Содержание к диссертации
Введение
1. Медиаторные биосенсоры на основе целых клеток 9
1.1. Механизмы генерации сигнала в микробных биосенсорах 9
1.2. Медиаторы, их свойства. Основные требования к медиаторам переноса электронов 14
1.2.1. Ферроцен и его производные 18
1.2.2. Индофенолы 20
1.2.3. Комлексные соединения металлов с переменной валентностью 21
1.2.4. Хиноны 22
1.3. Практическое применение медиаторных биосенсоров на основе целых клеток. 23
1.4. Особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans и перспективы их применения в микробных сенсорах 34
1.5. Мембранлокализованные глюкозо- и алкогольдегидрогеназы бактерий Gluconobacter oxydans и их применение в биосенсорах 37
2. Материалы и методы 44
2.1. Реактивы и материалы 44
2.2. Культивирование бактерий Gluconobacter oxydans 44
2.3. Оборудование 45
2.4. Формирование биосенсора 46
2.5. Регистрация вольтамперных зависимостей 47
2.6. Регистрация ответов биосенсоров 48
2.7. Методика измерений с кислородным электродом 48
3. Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе ъакте?ш gwconobacteroxydans 50
3.1. Оценка возможности использования некоторых соединений как медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий Gluconobacter oxydans 52
3.2. Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в медиаторных микробных биосенсорах 64
3.3. Сравнение эффективности медиаторов 81
3.4. Выбор рабочих параметров микробных биосенсоров 92
3.4.1. Зависимость ответов биосенсоров от концентрации медиатора 92
3.4.2. Зависимость ответов биосенсоров от рН среды 93
3.4.3. Зависимость ответов биосенсоров от концентрации солей буфера 98
3.4.5. Зависимость ответов биосенсоров от массы клеток на электроде 100
3.4.6. Долговременная и операционная стабильность микробных медиаторных биосенсоров 101
3.5. Селективность микробных биосенсоров 104
3.6. Экпресс-определение БПК микробным медиаторньш биосенсором 108
Заключение 114
Выводы 118
- Медиаторы, их свойства. Основные требования к медиаторам переноса электронов
- Культивирование бактерий Gluconobacter oxydans
- Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в медиаторных микробных биосенсорах
- Зависимость ответов биосенсоров от концентрации солей буфера
Введение к работе
Биосенсоры - аналитические приборы нового поколения, совмещающие в себе идеи и достижения современной биотехнологии, физико-химических методов анализа, электронных технологий. Большинство коммерческих биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат ферменты в качестве биорецепторного элемента.
Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод - медиаторов электронного транспорта.
Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, но и с ферментами в составе бактерий. Использование целых клеток вместо ферментов в биорецепторных элементах имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментов; биосенсоры на основе целых клеток (в частности, бактерий) обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при определении суммарного содержания органических соединений (определения БПК сточных вод или суммарного содержания углеводов и спиртов в ферментационных средах); биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.
Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Для детекции легкоутилизируем ых углеводов и спиртов перспективными могут стать медиаторные биосенсоры на основе бактерий Glu-conobacter oxydans, содержащих мембранлокализованные ферменты.
Электрокаталитическое окисление субстратов бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта мало изучено. Представляется актуальным исследование кинетических особенностей электрокаталитического окисления легкоутилизируемых субстратов бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов электронного переноса для разработки прин-
ципов создания микробных медиаторных биосенсоров.
Цель работы. Выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacter oxydans и применение этих закономерностей для разработки макета биосенсора. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:
Исследование возможности применения соединений различного строения, обладающих обратимыми окислительно-восстановительными свойствами, в качестве медиаторов в биосенсорах на основе целых клеток микроорганизмов G. oxydans.
Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных электродах.
Сравнение эффективности медиаторов электронного транспорта в биосенсорных системах на основе иммобилизованных бактерий G. oxydans.
Создание лабораторного макета амперометрического медиаторного биосенсора на основе бактерий G. oxydans. Определение рабочих параметров функционирования (рН, концентрация солей, концентрация медиатора, масса клеток на электроде) микробных биосеснсоров на основе G. oxydans и различных медиаторов переноса электронов.
Применение разработанного макета биосенсора для экспресс-определения БГЖ.
Научная новизна. Получены новые данные о возможности переноса заряда в системах «иммобилизованные бактерии G. oxydans - ферроцены и хиноны». Впервые показана возможность электрокаталитического окисления глюкозы целыми клетками G. oxydans на электродах, модифицированных ацетилферроценом, ферроценкарбальдегидом, 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном. Предложено использовать такие системы как основу для создания безреагентных микробных биосенсоров.
Моделирование процессов, протекающих в рецепторном элементе микробного медиаторного биосенсора, позволило идентифицировать скоро-
7 стьопределяющую стадию биоэлектрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными на поверхности графитовых электродов бактериями G.oxydam при участии медиаторов электронного транспорта. На основе анализа процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах, в рамках механизма «пинг-понг» получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.
Выявлен эффект изменения субстратной специфичности бактерий G. oxydans при электрокаталитическом окислении углеводов и спиртов в присутствии искусственных (медиаторов) и естественного (кислорода) акцепторов электронов, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.
Результаты создают основы формирующегося в настоящее время нового направления медиаторных клеточных электродов и открывают новые перспективы для создания микробных биосенсоров.
Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Glu-conobacter oxydans могут быть использованы при разработке биосенсоров на основе других микроорганизмов для детекции различных соединений.
Разработан действующий макет безреагентного амперометрического микробного медиаторного биосенсора для определения БПК, который может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (г. Пущино Московской области) в 2002-2006 гг.; VIII Международном конгрессе по биосенсорам, 24 - 26 мая 2004 г. (г. Гранада, Испания); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) 12-15 апреля 2005 г., Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006», 25-30 июня 2006 (г. Москва), IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», 11-16 сентября 2006 г. (г.
8 Томск). Исследование поддержано грантом РФФИ «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (№ 01-04-96023). По теме диссертации опубликовано 6 статей и 10 сообщений в тезисной форме.
Медиаторы, их свойства. Основные требования к медиаторам переноса электронов
Из особенностей процесса переноса электрона от активных центров, расположенных внутри бактериальных клеток, на электрод вытекает целый ряд важных требований, которым должен удовлетворять медиатор, чтобы обеспечить эффективный транспорт электронов [13]: - медиатор в окисленном состоянии должен легко проходить через или абсорбироваться бактериальной цитоплазматической мембраной, чтобы достигнуть восстановителей внутри бактерий; - Величина редокс-потенциала медиатора должна обеспечивать необходимый градиент для переноса электрона между активным центром фермента бактерий и электродом. Так, для окислительного биоэлектро-катализа величина стандартного редокс-потенциала медиатора Е(М) 15 должна быть больше стандартного редокс-потенциала активного центра фермента Е: Е (М) Е, в случае восстановительного биокатализа -наоборот: Е(М) Е. - Реакции медиатора с окисленными и восстановленными формами активного центра фермента должны быть достаточно быстрыми. - Медиатор в окисленном состоянии не должен вступать в другие метаболические процессы (не должен ингибировать их и не должен разрушаться в них). - Медиатор в восстановленном состоянии должен легко выходить из клетки сквозь бактериальную мембрану. - Электрохимическая кинетика процесса окисления восстановленного медиатора на электроде должна быть быстрой. Это предполагает большие константы скорости переноса электрона на границе электрод-раствор. - В реакции переноса заряда между редокс-центром и электродом медиатор претерпевает циклические превращения между своей окисленной и восстановленной формами. Поэтому медиатор должен быть устойчивым как в окисленной, так и в восстановленной форме и не должен разлагаться в течение длительного окислительно-восстановительного цикла работы. В настоящее время известно множество веществ, используемых в качестве медиаторов в биологических системах. Данные о них представлены в нескольких обзорах [14-17]. Медиаторы могут принадлежать к самым разным классам соединений, и тем самым демонстрировать разнообразные свойства. Иногда медиаторы подразделяют на медиаторы природного и синтетического происхождения. К первым относят цитохромы, убихинон, флавопротеины, ферредоксины, витамины (например, витамин Кз) и другие.
В числе вторых - многие красители (например, метиленовый голубой), фталоцианины, виологены, хиноны, ферроцены, комплексные ионы металлов (например, [Fe(CN)6]37[Fe(CN)6]4 , Разнообразие структур медиаторов электронного транспорта определяет разнообразие их свойств, а, в частности, редокс-потенциалов. В таблице 1 представлены окислительно-восстановительные потенциалы некоторых природных и синтетических медиаторов. Пара ферроцен - катион ферроцения в гомогенных условиях является одной из наиболее высокоообратимых окислительно-восстановительных систем. Электронный обмен между окисленной и восстановленной формами в этой системе происходит с очень большой скоростью, значительно превышающей скорость электронного обмена в таких системах, как, например, [Fe(CN)6]37 [Fe(CN)6]4". Это означает, что при переходе от восстановленной к окисленной форме не должно происходить никаких изменений координационных сфер и геометрии комплекса [18]. Известно, что электрохимические свойства (в частности окислительно-восстановительный потенциал) производных ферроцена можно изменять в желательном направлении, вводя заместители различных типов в циклопен-тадиенильные кольца. Исследование электрохимических свойств ферроцена и его производных показало, что в зависимости от природы заместителей и их положений редокс-потенциал изученных веществ составляет от 0,15 до 0,60 В [19]. При введении различных заместителей меняется растворимость производных ферроцена, которую необходимо учитывать при разработке биосенсора. Так, 1,Г-диметилферроцен нерастворим в воде, а ферроценмонокарбо-новая кислота довольно хорошо в ней растворяется. Растворимые производные ферроцена, такие как ферроценмонокарбоновая кислота [Fc(COOH)] и ферроцендикарбоновая [Fc(COOH)2j легко десорбируются с поверхности электрода, что связано с более высокой растворимостью этих соединений в водных растворах. В связи с этим, в качестве медиатора в основном используют ферроцен и 1,Г-диметилферроцен, которые прочно удерживаются на поверхности графита [20,21]. Первый успешно работающий биосенсор на основе ферроцена содержал нерастворимое производное ферроцена и глюкозооксидазу [22] Проще t говоря, 1,1 -диметилферроцен внедрили в графитовый электрод, на котором химически иммобилизовали глюкозооксидазу. В этой конфигурации электрохимически генеририруемый ферроцений-ион действует как окислитель восстановленной глюкозооксидазы. Образовавшиеся при этом восстановленная форма ферроцена реокисляется на поверхности электрода. Такой сенсор имеет следующие преимущества: 1) Ферроцений - ионы генерируются при довольно низком потенциале (220 мВ относительно Ag/ AgCl), что позволяет свести к минимуму побочные реакции. 2) Восстановленный ферроцен не реагирует с кислородом и поэтому сенсор не чувствителен к последнему. 3) Реакция с переносом электрона между ферроцений-ионом и восстановленным ферментом протекает быстро, соответственно время отклика электрода невелико. 4) Вследствие низкой растворимости медиатор физически закреплен на поверхности электрода, что позволяет не вводить его предварительно в анализируемый раствор. 5) Поскольку и сам фермент иммобилизован на поверхности преобразователя, сенсор можно использовать многократно.
В работе Smolander М. [23] протестированы различные типы производных ферроцена как медиаторов для ферментных биосенсоров на основе PQQ-зависимой апьдоздегидрогеназы (КФ 1.1.99.17), иммобилизованной на угольно-пастовых электродах. Исследования показали, что все использованные производные ферроцена работают в качестве медиаторов электронного транспорта при различных потенциалах, а медиаторные свойства зависят от характера заместителя в пентадиенильном кольце. Наибольшие ответы генерировали биосенсоры, модифицированные алкилферроценами. При использовании в качестве медиаторов производных ферроцена, содержащих карбонильные группы, значительно снижалась эффективность биоэлектрокатали-тического окисления глюкозы. 1.2.2. Индофенолы Типичный перставитель этого класса медиаторов 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) принадлежит к ряду хинониминовых кра сителей, способных изменять окрашивание при изменении рН среды, окислении и восстановлении [24]. В ходе восстановления способен принимать один и два электрона. Способность ДХФИФ изменять окраску при окислении и восстановлении легла в основу спектрофотометрического метода изучения поведения ферментов in vivo и in vitro, а также определения их активности. ДХФИФ используется в исследованиях совместно с феназинметасульфатом в качестве переносчика электронов для определения активности НАДН-дегидрогеназ, так как ДХФИФ не способен непосредственно взаимодействовать с НАДН-дегидрогеназами [25]. Это соединение хорошо растворимо в воде, в тоже время способно диффундировать через липидный слой мембран. В силу сравнительно высокого стандартного окислительно-восстановительного потенциала Е= +0,217 В ДХФИФ способен взаимодействовать с различными участками дыхательной цепи, известно, что он восстанавливается флавопротеиновыми ферментами и убихинонами. 1.2.3, Комлекспые соединения металлов с переменной валентностью Типичными представителями медиаторов этого типа являются [Co(NH3)6]3+, [Co(bpy)3]3+, [Ru(NH3)6]3t) [26,27] и др.
Культивирование бактерий Gluconobacter oxydans
В работе использовали бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius В-1280, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Россия, г. Пущино). Гексацианоферрат (III) калия (Диа-М, Россия), 2,6-дихлор фенол индофенол (Sigma, США), 1,4-бензохинон (Диа-М, Россия), ферроцен (Aldrich, Германия), 1,Г-диметилферроцен (Aldrich, Германия), ацетилферроцен (Sigma, США), ферроценкарбальдегид (Sigma, США), 2-метил-1,4-бензохинон (Диа-М, Россия), 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 1,2-нафтохинон (Fluka, Германия), D-глюкозу (AppIiChem, Германия). Для изготовления угольно-пастовых электродов использовали графитовую пудру (Fluka, Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия), диализную мембрану («Roth», Германия) (предел пропускания 14 кДа). D-сорбит («Sigma», США); дрожжевой экстракт («Oxoid Ltd.», Великобритания) использовали для культивирования бактерий Gluconobacter oxydans. Цитратно-фосфатный буфер готовили из 0,1 М раствора лимонной кислоты и 0,2 М раствора Na2HP04 по методике описанной в [85]. ГСО (БПК5=П7 мг/л) регистрационный номер ГСО 8048-94 (НПО «Цель», Пермь, Россия). 2.2. Культивирование бактерий Gluconobacter oxydans. Штамм Gluconobacter oxydans subsp. industrius VKM В-1280 (далее G. oxydans) был получен во Всеросийской коллекции микроорганизмов РАН. Клетки выращивали в жидкой среде аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объёмом 500 мл при температуре 28С в среде следующего состава: сорбит - 200 г/л, дрожжевой экстракт - 20 г/л, дистиллированная вода - 100 мл. Посевной материал выращивали аналогично 24 часа. Биомассу собирали центрифугированием при комнатной температуре на центрифуге ТЗО (Германия) при 4500 об/мин 15 минут и отмывали от культуральной среды двукратно 20 мМ фосфатным буфером рН 6,0. Осевшие клетки ресуспендирова-ли в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 3 минуты при 12000 об/мин. Полученные осадки в пробирках «Эпендорф» подсушивали на воздухе в течение часа, и замораживали для длительного хранения при температуре -20С. Вес всех порций биомассы регистрировали.
Для каждой серии опытов использовали новую порцию биоматериала, размороженного в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем разбавленного цитратно-фосфатным буфером рН 6,5 до концентрации 200 мг «сырого веса»/мл. 2.3. Оборудование В работе использован высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, Метод основан на компьютерной обработке сигналов, позволяет производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов и исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы. В исследовании применяли технику регистрации окислительных процессов с помощью химически модифицированных (медиаторных) электродов, которую предложено использовать для изучения свойств иммобилизованных микробных клеток. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотен-циостата «IPC2000» («Kronas», Москва, Россия), интегрированного с ПК. Диапазон регистрируемых токов 5 нА - 20 мкА. Регистрацию и обработку данных, полученных в результате электрохимических измерений проводили при помощи ПК. Компьютерная программа регистрации и обработки данных разработана для операционной системы «Windows-XP». Фотография установки представлена на рис. 5. Микробные биосенсоры (рис.6) формировали по методике описанной в работе [83], наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку. Пластиковая трубка содержала серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. Графитовую пасту готовили смешиванием 100 мг графитовой пудры с 40 мкл парафинового масла. Растворимые медиаторы (БХ, ДХФИФ, ГЦФ) добавляли в состав цитратно-фосфатного буфера, в котором проводили измерения. Электроды на основе иммобилизованных медиаторов (ФЦ, ДМФЦ, МБХ, ДББХ, ацетилферроцена, ферроценкарбальдегида) формировали следующим образом: 100 мг графитовой пудры смешивали с необходимым (для получения требуемой концентрации медиатора в графитовой пасте) количеством 1% раствора медиатора в ацетоне, после испарения ацетона добавляли 40 мкл парафинового масла и замешивали пасту. Такой модифицированной пастой заполняли пластиковую трубку. Клетки микроорганизмов Gluconobacter oxydans иммобилизовали следующим образом: на поверхность пасты, заполняющей шприц, наносили 1 мкл суспензии клеток Gluconobacter oxydans 200 мг «сырого» веса/мл, и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Для прочной иммобилизации клеток на поверхности электрода при помощи пластикового кольца закрепляли диализную мембрану. Регистрацию вольтамперограмм проводили в трехэлектродной системе.
Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности 6,3 мм2) с иммобилизованными клетками микроорганизмов Gluconobacter oxydans, вспомогательным - платиновый электрод. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряныи электрод (Ag/AgCl), относительно которого представлены все значения потенциалов, Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости наложения потенциала 10 мВ/с в 0,15 М цитратно-фосфатном буфере (рН 6,5) при температуре 22 С. Регистрацию ответов биосенсоров проводили по двухэлектродной схеме.. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности 6,3 мм2) с иммобилизованными клетками микроорганизмов Glu conobacter oxydans, электродом сравнения - насыщенный хлоридсеребряный. Измерения проводили в цитратно-фосфатном буфере с рН 6,5 при постоянном потенциале (2-метил-1,4-бензохинона 80 мВ; 2,5-дибром-1,4-бензохинона 170 мВ; ферроцена 315 мВ; 1,Г-диметилферроцена 250 мВ, 2,6-дихлорфенолиндофенола 250 мВ [15], 1,4-бензохинона 200 мВ [15] и гекса-цианоферрата (III) калия 400 мВ [15]), при температуре 22 С; объем ячейки - 4 мл. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке, при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). После установления постоянного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество 1 М или 0,1 М раствора субстрата. После каждого измерения производили промывку ячейки (3 х 4 мл цитратно-фосфатного буфера). Измеряемым параметром сигнала сенсора являлась амплитуда изменения силы тока, определяемая как разность между начальным и конечным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету. 2.7. Методика измерений с кислородным электродом Кислородный электрод (Beckman) заполняли 0,1 М раствором хлорида калия. Клетки микроорганизмов (1 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200 мг сырого веса/мл) наносили на хроматографическую бумагу GF/A 3 х 3 мм, подсушивали в течение 30 мин, фиксировали с помощью капроновой сетки на кислородном электроде. Электролитическую ячейку заполняли 4 мл цитратно-фосфатного буфера (рН=6,5). Добавления субстратов начинали через 30 минут после погружения электрода в раствор. В кювету при перемешивании (300 об/мин) добавляли различные объемы 1 М и 0,1 М растворов субстратов для получения требуемой концентрации. После каждого добавления субстрата производили промывку ячейки (3 х 4 мл цитратно-фосфатного буфера рН=6,5). Зависимость силы тока от времени регистрировалась при потенциале Е=-700 мВ потенциостатом «IPC2L» («Kronas», Москва, Россия), интегрированным с персональным компьютером. Измеряемым параметром сигнала сенсора являлся тангенс угла наклона начального линейного участка зависимости силы тока от времени (нА/с).
Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в медиаторных микробных биосенсорах
При разработке биосенсоров важно идентифицировать скоростьопре-деляющую стадию процесса биоэлектрокаталитического окисления определяемого субстрата (аналита), от которой зависит эффективность функционирования биосенсорной системы. Исследования, посвященные определению лимитирующей стадии процессов, протекающих в медиаторных биосенсорах на основе целых клеток ранее не проводились. Известно, что для выявления скоростьопределяющей стадии процессов, протекающих на ферментных медиаторных биосенсорах, используется подход, разработанный Элбери У. Дж. и Бартлетом П. Н. [88], в котором биоэлектрокаталитическое окисление субстрата на электроде представляют в виде модели, учитывающей различные стадии: перенос субстрата через электродную мембрану к ферментным системам бактериальных клеток, реакцию его с ферментом, регенерацию фермента окисленным медиатором и реокисление восстановленного медиатора на электроде. Для описания кинетических закономерностей протекающих в микробных медиаторных биосенсорах биоэлектрод представили в виде модели, в которой также выделили стадии переноса субстрата через бактериальные мембраны к активным центрам ферментов, взаимодействие его с ферментными системами бактериальных клеток, регенерацию фермента при участии окисленной формы медиатора и окисление восстановленной формы медиатора на электроде (рис. 16). Представленная модель микробного медиаторного электрода аналогична модели ферментного электрода, если упрощенно рассматривать клетки как капсулы, содержащие ферменты. Поэтому для анализа процессов, протекающих на микробном медиаторном электроде был применен подход, разработанный ранее Элбери У. Дж. и Бартлетом П. Н. [88] для ферментных биосенсоров, который позволяет по зависимости ответов биосенсоров от концентрации субстрата выявить лимитирующую стадию протекающих в рецеп-торном элементе процессов. Математический анализ модели ферментного электрода, проведенный Элбери У. Дж. и Крестоном Д. X., основанный на равенстве потоков веществ через каждую стадию процесса в стационарном состоянии, приводит к уравнению зависимости потока генерируемых в электрокаталитическом процессе электронов от концентрации субстрата, аналогичному уравнению Хэйнеса [88]: Если прямая на графике у от р пересекает ось абсцисс в любой другой точке, кроме ро = 1 (рис. 17 б, в), то с учетом уравнения (10) имеем к р0=—— 1, это означает, что в протекающие в микробном медиаторном электроде процессы вносят соизмеримый вклад и диффузия субстрата, и ферментативные реакции, Математически этот случай выражается в том, что ни одним из членов в уравнении (3) пренебречь нельзя, и они оба определяют значение к ш.
Таким образом, анализ характера зависимости у от р является удобным методом для оценки стадии, лимитирующей скорость процессов протекающих в медиаторных биосенсорах. В случае, когда протекающие на медиаторных биосенсорах процессы лимитирует электрохимическая реакция регенерации медиатора, ответы сенсора не будут зависеть от концентрации субстрата (зависимость генерируемого биосенсором тока I от концентрации субстрата S будет иметь вид прямой линии, параллельной оси абсцисс) [13]. Для определения лимитирующей стадии процессов протекающих в ре-цепторном элементе биосенсора необходимо экспериментально получить зависимости ответов биосенсора от концентрации глюкозы. Отклики медиаторных микробных электродов регистрировали в виде зависимости силы тока I от времени t при фиксированном потенциале рабочего электрода. Измеряемым параметром ответа являлась разность ДІ между Полученные экспериментально зависимости (рис. 20-21) генеририруе-мого тока I при варьировании концентрации глюкозы S для микробных биосенсоров на основе описанных ранее в системах с батериями G.oxydans растворимых медиаторов (БХ, ДХФИФ, ГЦФ) и отобранных на предыдущем этапе работы (см. главу 3.1.) нерастворимых медиаторов (ДББХ, МБХ, ФЦ, ДМФЦ) были проанализированы по описанному выше алгоритму для определения лимитирующей стадии. Для микробных биосенсоров на основе всех применявшихся в исследовании медиаторов были получены зависимости у от р сходного вида. На каждом из графиков у от р можно провести две прямые, одну, соответствующую ро = со (лимитирующей стадией является ферментативная реакция), другая прямая пересекает ось абсцисс в точке р = 1 (лимитирует диффузия глюкозы). Следовательно, при переходе от низких концентраций глюкозы к высоким происходит смена лимитирующей стадии: диффузионный контроль сменяется на кинетический. Смена режима функционирования биосенсоров с кинетического контроля на диффузионный наблюдалась при концентрациях глюкозы меньше 2 ммоль/л. Таким образом, для электродов с растворимыми (ДХФИФ, БХ, ГЦФ) и иммобилизованными (ДББХ, МБХ, ФЦ, ДМФЦ) медиаторами было установлено, что при концентрациях глюкозы выше 2 ммоль/л протекающие в микробных биосенсорах процессы лимитирует ферментативная реакция, при концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль функционирования биосенсора сменяется на диффузионный. Данные, полученные в условиях кинетического контроля процесса далее использовали для расчета кинетических параметров электрокаталитического окисления глюкозы бактериями G.oxydans в присутствии медиаторов электронного переноса. 3.3. Сравнение эффективности медиаторов Несмотря на многочисленные разработки в области микробных медиа-торных биосенсоров, практически отсутствуют публикации, направленные на решение такого важного вопроса как поиск общих принципов и характеристик, количественно описывающих эффективность взаимодействия бактерий с медиатором. Основополагающей в данном вопросе следует, по-видимому, считать работу [87], в которой авторы предложили характеризовать биоэлек-трокаталитический процесс с помощью максимальной скорости реакции и констант Михаэлиса для медиатора и субстрата.
Выполненные ими оценки для бактерий Pseudomonas fluorescens и Gluconobacter industries и некоторых медиаторов продемонстрировали эффективность предложенного подхода. В упомянутом исследовании [87] измерения проводились с бактериальными клетками, находящимися в суспензии. Найденные константы Михаэлиса для медиатора и субстрата авторы называют «кажущимися» и предполагают, что вклад в их значение могут вносить диффузионные процессы. Проведенные нами на предыдущем этапе работы исследованиям (см. главу 3.2.) позволили выявить диапазон концентраций глюкозы, в котором процессы, протекающие в рецепторном элементе микробных биосенсоров, лимитируют реакции с участием ферментных систем клеток. Более детальное изучение процессов происходящих на микробных медиаторных биосенсорах в режиме кинетического контроля позволит найти истинные константы, характеризующие взаимодействия в системе «бактерии Gluconobacter oxydans -субстрат - медиатор». Клетки микроорганизмов рода Gluconobacter содержат мембранолока-лизованную PQQ-зависимую глюкозодегидрогеназу (ЕС 1.1.99.17), связанную с ферментами электрон-транспортной цепи [67]. Схематически процесс окисления глюкозы бактериальными клетками с участием медиатора представлен на рисунке 36. Субстрат (S) проникает через наружную мембрану клетки и взаимодействует с ферментом ГДГ, расположенным в цитоплазматической мембране бактерий Gluconobacter oxydans. В результате фермент ГДГ восстанавливается и, в свою очередь, отдает электроны молекуле медиатора (Мок) непосредственно или через определенный сайт дыхательной цепи. Медиатор регенерируется на электроде и вступает в новый цикл взаимодействия с ферментными системами бактериальных клеток. В данном случае можно говорить о двухсубстратной реакции (первый субстрат - глюкоза, второй - медиатор), которая протекает по механизму «пинг-понг», когда последовательные стадии взаимодействия субстратов S и Мок с активным центром фермента разделены необратимым химическим превращением [89], что можно описать следующей схемой:
Зависимость ответов биосенсоров от концентрации солей буфера
Зависимость величины ответов микробных медиаторных биосенсоров от концентрации солей буферного раствора была исследована в диапазоне 0,006-0,18 моль/ л при рН=6,5 для микробных биосенсоров на основе ферро цена и 1,Г-диметилферроцена) и при рН=7,0 для биосенсоров на основе 2,5-дибром-1,4-бензохинона и 2-метил-1,4-бензохинона. На рис. 45 приведены зависимости ответа сенсора от массы клеток при насыщающей концентрации глюкозы (60 мМ). Для электродов на основе всех медиаторов зависимости имели экстремальный характер. Ответы биосенсоров возрастали при увеличении концентрации биокатализатора на поверхности электрода согласно уравнениям (18) и (19). Дальнейшее увеличение массы бактерий на электроде приводит к увеличению толщины слоя биоматериала. Глюкоза, диффундирующая через слой бактерий к поверхности электрода, частично окисляется, при этом акцептором электронов, скорее всего, является не медиатор, а кислород, что приводит к снижению амплитуды ответов. Максимальное значение отклика для исследовавшихся медиаторных биосенсоров достигается, когда масса иммобилизованных на электроде клеток составляет 0,2 мг (поверхностная концентрация 32 мкг «сырого ве-са»/мм2). 3.4.6, Долговременная и операционная стабильность микробных медиаторных биосеисоров Одним из важнейших параметров биосенсора является его стабильность. На рисунке 46 представлены данные по операционной стабильности микробных медиаторных биосенсоров в виде зависимости ответов сенсора в % от числа измерений. При этом за 100 % принимали максимальный ответ сенсора, полученный за всю серию измерений. Микробные графитовые электроды, модифицированные медиаторами, показывали стабильные ответы на глюкозу (стандартное отклонение в пределах 5%) для 10 последовательных измерений. В течение 23 суток снижение откликов биосенсора на основе ферроцена не наблюдалось (относительное стандартное отклонение составило 5%), Для биосенсора, модифицированного 1,Г-диметилферроценом в течение первых 5 дней наблюдалось снижение ответов на 30%, В течении последующих 18 суток ответы сенсора были стабильны (относительное стандартное отклонение составило 6%). Для сенсоров на основе хинонов наблюдалось резкое снижение ответов в течение 9 дней. Возможно, это связано с утечкой медиатора с поверхности электрода или химической нестабильностью медиаторов.
По истечении 11 дней ответы сенсоров стабилизировались и сохранялись на этом уровне в течение 10 дней (стандартное отклонение в период стабилизации ответа составило 10%). Наибольшей стабильностью обладают микробные биосенсоры на основе медиатора ферроцена. Рабочие параметры и данные по долговременной и операционной стабильности для исследованных микробных медиаторных биосенсоров суммированы в таблице 7. Важной характеристикой любого анализа является его селективность. Биосенсоры на основе целых клеток часто обладают низкой селективностью, что обусловлено многообразием ферментных систем микроорганизмов, используемых в биорецепторном элементе. Селективность микробных биосенсоров определяется не только субстратной специфичностью микроорганизмов, а может зависеть от способа иммобилизации биоматериала [34] и типа акцептора электронов [35]. Известно, что бактерии Gluconobacter oxydans содержат PQQ-зависимые мембранлокализованные альдоз- и алкогольдегидрогеназы, способные окислять целый ряд углеводов и спиртов [68]. Исходя из этого, в качестве модельных субстратов были выбраны одноатомные спирты с разветвленным и неразветвленным углеродным скелетом и длиной цепи от 1 до 4 атомов углерода (метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, 2-метилпропанол-1, 2-метилпропанол-2), виценальный многоатомный спирт (глицерин) и диол, в котором атомы углерода при гидроксильных группах разделены метиленовой группой (бутандиол-1,3), моносахариды ряда альдоз (пентоза - ксилоза; гексозы - глюкоза, манноза, галактоза и кетоза - фруктоза, а также наиболее часто встречающиеся в природе дисахариды (сахароза, мальтоза, лактоза). Все субстраты использовали в одинаковой концентрации 60 мМ, которая является насыщающей для глюкозы и этанола в условиях эксперимента. Была изучена субстратная специфичность иммобилизованных бактерий G. oxydans в условиях электрокаталитического окисления субстратов (в присутствии искусственных акцепторов электронов - медиаторов различного строения) и в режиме естественного окисления субстратов, когда конечным акцептором электронов является кислород. Полученные данные представлены на диаграмме (рис. 48). Так как, при измерениях на кислородном электроде величины ответов лежат в наноамперном диапазоне, а при использовании медиаторных электродов - в микроамперном, для сравнения ответов биосенсоров на различные субстраты использовали нормированные данные (за 100% во всех случаях был принят ответ на глюкозу). Установлено, что соотношение ответов сенсоров на углеводы и спирты зависит от типа акцептора электронов. В режиме естественного окисления биосенсоры генерировали более высокие ответы на спирты, в режиме электрокаталитического окисления - на углеводы. Соотношение «ответ на глюкозу : ответ на этанол» для биосенсора на основе кислородного электрода составило 10 : 11, для медиаторных биосенсоров на основе ферроцена, 1,1 -диметилферроцена и 2,5-дибром-1,4-бензохинона 10 : 8, а для биосенсора на основе 2-метил-1,4-бензохинона 10:2. Таким образом, установлено, что использование искусственных акцепторов электронов (медиаторов) вместо ее- тественного акцептора (кислорода) позволяет изменять селективность микробных биосенсоров. Наибольшие ответы медиаторные биосенсоры генерировали при введении в систему глюкозы.
Менее эффективно подвергались биоэлектроката-литическому окислению другие моносахариды (галактоза, ксилоза, манноза). Следует отметить, что у глюкозы, галактозы и ксилозы конфигурация атомов углерода С-2 и С-3 совпадает, вероятно, субстратная специфичность альдо-зодегидрогеназы Gluconobacter oxydans определяется, в основном, именно этой частью молекулы моносахарида. Способность бактерий G. oxydans метаболизировать дисахариды связана с наличием соответствующих гидролитических ферментов, превращающих дисахариды в моносахара, которые в свою очередь окисляются с участием альдозодегидрогеназ. Из трех использовавшихся в исследовании дисаха-ридов (мальтоза, сахароза, лактоза) ответы наблюдали только на мальтозу. Высокие ответы медиаторных биосенсоров наблюдали на спирты не-разветвленного строения (за исключением метанола). Биоэлектрокаталитиче-ское окисление разветвленных спиртов проходило менее эффективно, причем по мере уменьшения степени разветвления и удаления разветвленного конца от атома углерода с гидроксильной группой, величина ответов сенсора возрастала. Отсутствие ответов биосенсора на метанол согласуется с субстратной специфичностью PQQ-алкогольдегидрогеназы бактерий Gluconobacter oxydans, которая не способна катализировать окисление метанола [77]. Величины ответов биосенсора на основе 2-метил-1,4-бензохинона на углеводы соизмеримы с ответами других медиаторных биосенсоров, а ответы на спирты - значительно ниже. Следовательно, селективность медиаторных биосенсоров можно изменять, используя медиаторы различного строения. Медиаторные микробные биосенсоры на основе бактерий Gluconobacter oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения суммарного содержания этих веществ в анализируемых образцах, кроме того, можно рекомендовать использование медиаторных электродов для анализа сред содержащих только один из определяемых углеводов или спиртов. 3.6. Экпрссс-определение ВПК микробным медиаторным биосенсором Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды, в частности, определение органических примесей в поверхностных, грунтовых и сточных водах, является актуальной задачей. Возрастающее внимание уделяется экспресс-методам контроля, ориентированным на оценку совокупного воздействия токсикантов на окружающую среду.
