Введение к работе
Состояние проблемы и актуальность темы. Активные исследования последних лет демонстрируют серьезные изменения, происходящие по всему обширному ареалу Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу. С конца 70-х гг. в Европе генетическая изменчивость гриба резко возросла, и стала сравнимой по своему уровню с популяцией в Центральной Мексике, на родине этого паразита (хотя по другой теории родиной предлагают считать Перуанские Анды).
Из всего комплекса факторов, влияющих на популяционный полиморфизм этого вида фитофторы, можно выделить несколько основных.
Во-первых, это степень дивергенции вида по отношению к своим растениям-хозяевам. Она возрастает в процессе сопряженной эволюции. P.infestans является паразитом целого ряда диких клубненосных пасленовых из секции Tuberaria, но в основном вредит картофелю и томатам. В последние годы вредоносность фитофтороза на томатах сильно возросла, все больше распространяется стеблевая форма болезни. И вопрос об уровне специализации в этих паразитарных системах поднимается все чаще.
Во-вторых, генетическое разнообразие и характер популяционных группировок любого микроорганизма зависят от системы его размножения. До недавнего времени вне Центральной Мексики встречались изоляты P.infestans только одного типа спаривания - А1, и популяции были агам-ными. А с конца 70-х гт. в Европе и России стали обнаруживать изоляты противоположного типа - А2. Их появление делает возможным половое размножение этого гетероталличного оомицета, приводящее к рекомбинации признаков и резко увеличивающее адаптивные возможности паразита.
Третьим фактором, роль которого трудно переоценить, является миграция. Фитофтора с этой точки зрения является идеальным объектом, так как ее появление в разных странах строго документировалось. По этим данным и на основе анализа выборок разных лет сотрудникам Корнельско-го университета удалось представить схему нескольких миграций P.infestans, в результате которых гриб расселился практически по всему миру. Было также показано, что больше 130 лет (начиная с Ирландской эпифитотии 1845 г и до европейской засухи 1976 г, погубившей весь урожай картофеля, что заставило закупить его в Мексике) европейская популяция фитофторы была представлена единственным клоном. А в конце 70-х гг. в Европе «старые» изоляты А1 типа спаривания стали вытесняться «новыми», относящимися к обоим типам спаривания.
«Новые» популяции отличаются несколько более высокой агрессивностью, а также по биохимическим и молекулярным маркерам (изоферментным спектрам пептидазы и фосфоглюкоизомеразы, локусам, определяемым методом гибридизации ядДНК со специфическим зондом RG-57, представляющим собой фрагмент умеренных повторов, и по полиморфизму мтДНК). Причем, митохондриальные маркеры из-за небольших
размеров мт генома, его гашюидности и наследования без рекомбинации вне зависимости от способа размножения организма считаются одними из лучших для изучения миграционных процессов.
Наши коллекции P.infestans (в отличие от Мексиканских и Европейских) были охарактеризованы очень фрагментарно и в основном по мор-фолого-физиологическим признакам.
Цель и задачи исследования. Целью работы был анализ популяцион-ной структуры P. infestans, патогена картофеля и томатов, и возможных механизмов ее динамики на Европейской территории России в 1990-95 гг. с использованием молекулярных генетических маркеров.
Мы ставили перед собой следующие задачи:
-
подобрать митохондриальный маркер, удобный для анализа структуры и динамики генотипического состава популяций P.infestans;
-
оптимизировать метод тестирования изолятов по полиморфизму мтДНК;
-
сопоставить характеристики изолятов P.infestans по цитоплазматиче-скому и ядерным маркерам;
-
исследовать выборки изолятов P.infestans с использованием подобранного митохондриального маркера с целью анализа:
а) географической изменчивости P. infestans;
б) мониторинга состояния популяции гриба в течение эпифитотии;
в) многолетнего наблюдения за популяционной структурой паразита;
г) степени дивергенции вида P.infestans по отношению к двум расте
ниям-хозяевам - картофелю и томатам;
-
проанализировать вариабельность нуклеотидной последовательности полиморфного фрагмента мтДНК разных типов, встречающихся в исследованных выборках;
-
разработать подходы, обеспечивающие получение новых цитоплазмати-ческих маркеров, для более детального изучения генотипического разнообразия P.infestans и механизмов его формирования.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в нашей стране проведен комплексный анализ популяций P.infestans с использованием молекулярных характеристик, что позволяет сравнивать ситуацию, складывающуюся в России, с процессами, происходящими в других странах.
По данным анализа вариабельности полиморфного участка мт генома в комплексе с физиолого-биохимическими характеристиками продемонстрирована частичная генетическая изоляция между популяциями гриба, паразитирующими на картофеле и томатах, векторизованное вытеснение «старых» генотипов «новыми» и запаздывание миграционной волны в томатных популяциях по сравнению с картофельными.
Результаты изоферментного анализа показали существование в российских популяциях P.infestans до 1993г. включительно высоко гомогенной внутривидовой группы изолятов с lb типом мтДНК. 2
Разработан экспресс-метод для определения типа мтДНК P.infestans в чистой культуре и на инфицированном растительном материале, позволяющий проводить мониторинг популяционных изменений в процессе быстротечной эпифитотии.
Предложены подходы для разработки новых популяционных маркеров P.infestans - это поиск других вариабельных участков мт генома гриба на основе Long PCR-амплификации и анализ полиморфизма двуспираль-ной РНК в суммарных препаратах нуклеиновых кислот.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на I Всероссийском Съезде по защите растений (1995, С.-Петербург, Россия), V Конгрессе Европейского Общества Эволюционной Биологии (1995, Эдинбург, Шотландия), юбилейной фитопатологической конференции "Phytophthora-150" (1995, Дублин, Ирландия), III Европейской Конференции по Генетике Грибов (1996, Мюнстер, Германия), 13 Трехгодичной Конференции Европейской Ассоциации по Изучению Картофеля (1996, Вельдховен, Нидерланды), а также на научных семинарах, проводившихся на каф. молекулярной биологии биологического ф-та МГУ и в Колледже Биологических Наук Университета Северного Уэльса (Англия). Диссертация апробирована на совместном заседании сотрудников кафедр микологии и альгологии и молекулярной биологии в 1996 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы и сданы в печать 2 статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения и выводов; изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает наименований, в том числе на иностранных языках.
