Введение к работе
Актуальность проблемы. Центральную роль в биосинтезе физиологически активных веществ и окислении ксенобиотиков играют ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы, осуществляющей гидроксилирование молекул субстратов [Nelson et al, 1996]. Цитохромы Р450, обеспечивающие синтез стероидных гормонов, регулируют жизненно-важные функции в организме млекопитающих (эмбриональное развитие, процесс половой дифференциации, ответ на стресс и т.д.); нарушения синтеза стероидных гормонов приводят к серьезным заболеваниям и даже летальному исходу [Miller, 1988; Payne and Hales, 2004].
Первую ключевую стадию синтеза стероидных гормонов осуществляет холестерингидроксилазная/лиазная система, включающая FAD-содержащий белок адренодоксинредуктазу (AdR), железосодержащий белок адренодоксин (Ad) и цитохром P450scc (цитохром Р450 холестерингидроксилаза/20,22-лиаза, CYP11A1). AdR и Ad обеспечивают перенос электронов от NADPH к цитохрому P450scc, катализирующему трансформацию холестерина в прегненолон - исходное соединение для синтеза всех стероидных гормонов. Ряд деталей сложного процесса топогенеза основного компонента системы - цитохрома P450scc, пока не выяснен (не определены механизм тканеспецифичного импорта белка в митохондрии, способ включения белка в мембрану в отсутствие «классических» трансмембранных доменов и др.). Есть основания полагать, что исследования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы и их вариантов (полученных с использованием методов генной инженерии) в созданных в данной работе гетерологических моделях расширят общие представления о топогенезе митохондриальных белков, которые в виде предшественников адресуются в определенные компартменты митохондрии. Изучение особенностей тканеспецифичного импорта предшественника P450scc может служить источником информации для лучшего понимания механизма импорта белков.
Актуальность работ по созданию микроорганизмов, осуществляющих коэкспрессию белков холестерингидроксилазной/лиазной системы, обусловлена интересом к сборке и функционированию сложных Р450-монооксигеназных систем. Такие трансгенные микроорганизмы могут быть использованы в качестве гетерологических моделей для изучения ряда фундаментальных проблем (регуляция экспрессии гетерологических генов, топогенез белков в гетерологических системах, регуляция стехиометрии компонентов Р450-СИСТЄМ, принципы функционирования «многоцентровых» ферментов и систем, осуществляющих
согласованные процессы электронного транспорта, взаимодействия с субстратами и активации молекулярного кислорода и др.).
Изучение структурно-функциональных свойств цитохромов Р450, обеспечивающих синтез стероидных гормонов, и механизмов регуляции биосинтеза стероидных гормонов служит необходимой предпосылкой, с одной стороны, для выяснения биохимических основ различных нарушений стероидогенеза и разработки подходов к коррекции дисфункции коры надпочечеников, а с другой стороны, для конструирования биотехнологических систем направленного синтеза физиологически активных стероидов. Изучение монооксигеназной системы цитохрома P450scc и в теоретическом, и в прикладном плане представляется особенно важным, поскольку экспрессия белков данной системы в микроорганизмах позволит решить ключевую проблему синтеза С21 -стероидных гормонов. Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей топогенеза и функционирования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы (ХГ/Л системы) в клетках дрожжей и бактерий. Основное внимание было уделено изучению топогенеза основного и наименее изученного компонента ХГ/Л системы - цитохрома P450scc. В число основных экспериментальных задач входили:
- выбор гетерологической модели для изучения топогенеза цитохрома P450scc;
выяснение возможности импорта предшественника цитохрома P450scc в митохондрии нестероидогенных клеток;
изучение специфики поведения предшественника цитохрома P450scc в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также выяснение роли протеиназ и шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc;
изучение особенностей посттранслокационных стадий топогенеза цитохрома P450scc (зрелой формы), экспрессированного в клетках Escherichia coli, и возможности функционального сопряжения цитохрома P450scc с редокс-системой бактерий;
реконструкция ХГ/Л системы в клетках Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli с использованием методологии экспрессии гибридных (слитых) двух- и трехкомпонентных белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы; изучение характеристик гибридных белков и принципов формирования и взаимодействия каталитических доменов в гибридных молекулах;
конструирование клеток Escherichia coli, способных осуществлять коэкспрессию всех компонентов ХГ/Л системы (цитохрома P450scc, AdR и Ad) и изучение свойств экспрессируемых белков;
создание гетерологической модели для изучения двух монооксигеназных систем цитохромов P450scc и Р45017а, катализирующих первые стадии стероидогенеза млекопитающих, на основе клеток дрожжей Yarrowia lipolytica;
тестирование полученных трансгенных штаммов микроорганизмов, осуществляющих экспрессию белков ХГ/Л системы, на способность осуществлять биотрансформацию холестерина в прегненолон.
В процессе выполнения работы осуществлялось конструирование плазмид, способных направлять синтез рекомбинантных белков и их модифицированных вариантов в бесклеточной системе, а также в используемых штаммах дрожжей и бактерий, и проводилась работа по дизайну рекомбинантных белков.
Научная новизна и практическая значимость работы. При изучении импорта синтезированного в бесклеточной системе предшественника цитохрома P450scc в изолированные митохондрии из разных источников получены данные, указывающие на принципиальную возможность исследований особенностей топогенеза P450scc в модельных системах на основе нестероидогенных клеток. Впервые предложен путь преодоления тканеспецифических ограничений импорта P450scc в гетерологические митохондрии путем замены N-концевой адресующей препоследовательности.
Установлено, что критическим моментом топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах S. cerevisiae является не собственно импорт P450scc, а побочные процессы, имеющие место при импорте белка в митохондрии - протеолиз (под действием протеиназы Pimlp) и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов mtHsp70/Mdjlp/Mgelp. Эти данные объясняют низкое содержание каталитически активного P450scc в дрожжевых митохондриях и позволяют наметить пути для преодоления данной проблемы. Впервые показано, что субстратная специфичность протеиназ Pimlp и ш-ААА может перекрываться.
При изучении топогенеза зрелой формы P450scc обнаружено, что характеристики рекомбинантного цитохрома P450scc, синтезированного в клетках Е. coli, соответствуют характеристикам нативного белка, что указывает на возможность использования модельной системы на основе Е. coli для изучения, в частности, нестандартного механизма включения P450scc в мембрану. Впервые осуществлена реконструкция в клетках Е. coli функционально активной ХГ/Л системы. Получены результаты, указывающие на возможность взаимодействия цитохрома P450scc млекопитающих с редокс-компонентами бактериальной клетки.
Результаты работы по конструированию и экспрессии в бактериях и дрожжах слитой ХГ/Л системы показали, что объединение полипептидных цепей функционально связанных
ферментов в одну молекулу не обязательно приводит к увеличению интегральной активности системы и что формирование каталитических доменов в слитых белках зависит от порядка их расположения в слитой полипептидной цепи. Выявлен ряд общих проблем формирования и функционирования слитых полиферментных систем (деформация активных центров, структурные ограничения для их взаимодействия, подверженность протеолизу). Из числа двойных гибридов найден активный вариант, способный при совместной экспрессии с недостающим компонентом ХГ/Л обеспечить высокий уровень трансформации 22(R)-гидроксихолестерина в прегненолон.
Разработан новый подход для введения нескольких чужеродных кДНК в геном дрожжей Y. lipolytica, включающий (1) ко-интеграцию множества копий разных кассет экспрессии с гетерологическими кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома дрожжей (rDNA или участки LTR zetri) и (2) конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформантов разного полового типа. Получены штаммы дрожжей Y. lipolytica, способные ко-экспрессировать белки ХГ/Л системы и цитохром Р45017а и осуществлять превращение холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегненолон. Использованный методический подход может быть полезен для осуществления гетерологической экспрессии в клетках дрожжей других полиферментных систем или сложных белков, состоящих из нескольких субъединиц.
Полученные данные расширяют представления о специфике поведения белков стероидтрансформирующих систем млекопитающих в клетках микроорганизмов и могут являться основой для дальнейших исследований, связанных с развитием новых ферментативных методов биотрансформации стеринов или созданием тест-систем для скрининга лекарственных препаратов на основе микроорганизмов, продуцирующих цитохромы Р450.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на VII международной конференции «Cytochrome Р450 Biochemistry and Biophysics» (Москва, 1992), IV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997), II съезде биохимического общества Российской Академии Наук (Пущино, 1997), международной конференции «Biocatalysis-2000. Fundamentals and applications» (Москва, 2000), международной конференции «Ксенобиотики и живые системы» (Минск, Беларусь, 2000), III Всероссийском съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VT съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2004), IV международном симпозиуме VAAM (Association for General and Applied Microbiology) «Intracellular protein catabolism» (Оснабрюк, Германия, 2007), EMBO Workshop (Гамбург, Германия, 2007), XVIII
Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), ERA-IB Joint Call: «Industrial biotechnology for Europe: an integrated approach», Partnering Workshop (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), IX международном симпозиуме «Cytochrome Р450 Biodiversity and Biotechnology» (Ницца, Франция, 2008), семинаре отдела молекулярных основ онтогенеза НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ и конференции, посвященной 70-летию В.Н. Лузикова (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (417 ссылок). Объем работы составляет 305 страниц машинописного текста, работа включает 62 рисунка и 11 таблиц.
