мл буфера ТБ (ЮмМ Pipes, 15мМ СаСЬ, 250мМ КО, Доводили рН до 6,7 ЮМ КОН. После доведения рН добавляли МпСЇ2 до 55мМ. Для приготовления 100 мл буфера ТБ смешивали: 0,302 г Pipes; 0,221 г СаСЬх2Н20; 1,715 г КС1; 200 мкл ЮМ КОН; 1,0885 г МпС12х4Н20). Инкубировали во льду 10 мин. Центрифугировали в том же режиме. Суспендировали осадок в 20 мл буфера ТБ. Медленно, по каплям, при непрерывном перемешивании добавляли DMSO до конечной концентрации 7 % (по объему). Инкубировали во льду 10 минут. Разделяли на аликвоты (по 400 мкл), переносили в холодные микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл и хранили в жидком азоте.
Из коллекции, хранящейся в жидком азоте, высевали методом истощающего штриха штаммы E.coti ХЫ-Blue MRA и XLI-Blue MRA (P2) на разные чашки с LB агаром. Инкубировали чашки при 37 С до появления крупных колоний (12-18 часов). Последующие этапы приготовления бактерий для заражения бактериофагом "к не отличаются для штаммов E-coli XLI-Blue MRA и XLI-Blue MRA (P2) [Маниатис и др., 1982].
Засевали отдельной колонией бактерий 30 мл жидкой богатой среды LB (на 1 л среды: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 600 мкл 10 М NaOH (рН 7,5)) с 0,2 % мальтозой в колбе на 500 мл и инкубировали в течение ночи. Выращивание в присутствии мальтозы повышает эффективность адсорбции бактериями бактерифага X. Этот сахар индуцирует мальтозный оперон, включающий ген IamBt который кодирует рецептор бактерифага X. [Маниатис и др., 1982],
Стерильно переносили содержимое колбы в пластиковую центрифужную пробирку на 50 мл. Центрифугировали 10 мин при комнатной температуре на центрифуге К23 при 3 000 обУмин. Удаляли надосадочную жидкость и суспендировали осадок в стерильном 0,01 М MgS04 (0,4 объема исходной культуры). Хранили клетки при 4С. Полученную суспензию бактерий использовали в течение месяца. Для гибридизации бляшек бактериофага Я переносили молекулы неупакованной фаговой ДНК, присутствующей в бляшках, на нейлоновый фильтр. ДНК фиксировали на фильтре прожиганием в ультрафиолете. После гибридизации с зондом, меченым 32Р, фильтр подвергали радиоавтографическому анализу. Бляшки бактериофага, ДНК которых гибридизуется с радиоактивным зондом, отбирали для дальнейшей работы [Маниатисидр., 1982]. Стерильно смешивали 40 мкл суспензии бактериофагов, предназначенных для скрининга, с 0,2 мл суспензии высеваемых бактерий: штамм XLl-BIue MRA (Р2) Е. coli (этот штамм используют для селекции против нерекомбинантных фагов). Количество суспензии бактериофага X для заражения подбиралось таким образом, чтобы на чашке образовывались отдельные бляшки. Инкубировали 30 мин при 3 г С. Добавляли 6 мл расплавленной (50С) верхней агарозы (на 1 л среды (рН 7,5): 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 7 г агарозы (до 0,7 %), 600 мкл ЮМ NaOH) и выливали в чашку (140 мм) с LB-агаром (на 1 л среды (рН 7,5): 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 15г агара (до 1,5%), 600 мкл ЮМ NaOH). Чашки с агаром предварительно подсушивали несколько часов при 37С. Инкубировали при 37С, пока диаметр бляшек не достигал примерно 1,5 мм. Охлаждали чашки, выдерживая их 1ч при 4С5 чтобы верхняя агароза затвердела. Вырезали круглые нейлоновые фильтры по размеру чашек и нумеровали их. Стерильно накладывали нейлоновые фильтры на чашки. Ассиметрично метили фильтры и агар под ними раскаленной в пламени горелки иглой. Через 60 сек. снимали фильтры пинцетом и высушивали их при комнатной температуре. Помещали фильтры (с ДНК на верхней стороне) в ванночку с денатурирующим раствором (0,5 М NaOH; 1,5 М NaCl) на 1 мин. Затем переносили фильтры в ванночку с нейтрализующим раствором (1,0 М трис-HCl, рН 8,0; 1,5 М NaCl ) на 5 мин. Высушивали фильтры при комнатной температуре. Прожигали фильтры в ультрафиолете по одной минуте с каждой стороны. При этом ДНК связывалась с фильтром. Для приготовления радиоактивного ДНК-зонда использовали фрагменты, полученные в результате обработки плазмидиой ДНК специфическими рестрикционными эндонуклеазами (см. пункт 3.7.1.). Выделение фрагмента ДНК для приготовления радиоактивного зонда Выделение фрагментов ДНК из геля осуществляли с использованием фирменного набора MBI FERMENTAS DNA EXTRACTION КШК0513. Проводили электрофорез ДНК в агарозном геле (использовался 1 ТАЕ-буфер). Вырезали скальпелем полоску геля, содержащую нужный фрагмент ДНК, используя лампу с длинноволновым ультрафиолетовым светом. Переносили ее в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Добавляли 3 мл 6 М раствора Nal на каждый грамм агарозы. Инкубировали в водяном термостате при +55С до полного растворения агарозы (10-15 минут). Добавляли несколько мкл «silica powder suspension» (5 мкл + 2 мкл на каждый мкг ДНК свыше 2,5 мкг). Перемешивали, инкубировали 10-15 минут в водяном термостате при +55 С.
Секвенирование функционально валеного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированный из линии Г32
Секвенирование функционально важного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32 Функционально важный для ретротранспозиционной активности МДГ4 участок расположен между сайтами рестрикции Pvull (2733) и КрпІ (3127) (Рис. 5). В этом районе «активная» копия отличается от «неактивной» пятью нуклеотидными заменами, три из которых приводят к двум заменам аминокислот; Thr - Asn (нуклеотид в положении 2928) uLys-Arg (нуклеотиды в положении 3107,3108). Для сравнения нуклеотидной последовательности района Pvull/Kpnl «активных» (клоны 8.1 и В18), «неактивной» (клон 4.1) и необычной (клон В10) копий МДГ4 из линии Г32 с описанными ранее «активным» и «неактивным» вариантами [Lyubomirskaya et at., 1990; Lyubomirskaya et at., 1993J, проводили их частичное секвенирование. В качестве праимера использовали последовательность 5 -gaa tac cag ggc ate get g-3 , комплементарную области 2696-2714 ретротранспозона МДГ4. При сравнении полученных нуклеотидных последовательностей с описанными ранее использовали программу BLAST, доступную в Internet (http;//www,ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Проведенный анализ показал, что нуклеотидная последовательность района PvuII/Kpnl у клонов 8.1 и В18 полностью соответствует последовательности ранее описанного «активного» варианта; у клонов 4.1 и В10 - последовательности «неактивного». гибридизовапи с меченными Р фрагментами ДНК, практически полностью перекрывающими последовательность МДГ4 (Рис.9): I) зонд 2 - ffpal-Psil (ДКП), 2) зонд 3 - Ncol-Pvull (область гена gag), 3) зонд 4 - Hindlll-HindUl (частично область гена/?»/), 4) зонд 5 - Hindlll-EcoRI (частично область гена рої - область гена env). Результаты Саузерн-блот гибридизации приведены на рис. 11 и суммированы в табл.3. Очевидно, что клоны, содержащие полноразмерный МДГ4 (4.1, 8.1, В10 и В18), гибрид изуются со всеми четырьмя зондами, поэтому в таблице результаты для них не приведены. Как видно из таблицы, остальные клоны можно разделить на 5 групп.
К первой, наиболее многочисленной, относятся последовательности 10-ти клонов {1.1, 6.1, 9.1, 1.3, В2, ВІЗ, В15, В25, ВЗО, В36), имеющих гомологию со всеми использованными зондами. Строение этих вариантов значительно отличается от канонических полноразмерных копий МДГ4. Сюда же можно отнести клон 40А, не гибридизующийся с фрагментом МДГ4 HindHI-HindUI (зонд 4). По всей видимости, эта копия подверглась делеционным перестройкам. Во вторую группу входят клоны, имеющие гомологию только с 3 концом МДГ4 (4.2, 12А). Исходя из результатов гибридизации, мы предположили, что эти клоны имеют лишь один длинный концевой повтор: З -ДКП. Такие варианты могли образоваться в результате встраивания в последовательность МДГ4 других мобильных элементов. Особый интерес у нас вызвали клоны \0Л, 12.1, 2.2 и 3.2, результаты гибридизации которых с использовавшимися ДНК-зондами оказались схожими, но в то же время значительно отличались от ранее описанных вариантов МДГ4. На основании этого мы решили выделить их в отдельную группу. Четвертая группа представлена клонами, у которых отсутствует гомология с последовательностью ДКП, но присутствуют последовательности, гомологичные всем трем ОРС МДГ4 (5.1, 7.1).
К пятой группе относятся клоны, гибридизующиеся лишь с одним-двумя использованными зондами, содержащими последовательности ОРС ретротранспозона (3.1, В8, В20, В22). По всей видимости, эти варианты являются следствием древних транспозиций МДГ4 в гетерохроматин, где копии этого элемента потеряли способность к перемещениям и подверглись значительным структурным перестройкам.
Для проведения более детального структурного анализа неканонических клонов проводили их рестрикционный анализ. Рекомбинантные вставки переклонировали по сайтам рестрикции ВатШ из фага ! в плазмидный вектор pBluescript II SK (-) ("Fermentas") и обрабатывали специфическими рестрикционными эндонуклеазами Bglll, Clal, EcoRI, Hindlll, Kpnl, PstI, Xbal, и Xhol в различных сочетаниях. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с меченными 32Р фрагментом ДНК МДГ4 Xhol — Xhol (Рис.9, зонд 1), содержащим полную последовательность ретротранспозона. На основании полученных данных были построены рестрикционные карты 24 клонов, содержащих неканонические последовательности МДГ4, после чего было проведено их частичное секвенирование в районах, имеющих гомологию с МДГ4.
Результаты проведенного структурного анализа показали, что большинство клонов содержат последовательности, имеющие гомологию с МДГ4, но значительно отличающиеся по своему строению от полноразмерного элемента. По всей видимости, эти клоны содержат сильно дивергировавшие копии из гетерохроматических и прицентромерных областей генома D. melanogaster. Несмотря на это, несомненно, представляет интерес их дальнейшее исследование. Такие копии, потерявшие способность к ретротранслозиции и постепенно накапливающие мутации в гетерохроматине, не подвергаются элиминирующему действию отбора. В результате рекомбинации между собой или с полноразмерными копиями, эти варианты способны образовывать новые, в том числе и активно перемещающиеся подсемейства мобильных элементов.
Мобильные генетические элементы в составе гетерохроматина: распространение и функции
Мобильные генетические элементы составляют примерно 10% всего генома дрозофилы. Считается, что мутации, вызываемые их инсерциями чаще всего вредны или, в лучшем случае, нейтральны. Их воздействию противостоит вырезание элементов за счет рекомбинации, регуляция их активности регуляторными факторами клетки и негативное давление естественного отбора.
Влияние МГЭ на работу генома, по-видимому, не ограничивается только функциональным взаимодействием, но осуществляется также на структурном уровне. Было замечено, что огромное количество мобильных элементов обнаруживается в гетерохроматине эукариот, причем гетерохроматические копии элементов структурно отличаются от их эухроматических вариантов. Однако до сих пор остается неясным вопрос о происхождении и роли измененных копий подвижных элементов. Единственный на сегодня случай, когда функция ретротранспозонов в гетерохроматине известна - это два не-ДКП-ретротранспозона, TART и НеТ-А, которые играют ключевую роль в формировании теломер [Biessman, Mason, 1997; Данилевская, Пардю, 1999].
Интересно, что разные семейства мобильных элементов локализуются в разных областях генома [Tcrrinoni et ah, 1997]. Некоторые ретротранспозоны, например ДКП-содержащий aurora и ЬШЕ-подобный G-элемент, обнаруживаются только в гетерохроматине. Другие, например, В104 и МДГ4, локализуются как в эухроматине, так и в гетерохроматине. ДКП-ретротранспозон МДГ1 имеет подсемейство МДГ1 et, которое по своей структуре незначительно отличается от эухроматического варианта, однако обнаруживается только в гетерохроматине [Shevelyov et ah, 1989]. Довольно часто можно наблюдать, что в гетерохроматине дефектные копии ретротранспозонов располагаются кластерами.
Общепринято считать, что ретротранспозоны, находящиеся в гетерохроматине, теряют способность к перемещениям. О том, насколько давно элемент попал в гетерохроматин, судят по тем мутациям, которые в нем обнаруживаются, по сравнению с его активными копиями. У элементов, имеющих длинные концевые повторы, можно также сравнивать между собой нуклеотидные последовательности обоих ДКП. У недавно встроившегося элемента концевые повторы идентичны, что обеспечивается механизмом ретротранспозиции. У неподвижных элементов в ДКП накапливаются мутации, причем чем дольше ретротранспозон присутствует в гетерохроматине, тем больше различия между двумя его ДКП.
Из 28 клонов, отобранных нами при скрининге геномной библиотеки линии Г32 D. melanogaster и имеющих гомологию с последовательностью МДГ4, только 8 содержали копии полноразмерных элементов МДГ4 и gtwin. Остальные 20 представляют собой сильно дивсргировавшие копии, либо фрагменты МДГ4. По всей видимости, эти последовательности были клонированы из гетерохроматических областей генома дрозофилы. Кроме того, следует учитывать, что для многих ретроэлементов характерна высокая гомология в области второй ОРС. Продукты гена рої обеспечивают процесс ретротранспозиции, поэтому его последовательность является довольно консервативной и имеет определенную степень сходства у различных семейств ретротранспозонов. Таким образом, отобранные при скрининге клоны могут содержать последовательности не только МДГ4, но и других, родственных ему мобильных элементов.
Структура этих клонов сильно отличается от канонической, однако их дальнейшее исследование представляет значительный интерес, поскольку о роли и функциях гетерохроматических копий ретротранспозонов по-прежнему очень мало известно.
Например, можно предположить, что белковые продукты копий, имеющих неповрежденные ОРС, но не несущих на концах ДКП (и потому не способных перемещаться), могут оказывать транс-действие на другие копии ретротранспозонов, встроившиеся неподалеку. Подобное развитие событий показано как для классических транспозонов, в частности - для Р-элемента, так и для ретротранспозонов, например, для МДГЗ [Гловер, 1988; Аведисов и др., 1998], Среди отобранных нами клонов есть два (5.1 и 7.1), имеющих гомологию со всеми тремя ОРС, но не с последовательностью ДКП. Более детальное исследование их структуры и кодируемых белковых продуктов поможет ответить на вопрос, могут ли они вызывать перемещения дефектных копий ретротранспозонов, имеющие нормальные ДКП.
Следует также учитывать, что неподвижные копии, постепенно накапливающие мутации в гетерохроматине, не подвергаются элиминирующему действию отбора. В результате рекомбинации между собой или с полноразмерными копиями, эти варианты способны образовывать новые, в том числе и активно перемещающиеся подсемейства мобильных элементов, и играть, таким образом, важную роль в эволюции МГЭ.
Кроме того, находясь в определенных условиях, дивергировавшие копии ретротранспозонов способны служить триггерами в процессах РНК-интерференции fSarot et а!., 2004]. По мере накопления данных о сложной и разнообразной структуре гетерохроматина, его участии в регуляции функционирования генома и поддержания целостности генетического аппарата клетки, меняется и представление о роли ретротранспозонов в гетерохроматине. Очевидно, что их присутствие там не случайно. Однако их роль в структурировании и организации генома как единого целого остается неясной и нуждается в детальных исследованиях.
