Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 8
3.1. Общая характеристика микоплазм 8
3.2. Структура и организация генома микоплазм 9
3.2.1. Повторяющиеся элементы в геномах микоплазм 10
3.2.1.1. Характеристика семейства вариабельных генов v/ЛА в М. gallisepticum 11
3.2.1.2. Типы повторяющихся элементов микоплазм 13
3.2.2. Сравнительный анализ геномов микоплазм 15
3.3. Системы репарации микоплазм 18
3.3.1. Двуцепочечные повреждения ДНК 18
3.3.2. Механизмы репарации двуцепочечных разрывов 21
3.3.3. Рекомбинационная репарация 24
3.3.4. SOS-ответ и прямая реактивация 25
3.3.5. Репарация неспаренных нуклеотидов 25
3.3.6. Эксцизионная репарация 26
3.4. Механизмы возникновения геномных перестроек 27
3.4.1. Типы рекомбинации 28
3.4.2. Мобильные генетические элементы 37
3.5. Заключение 37
4. Материалы и методы 38
4.1. Материалы 38
4.2. Методы 41
4.2.1. Методы работы с микоплазмой 41
4.2.2.Клонирование в клетках Е. coli и анализ клонов 43
4.2.3. Гибридизация мембран 44
4.2.4. Определение последовательности нуклеотидов методом Сэнгера 44
4.2.5. Полимеразная цепная реакция 45
4.2.6. Электрофорез в агарозном геле 47
5. Результаты 48
5.1. Взаимное расположение rrs\6 и rrsW на хромосоме 48
5.2. Анализ последовательности нуклеотидов повтора 53
5.2.1. Картирование генов 53
5.2.2. Гены 16S рРНК 56
5.2.3. Длинный прямой повтор 57
5.2.4. Спейсер между правым и левым плечами повтора 60
5.2.5. Дот-плот анализ 63
5.2.6. Сравнение последовательностей нуклеотидов генов, составляющих длинный прямой повтор, между двумя штаммами М. gallisepticum и между плечами повтора 68
5.3. Анализ участка ДНК, расположенного за нормальным изолированным геном 16S рРНК 70
5.4. Анализ последовательности нуклеотидов участка хромосомы М. gallisepticum А5969, содержащего локусы thyA-nrdFEl, S10 и ггп23-5 73
5.4.1. Анализ последовательности нуклеотидов локуса гт23-5 76
5.4.2. Кластер генов рибосомных белков S10 77
5.4.3. Ген лактатдегидрогеназы 79
5.4.5. Локус thyA-nrdFEl 80
5.5. Картирование участка начала репликации ДНК 86
6. Обсуждение результатов 89
7. Выводы 97
8. Список литературы 98
- Повторяющиеся элементы в геномах микоплазм
- Механизмы репарации двуцепочечных разрывов
- Определение последовательности нуклеотидов методом Сэнгера
- Сравнение последовательностей нуклеотидов генов, составляющих длинный прямой повтор, между двумя штаммами М. gallisepticum и между плечами повтора
Введение к работе
На рубеже XX—XXI веков стали активно анализироваться не только отдельные гены, но и полные геномы организмов. Сравнение последовательностей нуклеотидов целых геномов дало возможность поставить вопросы о минимальном числе генов, достаточном для жизнедеятельности клетки. Подсчет, проведенный с использованием разных предположений, дает оценку числа минимального набора в 250-350 генов.
Микоплазмы представляют собой класс объектов, чрезвычайно привлекательный для молекулярной биологии, поскольку существует возможность полной характеристики наиболее просто организованной самореплицирующейся клетки. Число генов в геноме микоплазм (примерно 500) близко к минимальному набору самовоспроизводящейся клетки.
Анализ полных геномов открывает перед нами тонкие детали устройства хромосомы. Например, выяснилось, что, большинство генов прокариот транскрибируется по направлению движения репликативной вилки. Кроме того, получила дальнейшее подтверждение гипотеза о возможности межвидового (горизонтального) переноса генов.
Обнаруживаются новые факты, связанные не только с поиском и аннотированием ранее неизвестных генов, но и с различными перестройками хромосомы. В частности, при изучении порядка следования генов в разных организмах, выяснилось, что порядок этот неконсервативен. Более пристальное изучение данной проблемы показало, что на коротких расстояниях, как правило, порядок генов сохраняется, то есть более консервативным является ближний порядок генов, причем длина консервативных участков в большинстве случаев определяется размером оперона. Таким образом, геном представляет собой динамическую структуру, в которой происходит обмен частями, и единицей обмена чаще всего является оперон. При анализе границ консервативных участков было показано, что большинство этих перестроек связано с перемещениями мобильных элементов или является результатом гомологичной рекомбинации.
Некоторые особенности строения генома остаются пока недоступны для понимания, поскольку непонятны механизмы их возникновения. В связи с этим возникают задачи, имеющие отношение не столько к структурному анализу генома, сколько к пониманию механизмов процессов, лежащих в основе формирования, поддержания и изменчивости этой структуры.
На протяжении многих лет в нашей лаборатории изучали бактерию Mycoplasma gallisepticum. Интерес к представителю рода Mycoplasma связан с небольшим общим числом генов, что делает привлекательным использование микоплазм в качестве модели для изучения взаимосвязи генов на уровне экспрессии в целой клетке.
При изучении Mycoplasma gallisepticum был обнаружен ряд особенностей в геномной организации. Было показано, что варианты штамма А5969 из разных коллекций могут значительно отличаться по размеру хромосомы. Кроме того, в геноме штамма А5969 была обнаружена уникальная особенность, а именно: число генов 16S рРНК (определенное по гибридизации) оказалось не равным числу генов 23S и 5S рРНК. Во всех исследованных до настоящего времени бактериях количество генов 16S, 23S и 5S одинаково. Дальнейшие исследования показали, что дополнительная копия 16S рРНК представляет собой не полноценный ген, а укороченную копию. Кроме того, два набора генов рРНК отличаются по организации: гены первого набора рибосомных РНК собраны в «классический» для прокариот оперон с порядком генов 16S - 23S - 5S рРНК, во втором наборе ген 16S рРНК отделен от соседствующих генов 23S - 5S рРНК на значительное расстояние. Все это говорит о том, что в процессе эволюции у М. gallisepticum произошли крупные изменения в структуре хромосомы.
Целью настоящей работы было изучение процессов, приводящих к крупным изменениям хромосомы. Для достижения этой цели анализировались перестройки генома М. gallisepticum штамм А5969. В данной работе изучали структуру и организацию фрагментов ДНК, содержащих рибосомные РНК, и окружающие их участки, вовлеченные, по-видимому, в процессы, связанные с изменениями хромосомы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1 — картировать участки ДНК М. gallisepticum штамм А5969, содержащие расщепленный оперон рибосомных РНК и укороченный ген 16S рРНК;
2 — определить последовательность нуклеотидов этих участков, а также окружающих их областей хромосомы;
3 — изучить состав и расположение генов, а также особенности организации кластеров генов в картированных участках;
4 — выяснить устройство длинного прямого повтора в М. gallisepticum штамм А5969.
Повторяющиеся элементы в геномах микоплазм
Так как микоплазмы - это паразиты, они не могут существовать вне организма хозяина, и, поэтому, им приходится преодолевать иммунный ответ. В результате эволюции была выработана стратегия выживания, основанная на высокой вариабельности антигенных белков поверхности. Как правило, антигены входят в состав больших по численности семейств белков. Члены семейства имеют сходную, но не одинаковую первичную структуру. Каждый член семейства кодируется отдельным геном, причем в каждой клетке в данный отдельный момент времени экспрессируется один ген семейства. Каждое семейство занимает определенное место (локус) на хромосоме, и вариабельность обеспечивается за счет переключения экспрессии. Таким образом при одинаковом наборе генов становятся возможны различные фенотипы. Следовательно, повторяющиеся элементы можно рассматривать как генетический инструмент, позволяющий проводить изменения антигенных детерминант микоплазмы [1,22].
Вариабельные антигены микоплазм представлены генами vlhA - для М. gallisepticum, vsp - для М. bovis, vsa - для М. pulmonis, vaa - для М. hominis) [2, 23-25]. Так как общее строение этих генов почти одинаково, рассмотрим их устройство на примере М. gallisepticum. Наиболее изученными мультигенными семействами у микоплазм являются гены, кодирующие липопротеины VlhA (Vlh - variable lipoprotein) [26-29]. Основная функция этого семейства - определять антигенное разнообразие, и, следовательно, облегчать взаимодействие с иммунной системой хозяина в течение хронической инфекции.
Устройство каждого гена из семейства vlh схематично изображено на рис. 1. Внутри промоторного участка расположен олигонуклеотидный повтор (GAA)n, где п - количество тандемно расположенных повторов (изменяющееся в пределах от 2 до 27). От количества GAA-повторов зависит транскрипция генов vlhA: если повторов ровно 12, ген транскрибируется, если больше или меньше - не транскрибируется [30]. Число повторов изменяется в ряду поколений, обеспечивая включение и выключение отдельных генов. Переключение может произойти при любом делении, и тогда экспрессироваться будет другой ген. Механизм, ответственный за изменение числа повторов, на сегодняшний день не ясен, но предполагается, что это связано с проскоком полимеразы во время репликации [30] (см. стр. 32). Представляется удивительным, что из всех генов, имеющих GAA-мотив, всегда только один содержит ровно 12 повторов GAA.
Белок VlhA начинается с сигнальной последовательности, играющей роль в прикреплении липопротеина к мембране. Причем данная последовательность видоспецифична, расположена на N-конце белка у разных видов микоплазм и одинакова у всех членов семейства VlhA.
Гены vlh формируют самое большое семейство паралогов в геноме М, gallisepticum. Это семейство содержит 43 гена, общей длиной 103 т.п.н., распределенных в 5 локусов, содержащих 8, 2, 9, 12 и 12 генов. Гены названы в соответствии с с номером локуса и порядковым номером гена, например, у/Ш.01[13](рис.2).
Из 43 генов 38 обладают основными свойствами генов vlh А, а именно GAA-повторами на 5 -конце и сигнальной последовательностью в начале кодирующей области (рис. 1). Сходство последовательностей нуклеотидов среди этих 38 генов колеблется от 41 до 99 %. Пять генов (1.05, 2.01, 2.02, 5.01 и 5.02) также похожи по последовательности, но не обладают основными свойствами генов vlhA. Гены внутри каждого локуса находятся в одной транскрипционной ориентации, за исключением vlhAl.05, рядом с которым обнаружен ген, не имеющий отношения к членам семейства липопротеинов, а именно предполагаемая транспозаза.
Хромосомы микоплазм многих видов содержат повторяющиеся последовательности, причем доля их в геноме достигает 10 %. Большинство из них обладают гомологией с семейством перемещающихся IS-элементов (инсерционных элементов) IS3 (IS1221 М. hyorhinis и М. hyopneumoniae [31], IS 1296 М. mycoides [32]). Поскольку способность большинства этих элементов перемещаться по геному не была зарегистрирована, их часто называют IS-подобными элементами.
Повторяющиеся последовательности, не имеющие сходства с IS-элементами, также встречаются у микоплазм. Например, у М. genitalium обнаружены повторяющиеся элементы MgPar [6], обладающие сходством с семейством повторов Rep M.pneumoniae, а также с генами MG191 и MG192 оперона, кодирующего белки, обеспечивающие адгезию микоплазмы к эукариотической клетке. MgPar повторяется в геноме М. genitalium 14 раз [14], длина каждого повтора около 300 нуклеотидов.
Механизмы репарации двуцепочечных разрывов
Репарировать одноцепочечные повреждения можно, используя информацию, находящуюся на незатронутой разрывом цепи, но двуцепочечные разрывы не могут быть исправлены этим способом.
Один из способов репарации двуцепочечных разрывов, которые имеют тупые или комплементарные липкие концы - это простое соединение с помощью ДНК-лигазы. Однако, ДНК в месте разрыва может деградировать (при действии нуклеаз) или иметь выступающие некомплементарные концы. В этих случаях клетки прибегают к системе негомологичного соединения концов (NHEJ - поп homologous end-joining), который вначале назывался незаконной рекомбинацией [50, 51]. Термин «негомологичный» появился, как только выяснилось, что для этого механизма не нужно никакой гомологии. Чтобы подчеркнуть отличие данного процесса от всех видов рекомбинации, в середине 90-х его стали называть системой негомологичного соединения концов.
На сегоднящний день известно, что NHEJ эффективно восстанавливает двуцепочечные разрывы ДНК, не нуждаясь ни в какой гомологии, хотя необходимо отметить, что часть генетической информации при этом может быть утрачена.
Недавно гомологи белков, ответственных за этот процесс, были найдены и в бактериях. Ки - это основной белок, являющийся признаком присутствия системы NHEJ во многих организмах (рис. 7). Обнаружение гомологов Ки в прокариотах привело к открытию NHEJ-аппарата во многих видах бактерий. На рисунке 8 представлено филогенетическое распределение генов белка Ки среди разных бактерий.
Этот белок наиболее распространен среди протеобактерий (а, Р, у и 5-семейства), грам-положительных бактерий (firmicutes) и актинобактерий. Однако, надо заметить, что гены белка Ки присутствуют далеко не во всех организмах. В частности, в микоплазмах пока таких белков не найдено, но не всегда отсутствие в геноме гомологов для искомых генов говорит об отсутствии ферментативной активности. Подобная «пропажа» гена и соответствующего ему фермента может быть обусловлена несколькими причинами: 1) низким уровнем гомологии или присутствием нового гена, кодирующего фермент с той же или сходной функцией; 2) некорректной аннотацией генов в базах данных; 3) функционированием белка как мультиферментного комплекса.
С другой стороны, поскольку не было обнаружено каких-либо отчетливых филогенетических взаимодействий между бактериями, обладающими аппаратом NHEJ, и не обладающими таковым, существует гипотеза о том, что система NHEJ появилась в бактериях благодаря горизонтальному переносу генов [50]. Экспериментальные данные о существовании функционирующего NHEJ-комплекса были получены для трех типов бактерий: bacillus, mycobacteria и pseudomonas. Альтернатива NHEJ - это репарация с использованием другого ДНК-дуплекса с идентичной или почти идентичной последовательностью ДІЖ. Это возможно благодаря рекомбинационной репарации [52].
На сегодняшний день известно более 40 белков, участвующих в процессе рекомбинационной репарации [53-55]. У микоплазм рекомбинационный аппарат сильно редуцирован. Типичные ферменты, ответственные за инициацию рекомбинации (RecBCD, AddAB, RecQ, RecJ RecF), у микоплазм не найдены, однако присутствующие белки позволяют проводить необходимые для рекомбинации реакции. Для связывания ДНК с RecA необходимо действие хеликазы и 5 -3 экзонуклеазы, чтобы освободить одноцепочечный 3 -конец [54- 56]. Предполагается, что у микоплазм инициация рекомбинации происходит с помощью хеликазы РсгА [57] и 5 -3 -экзонуклеазы, обнаруженной в микоплазмах [37]. RecA, необходимый для обмена цепями, выявлен во всех проанализированных геномах [5, 13-20]. Комплекс, ответственный за миграцию ветви (RuvAB), присутствует в микоплазмах, но фермента, разрезающего структуру Холлидея (резолвазы), RuvC, у них нет. Разрешение полухиазмы возможно с помощью RecU -эндонуклеазы, распространенной среди грам-положительных бактерий [58]. Самое большое количество рекомбинационных генов обнаружено у М. synoviae. У этой микоплазмы идентифицировали домены из RecD, RecR и RecO. Эти белки - части ферментных комплексов RecBCD и RecFOR, обеспечивающих альтернативные варианты инициации рекомбинации [55, 59-61].
Определение последовательности нуклеотидов методом Сэнгера
Радиоактивную метку в 5 -конец олигонуклеотида вводили с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 [87]. В каждой из четырех пробирок, помеченных «A», «G», «С» и «Т» собирали смесь: 0,5 пкМоль меченого праймера, 2 мкл 5-кратного буфера для 7я#-полимеразы, 2 ед. 7я#-полимеразы, 5,2 мкл терминирующей смеси нуклеотидов соответствующей буквы, 0,5 пкМоль ДНК. Пробирки помещали в машину для амплификации.
Программа: I шаг: 95 С, 3 мин (1 цикл); II шаг: 95 С, 30 сек., 55 С, 30 сек., 70 С, 60 сек. (15 циклов); III шаг: 95 С, 30 сек., 70 С, 60 сек. (15 циклов); IV шаг: 20 С, 1 мин. (Іцикл). После окончания программы в каждую пробирку добавляли по 7 мкл стоп раствора и проводили денатурирующий форез в 5%-ном полиакриламидном геле и радиоавтографию, как описано в [99]. Растворы: 5-кратный Гад-буфер (250 тМ Трис-HCl рН 8,2; 35 тМ MgCb); стол-раствор (95%-ый формамид; 5тМ ЕДТА; 0,05%-ный бромфеноловый синий); терминирующие смеси [100] (dNTP - ЗОмкМ, ddATP(3 F) - 144 мкМ, ddGTP(3 F) - бОмкМ, ddCTP(3 F) - 39мкМ, ddTTP(3 F)-108MKM) Для секвенирования делеционных производных в векторах рТМ18/19 в качестве затравки использовали вектор-специфический праймерА. Для определения последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК в векторах pTZ18/19 использовали стандартные прямой (F) и обратный (R) праймеры для секвенирования M13/pUC. Последовательность нуклеотидов определяли с помощью сканера (Mouse Reader) фирмы «Sigma» (Z37, 231-5) США, соединенного с компьютером. В полученных последовательностях выявляли перекрывающиеся участки и составляли короткие фрагменты в единый контиг с помощью пакета прогамм GCG. ОТ-ПЦР-анализ. Для ОТ-ПЦР-анализа использовали 1 мкг кДНК в качестве матрицы. ГЩР проводили с тремя парами праймеров: гро (04-04F), rpol (06-06F), trm (07-07F) (см. табл. 2). ПЦР-смесь готовили согласно стандартному протоколу AdvanTaq PCR («Clontech»). Программа для ПЦР-амплификации: 94 С - 20 сек., 50 С - 30 сек., 72 С - 45 сек.; 25 циклов. ПЦР-анализ места стыка dhfr и dcd. Для амплификации места стыка генов dhfr и dcd использовали олигонуклеотиды ForlAT и RevlT (см. табл. 2). ПЦР проводилась в объеме 20 мкл. Смесь содержала: 5 нг ДНК М. gallisepticum, дезоксинуклеозидтрифосфаты (по 200 мкМ dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ПЦР-буфер (67 мМ трис-НСІ, рН 8,8, 16 мМ (NH SO 1,5 мМ MgCb, праймеры (1 мкмоль), 1 ед. Гяд-полимеразы). Параметры ПЦР: 95 С -30 сек., 60 С - 20 сек., 72 С - 90 сек.; 25 циклов.
Продукт длиной 1 т.п.н. (координаты 2393-3401, GenBank AF152114) секвенирован с использованием олигонуклеотида SeqlT в качестве праймера. Амплификация части генов йпаА и gyrB. Для амплификации части гена dnak использовали олигонуклеотиды DNAaF и DNAaR, для гена gyrB - GyrF и GyrR. В качестве матрицы использовали 5 нг ДНК М. gallisepticum. Параметры ПЦР: 95 С - 30 сек., 55 С - 20 сек., 72 С - 90 сек.; 25 циклов. Очистка продуктов ПЦР. Продукты ПЦР чистили от свободных нуклеотидов и низкомолекулярных фрагментов ДНК при помощи смолы Glassmilk на колонках Nucleospin (Clontech), используя прилагающиеся стандартные протоколы. Введение радиоактивной метки в ДНК. Смешивали в пробирке 20 нг ДНК, 1,5 мкл 10-кратного - праймера со случайной последовательностью нуклеотидов длиной 10 оснований (dN)io, Н2О из расчета суммарного объема 15 мкл. Смесь прогревали при 100 С 2 мин, потом ставили в лед на 1 мин. Затем добавляли 1,5 мкл смеси 10 dCw (d(A,G,T)TP 0,5 мМ), 1,5 мкл 10х RP-буфера (Трис-НСІ рН 7,5 при 37 С - 0,5 М; MgCl2 - 0,1 М; DTT - 10 мМ), 1,5 мкл 10х БСА (0,5 мг/мл), 25 мкКи [а-33Р] dATP, 2 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, смешивали, центрифугировали 1 мин. Далее смесь прогревали 30 мин. при 37 С, затем добавляли 5 мкл STOP-буфера (Трис-НС1 рН 7,5 - 50 мМ; NaCl - 50 мМ; ЭДТА - 5 мМ; SDS - 0,5 %; ДНК из селезенки крупного рогатого скота - 50 мкг/мл) и 30 мкл STE-буфера (Трис-НСІ рН 7,6 20 мМ; NaCl - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ). Меченый ПЦР-фрагмент чистили на колонке с сефадексом G-50 [87].
Сравнение последовательностей нуклеотидов генов, составляющих длинный прямой повтор, между двумя штаммами М. gallisepticum и между плечами повтора
Последовательность нуклеотидов в области длинного прямого повтора М. gallisepticum А5969 от гена гр/33 до псевдогена rrsW сравнили с аналогичной областью в штамме R0W. Результаты сравнения представлены на рисунке 25 (синие треугольники). Каждый треугольник показывает процент различающихся нуклеотидов в каждом из 19 генов (грВЗ - ml 6 ), расположенных на горизонтальной оси. Отличия в генах между штаммами составляют примерно 1 замену на 100 нуклеотидов, то есть 1 %. Эти различия равномерно распределены по длине повтора, за исключением гена деформилазы, в котором на рамку длиной 614 нуклеотидов приходится 33 различия между штаммами. Примечательно, что при сравнении последовательности нуклеотидов гена р-субъединицы РНК-полимеразы с тем же геном в штамме Riow, разница оказывается на том же уровне (1 %), то есть скорость возникновения мутаций в разных генах примерно одинакова. На этом же рисунке представлены результаты сравнения двух плечей повтора в штамме А5969 (красные квадраты). Из рисунка видно, что различия между плечами повтора примерно в 10 раз меньше по сравнению с различиями между последовательностями нуклеотидов двух штаммов. При сравнении межгенных пространств двух штаммов на этом участке среднее процентное отношение различий к общему количеству нуклеотидов равно 4,2 %. Интересно, что больше половины всех различий приходится на область, разделяющую гены ORF326 и деформилазу (из 64 нуклеотидов различаются 22 нуклеотида, что составляет 34 %). На оставшиеся 864 нуклеотида межгенных пространств приходится всего 17 ошибок, что составляет 1,97%. Таким образом, проведенный анализ показал, что количество различий в генах, составляющих повтор, аналогично количеству различий между другими генами в геномах двух штаммов (за исключением гена def). Примечательно, что отличия в кодирующих участках примерно одинаковы с некодирующими последовательностями. Итак, в результате проведенных исследований был обнаружен длинный прямой повтор в М. gallisepticum А5969 вар.
В, отличительные особенности которого: - длина плеча повтора составляет 15778 нуклеотидов; -плечи повтора разделены коротким спейсером размером 30 нуклеотидов, последовательность нуклеотидов спейсера одинакова с последовательностью нуклеотидов гена rplR. из кластера S10; -внутри повтора картировано 15 открытых рамок считывания, из которых для 12 функция определена, для остальных - не определена; все гены с известной функцией являются полноценными; картированные гены не объединены в один метаболический, либо сигнальный, либо регуляторный путь, то есть относятся к разным функциональным группам; -на границах плечей повтора не обнаружено ни прямых, ни обратных повторяющихся последовательностей. На следующем этапе был проанализирован участок, расположенный за повтором. Гены, выявленные в этом фрагменте, перечислены в таблице 4. Гены infA-rpB6-rpsl3-rpoA-rpl\7 расположены у М. gallisepticum (как в штамме А5969, так и в штамме Riow [13]) непосредственно после гена 16S рРНК (рис. 19, табл. 4). У близкородственных микоплазм (М. genitalium, М. pneumoniae, Ureaplasma urealyticum) и у Bacillus subtilis они являются концевой частью кластера рибосомных белков S10 [14,19,36,104]. Следующие за ними гены rpsl6rmD-rpl\9 у М. genitalium, М. pneumoniae, U. urealyticum и В. subtilis формируют отдельный кластер, не связанный ни с рибосомными РНК, ни с SlO-кластером. Таким образом, в М. gallisepticum обнаружен новый кластер рибосомных белков infA-rpl36-rpsl3-rpoA-rpl\7-rpsl6rmD-rpl\9, сформировавшийся путем слияния двух консервативных кластеров: фрагмента S10 (infA-rpl\l) и rps\6-rpl\9 (рис. 26). Надо отметить, что относительный порядок следования генов в обоих кластерах не изменился. Очень часто гены, входящие в состав кластера, формируют оперон. Поэтому интересно было бы выяснить особенности транскрипции новосформированного кластера. Можно отметить, что расстояние между кодирующими последовательностями внутри каждого кластера составляет 4-18нуклеотидов.
Относительно большое расстояние (74 нуклеотида) между rpl\7 urpsl6 может свидетельствовать о независимой транскрипции концевой части кластера рибосомных белков S10 и кластера trmD. Для проверки гипотезы о транскрипции новоорганизованного кластера как оперона решили использовать ОТ-ПЦР-анализ. Прямой подход заключается в том, чтобы с помощью ОТ-ПЦР показать наличие молекулы РНК, которая кодирует все гены оперона infk-rpl\9. Длина такой молекулы должна быть около 4 т.п.н. К сожалению, в нашем распоряжении не было ДНК-полимеразы, которая способна эффективно амплифицировать фрагмент такой большой длины. Поэтому был предложен альтернативный подход. Вместо амплификации длинного фрагмента использовали три коротких ампликона, расположенных в кластере, как показано на рисунке 26 (ампликон trm находится внутри кластера rps\6-rpl\9, гро - в середине кластера /и/А-rpl\7, a rpol - на краю этого кластера). Эти ампликоны использовались для выявления кДНК, синтезирующейся с набора антисмысловых олигонуклеотидов, покрывающих весь исследуемый участок (01 - 08). Следует ожидать, что для кДНК, синтезируемой с олигонуклеотидов, расположенных левее ампликона, продукт амплификации образовываться не будет. Таким образом, если данный кластер представляет собой оперон, ампликон гро должен выявляться для кДНК, синтезированной с олигонуклеотидов 04-08. Если же гены кластера разбиты на два оперона (/и/А. - rpl\l и rps\6 - г/?/19), то ампликон гро будет выявляться для кДНК, синтезированной с олигонуклеотидов 05-06, и не будет - с олигонуклеотидов 07-08. При этом ампликон trm должен выявляться с кДНК, синтезированной с олигонуклеотидов 07-08. На рисунке 26 приведены результаты проведенного анализа. Как и ожидалось, фрагменты не амплифицировались, если кДНК, используемая как матрица, была синтезирована с праймеров, расположенных левее тестируемого ампликона (рис.26, гро: 01-03, rpol: 01-05, trm: 01-06). Слабые полосы, видимые на этих дорожках, по интенсивности совпадают с полосой, полученной при синтезе кДНК в отсутствии специфических праймеров (рис.26, 00). Это явление можно связать с так называемой фоновой активностью обратной транскриптазы [105]. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии специфической обратной транскрипции при использовании праймеров, расположенных левее тестируемого ампликона.
