Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1.Хоуминг-эндонуклеазы 11
1.2. H-N-H-эндонуклеазы 12
1.3. Каталитический центр H-N-H-эндонуклеаз 15
1.3.1. Структура каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз 15
1.3.2. Роль иона металла в структуре активного центра H-N-H-эндонуклеаз 17
1.3.3. Единство структурной и функциональной организации каталитического центра нуклеаз суперсемейства "ррос-Ме" 18
1.3.4. Модель катализа гидролиза ДНК эндонуклеазами семейства H-N-H 20
1.4. Генетическая роль H-N-H-эндонуклеаз 22
1.5. Узнавание ДНК-субстратов хоуминг-эндонуклеазами 27
1.5.1. Специфическое узнавание последовательности ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами 27
1.5.2. Взаимодействие эндонуклеазы \-Crel с сайтом узнавания 29
1.5.3. Взаимодействие эндонуклеазы \-Ppol с сайтом узнавания 33
1.5.4. Взаимодействие эндонуклеазы l-Tevl с сайтом узнавания 35
1.5.5. Взаимодействие эндонуклеазы І-Я/wwI с сайтом узнавания 40
2. Материалы и методы
2.1.Плазмиды 44
2.2. Штаммы бактерий и бактериофагов 44
2.3. Базовые методы молекулярной биологии и биохимии 45
2.4. ДНК-субстраты 45
2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции ш vitro 46
2.6. Транскрипция in vitro 47
2.7. Синтез белка в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы 48
2.8. Анализ нуклеазной активности 48
2.9. Картирование точек разрыва ДНК 50
2.10. Экспрессия и очистка эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll 50
2.11. Картирование сайта узнавания эндонуклеазы F-ТУШ 53
2.11.1. Защита ДНК белком от воздействия ДНКазы I, гидроксильных радикалов и диметилсульфата 53
2.11.1.1. Защита от ДНКазы 1 53
2.11.1.2. Защита от гидроксильных радикалов 53
2.11.1.3. Защита от диметилсульфата 54
2.11.2. Эксперименты с использованием модифицированных ДНК-субстратов (метилированных, этилированных или с удаленным нуклеозидом) 55
2.11.3. Секвенирование ДНК-субстрата по Максаму-Гилберту (A+G) 55
2.11.4. Анализ расщепленных фрагментов ДНК 56
2.11.5. Количественная обработка результатов 56
2.12. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей 57
2.13. Олигонуклеотиды 58
3. Результаты
3.1. В области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 Escherichia coli, а также бактериофага 5 Salmonella enterica sv. Heidelberg обнаружены OPC, кодирующие предполагаемые H-N-H-эндонуклеазы 59
3.2. Гены hegA, hegB, hegC и hegD кодируют сайт-специфические эндонуклеазы 63
3.3. Выявление дополнительных сайтов гидролиза эндонуклеаз F-Tfll, F-Tflll и F-7/ЯІІ 68
3.4. Разработана схема вьщеления и очистки эндонуклеаз F-TJR и F-Tflll 71
3.5. Эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll наиболее активны при экстремальных значениях рН и температуры 72
3.6. Активность эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll стимулируется широким рядом ионов двухвалентных металлов 74
3.7. Ион Zn , по-видимому, стабилизирует структуру изучаемых нуклеаз 75
3.8. Эндонуклеаза F-7J7II специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания 76
3.8.1. Эндонуклеаза F-Tflll связывает протяженный участок ДНК 76
3.8.2. Контакты эндонуклеазы F-Tflll с остовом ДНК распределены по всему сайту узнавания 83
3.8.3. Контакты эндонуклеазы F-7J7II с основаниями расположены в двух участках сайта узнавания 84
3.8.4. Эндонуклеаза F-7J7II контактирует с основаниями сайта узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК 85
3.8.5. Контакты с остатками фосфатов остова ДНК не существенны для образования комплекса F-ТЩ-ДНК 86
Обсуждение 88
- H-N-H-эндонуклеазы
- Базовые методы молекулярной биологии и биохимии
- Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
- Эндонуклеаза F-7J7II специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания
Введение к работе
В составе интронов типов I и II часто присутствуют открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие сайт-специфические эндонуклеазы. Эти ферменты, как правило, вносят разрыв в лишенный данного интрона аллель гена, и, таким образом, инициируют перенос интрона в разрезаемый участок ДНК. Этот процесс получил название "хоуминг", а инициирующие его нуклеазы - "хоуминг-эндонуклеазами". На основании наличия в аминокислотных последовательностях этих ферментов специфических мотивов их подразделяют на 4 семейства: "LAGLIDADG", "GIY-YIG", "His-Cys box" и "H-N-H" (Guhan and Muniyappa, 2003; Stoddard, 2005).
Хоуминг-эндонуклеазы обнаруживаются у широкого круга организмов: у бактериофагов, эубактерий, архей, а также у эукариотических организмов. Геномы бактериофагов, по-видимому, наиболее обогащены этими ферментами (Edgell et al., 2000). Например, в геноме фага Т4 из 289 ОРС, кодирующих предполагаемые белки, по крайней мере, 14 кодируют хоуминг-эндонуклеазы (Miller et al., 2003), а у бактериофага Т5 - 9 из 162 (номер в базах данных "EMBL/GenBank/ DDBJ" - AY543070). Следует отметить, что эти нуклеазы, как правило, сосредоточены у одного из фагов, тогда как большая их часть отсутствует у других близкородственных фагов. Например, охарактеризованные эндонуклеазы 1-7Ы, 1-7Ы1 (Edgell et al., 2000), SegA (Sharma et al., 1992), Seg (Belle et al., 2002) и SegG (Liu et al., 2003), кодируемые бактериофагом T4, отсутствуют у фага Т2, а из обнаруженных в данной работе эндонуклеаз F-Tfll, F-7/7II, F-T/ffll и F-TfllV, кодируемых фагом Т5, только одна (F-7)7IV) присутствует в геноме близкородственного фага BF23 (Ксензенко и др., неопубликованные данные). Следует также отметить, что большинство известных хоуминг-эндонуклеаз, кодируемых бактериофагами, имеют внеинтронную локализацию: только 2 из 14 указанных нуклеаз фага Т4 кодируются нитронами (Miller et al., 2003). Для этих нуклеаз характерна еще одна интересная
особенность - все они являются представителями семейств "GIY-YIG" или "H-N-H". Учитывая информационную насыщенность фаговых геномов, такое изобилие хоуминг-нуклеаз в сочетании с их неравномерным распределением среди близкородственных фагов, представляется неслучайным и возникает вопрос о функциональной роли этих ферментов.
Известно, что эндонуклеазы SegE, Seg и SegG (семейство "GIY-YIG"), имеющие внеинтропную локализацию, способны инициировать процесс генной конверсии, аналогичный хоумингу (Kadyrov et al., 1997; Belle et al., 2002; Liu et al., 2003). В то же время, они, в отличие от большинства других хоуминг-эндонуклеаз, разрезают как ДНК "своего" фага, так и "чужого". Это обстоятельство позволяет предположить возможность участия этих ферментов также в других рекомбинационных событиях.
Представляет также интерес изучение генетической роли H-N-H-эндонуклеазы I-Нти\ и ряда ее гомологов (\-Нти\\, и I-J?asl), вносящих одноцепочечные разрывы в ДНК (Goodrich-Blair and Shub, 1996; Landthaler et al., 2002; Landthaler et al., 2003). Известно, что эндонуклеазы I-#muI и I-tfmwII инициируют процесс хоуминга (Landthaler et al., 2004). Механизм инициации этого процесса на молекулярном уровне еще предстоит раскрыть, поскольку до сих пор полагали, что перенос интронов инициируется внесением только двуцепочечных разрывов в ДНК, репарация которых и лежит в основе хоуминга.
Структурная организация, а также узнающие свойства эндонуклеаз семейств "GIY-YIG" и "H-N-H" намного менее изучены, чем у представителей семейства хоуминг-3HflOHyioiea3"LAGLIDADG". Эндонуклеазы 1-7Ы (семейство "GIY-YIG") и \-Нти\ -единственные представители указанных семейств с известной структурой комплексов белок-ДНК (Van Roey et al., 2001; Shen et al., 2004). В составе этих комплексов указанные нуклеазы обладают удивительно вытянутой структурой с множеством четко отделенных друг от друга ДНК-связывающих доменов и мотивов. В белках с подобной структурной организацией замены, как единичных аминокислотных остатков, так и целых доменов, по-
видимому, в меньшей степени отражаются на общей структуре, чем в случае глобулярных белков. Таким образом, эти ферменты, в отличие от таких глобулярных белков, как эндонуклеазы рестрикции и хоуминг-эндонуклеазы семейств "LAGLIDADG" и "His-Cys box", являются удобным объектом для изучения механизмов белок-нуклеиновых взаимодействий, а также для конструирования ферментов с заданной специфичностью. Следует отметить, что изучение структур эндонуклеаз l-Tevl и l-Hmul позволило выявить новые компактные ДНК-связывающие домены. Кроме того, оказалось, что известные ранее ДНК-связывающие домены в этих белках обладают совершенно другими узнающими свойствами. В связи с этим изучение ферментов подобных эндонуклеазам I-Tevl и \-Нти\, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения выявления в них новых ДНК-связывающих доменов, а также характеристики их структурных и узнающих свойств.
Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлось разностороннее изучение четырех гомологичных H-N-H-нуклеаз, кодируемых Т5-подобными фагами. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Доказательство функциональной активности четырех предполагаемых H-N-H-эндонуклеаз.
Картирование точек разрывов, вносимых в ДНК, эндонуклеазами Y-TjR, F-TJIU, F-ЩІІ и F-7/7IV.
Разработка схемы очистки и выделения эндонуклеаз F-Tfll и F-7/Ш.
Биохимическая характеристика эндонуклеаз V-TJR и F-7/7II.
Картирование сайта узнавания эндонуклеазы Т-Т/ЇП.
Научная новизна. В результате данной работы были впервые охарактеризованы четыре гомологичные сайт-специфические H-N-H-эндонуклеазы, гены которых расположены вне интронов. Впервые проведено картирование сайта узнавания подобных эндонуклеаз на примере эндонуклеазы F-Tflll, что позволило предложить возможный
механизм узнавания ДНК этими ферментами. В результате анализа аминокислотных последовательностей исследумых эндонуклеаз, а также их предполагаемых сайтов узнавания, было выдвинуто предположение о причинах разной субстратной специфичности этих ферментов. Кроме того, эти результаты также послужили основанием для выдвижения гипотезы о возможном эволюционном происхождении подобных эндонуклеаз.
Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Изученные в данном исследовании ферменты могут быть использованы для создания нуклеаз с заданной специфичностью. Эндонуклеазы, вносящие одноцепочечные разрывы в ДНК, также могут быть использованы в ходе проведения олигонуклеотид-направленного мутагенеза на этапе удаления нити "дикого" типа. Кроме того, для эффективного клонирования ПЦР-фрагментов, получаемых с помощью ДНК-полимераз, у которых отсутствует корректирующая активность, могут быть сконструированы специализированные вектора, содержащие инвертированные сайты эндонуклеазы Y-TJRV.
H-N-H-эндонуклеазы
В аминокислотной последовательности H-N-H-эндонуклеаз присутствует H-N-H-мотив, который в 1994 году был независимо идентифицирован группой Д. Шуба и А. Горбаленья (Snub et al., 1994; Gorbalenya, 1994). H-N-H-мотив представлен последовательностью из 30-33 аминокислотных остатков, в состав которых входят пары консервативных гистидинов, фланкирующие остаток аспарагина. Проведенный недавно анализ аминокислотного состава H-N-H-мотива и фланкирующих его пар остатков цистеина позволил подразделить H-N-H-семейство на семь подклассов (Mehta et al., 2004). Кроме нуклеазного домена, в состав которого входят аминокислотные остатки H-N-H-мотива, в структуре белков этого семейства могут присутствовать и другие домены такие как, например, обратнотранскриптазный и различные ДНК-связывающие домены (Mehta et al., 2004; Sitbon and Pietrokovski, 2003). Это обстоятельство, по-видимому, и обусловливает огромное разнообразие нуклеаз, входящих в состав этого семейства. Один из представителей семейства H-N-H-эндонуклеаз - эндонуклеаза l-Cmoel, кодируемая интроном типа I, находящимся в хлоропластном гене psbA Chlamydomonas moewusii, обладает свойствами, характерными для хоуминг-нуклеаз из других семейств (Drouin et al., 2000). Так, эндонуклеаза l-Cmoel разрезает последовательность гена, не содержащего интрон, причем разрыв вносится на расстоянии 3 н.п. от места вставки интрона и образуются 3 -выступающие концы из 4 н.о. Большинство известных H-N-H-эндонуклеаз отличается от представителей других семейств хоуминг-нуклеаз. Например, эндонуклеаза ІevlU, кодируемая интроном типа I гена nrdB Т-четного фага RB3, вносит двуцепочечный разрыв в последовательность ДНК, отстоящую на расстоянии 14-16 п.н. от места вставки интрона, тогда как для большинства хоуминг-нуклеаз других семейств это расстояние составляет всего 2-3 п.н. (Eddy and Gold, 1991).
Кроме того, в результате гидролиза ДНК эндонуклеазой \evl\l образуются 5 выступающие концы из 2 и.о., тогда как все остальные хоуминг-нуклеазы образуют 3 -выступающие концы из 2-4 н.о. Только в H-N-H-семействе присутствуют нуклеазы, вносящие одноцепочечные разрывы в ДНК. Среди них lwol, кодируемая интроном типа I, прерывающем последовательность гена nrdE фага Twort Staphylococcus aureus, а также эндонуклеазы I-Hmul, l-Hmu\l и 1-Basl, находящиеся в составе интронов в гене ДНК-полимеразы I соответственно бактериофагов SP01 и SP82 Bacillus subtilis и фага Bastille Bacillus thuringiensis (Landthaler et al., 2002; Goodrich-Blair and Shub, 1996; Landthaler and Shub, 2003). Интересно, что эндонуклеазы l-Hmul и l-Hmull расщепляют ген ДНК-полимеразы как с интроном, так и без него. Это свойство эндонуклеазы l-Hmull, по-видимому, объясняется тем, что узнаваемая ферментом последовательность локализована только в экзоне II, так как расщепление ДНК происходит на расстоянии 52 н.п. от места вставки интрона (Goodrich-Blair and Shub, 1996). В случае эндонуклеазы l-Hmul эта способность обусловлена тем, что в результате вставки интрона изменяются 6-7 н.п., которые не вносят существенного вклада в формирование комплекса фермент-ДНК (Shen et al., 2004). Следует также отметить свойство эндонуклеаз l-Hmul и l-Hmull с большей эффективностью расщеплять ДНК гетерологичного фага, т.е. эндонуклеаза l-Hmul предпочитает расщеплять ДНК фага SP82, тогда как эндонуклеаза l-Hmull - ДНК фага SP01 (Goodrich-Blair and Shub, 1996). Кроме того, эндонуклеаза l-Hmul - первая сайт-специфическая H-N-H-эндонуклеаза с известной структурой комплекса белок-ДНК (Shen et al., 2004). Д. Шуб и А. Горбаленья, впервые обнаружившие H-N-H-мотив, были удивлены тем, что этот аминокислотный мотив характерен для таких разных нуклеаз, как хоуминг-нуклеазы, кодируемые нитронами типа I и типа II (Shub et al., 1994; Gorbalenya, 1994). Среди последних наиболее хорошо изучены хоуминг-эндонуклеазы, кодируемые нитронами all и а12 митохондриального гена СОХ1 из Saccharomyces cerevisiae, а также белок LtrA, кодируемый интроном Ll.LtrB Lactococcus lactis (Zimmerly et al., 1995ab; Matsuura et al., 1997). Эти белки отличает удивительная сложность организации (Martinez-Abarca and Того, 2000; Lambowitz and Zimmerly, 2004). Они представлены четырьмя консервативными доменами: N-концевым обратнотранскриптазным; РНК- и ДНК-связывающими, а также эндонуклеазным доменом, в составе которого присутствует H-N-Н-мотив. Такой белковый продукт, связываясь со своей мРНК, стабилизирует каталитически активную структуру интронной РНК, тем самым, способствуя сплайсингу РНК. Более того, белок сохраняет связь с интронной РНК, образующейся в процессе сплайсинга. В результате формируется рибонуклеопротеиновый комплекс (РНП-частица), катализирующий хоуминг интронов типа И, который называется ретрохоуминг (Curcio and Belfort, 1996; Cousineau et al., 1998; Lambowitz and Zimmerly, 2004). В результате биоинформатического анализа было показано, что H-N-H-мотив присутствует также в аминокислотной последовательности фермента системы репарации Sgrnt-MutS из митохондрий коралла Sarcophyton glaucum (Malik and Henikoff, 2000), a также у ферментов системы рестрикции-модификации McrA, Kpril, Hpyl, NlalU, Sphl, Sap\, NspUl, Nspl и Mboll (цит. no Saravanan et al., 2004).
Более того, в случае эндонуклеаз рестрикции R.Kpnl и Mnll было экспериментально доказано, что аминокислотные остатки H-N-H-мотива участвуют в формировании каталитического центра этих нуклеаз (Saravanan et al., 2004; Kriukiene et al., 2005). К H-N-H-эндонуклеазам относятся также некоторые бактериальные токсины, такие как колицины Е2 и Е7-Е9 (Pommer et al., 1999). Эти токсичные белки синтезируются клетками бактерий в ответ на воздействие, повреждающее ДНК, и секретируются в окружающую среду, вызывая гибель родственных штаммов бактерий. Колицины группы Е состоят из 3 доменов: центрального домена, необходимого для узнавания и связывания с рецепторами наружной мембраны, N-концевого, участвующего в транслокации белка через мембрану, и С-концевого нуклеазного домена. Последний домен содержит H-N-H- мотив и обеспечивает неспецифическую нуклеазную активность колицинов Е2, Е7-Е9. С целью предотвратить гибель собственных клеток бактерии синтезируют иммунные белки, которые прочно связываются с соответствующими колицинами, ингибируя их активность в пределах клетки хозяина. Следует отметить, что большая часть данных о структурной и функциональной организации каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз получена при изучении колицинов Е7 и Е9. 1.3. Каталитический центр H-N-H-эндонуклеаз. 1.3.1. Структура каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз. Первая информация о структурной организации каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз была получена в 1999 году, когда двумя независимыми группами исследователей были опубликованы данные по кристаллической структуре нуклеазных доменов неспецифических нуклеаз колицинов Е7 и Е9 в комплексе с соответствующими иммунными белками Im7 и Im9 (Kleanthous et al., 1999; Ко et al., 1999). Доказательства того, что аминокислотные остатки H-N-H-мотива участвуют в связывании ДНК-субстрата и катализе были получены в результате мутационного анализа колицина Е9 и разрешению структур мутантных форм колицинов Е7 и Е9 в комплексе с ДНК (Garinot-Schneider et al., 1996; Walker et al., 2002; Hsia et al, 2004; Mate and Kleanthous, 2004). И, наконец, в 2004 году, когда стала известна структура эндонуклеазы \-Нти\ в комплексе с ДНК-субстратом (Shen et al., 2004), стало очевидным, что как неспецифические, так и специфические H-N-Н-эндонуклеазы имеют сходную структуру каталитического центра. В связи с этим в данном обзоре структура каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз описана на примере колицина Е9.
Базовые методы молекулярной биологии и биохимии
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР), секвенирование ДНК с использованием ПЦР-фрагментов, разделение белков SDS гель-электрофорезом, электрофорез ДНК в полиакриламидном (в неденатурирующих и денатурирующих условиях) и агарозном гелях, а также электрофоретическое разделение РНК в формальдегидном агарозном геле проводили как описано (Maniatis et al., 1989). 2.4. ДНК-субстраты. В качестве ДНК-субстратов при тестировании активности эндонуклеаз Ffll и F-777II в процессе их очистки использовали соответственно плазмиды pGFIBl/Ser2 и pUC19/orfl7-Gly. В качестве ДНК-субстратов использовали также ПЦР-фрагменты. Названия этих фрагментов, а также матричная ДНК и праймеры, использованные при их синтезе указаны в таблице 1. При синтезе ПЦР-фрагментов использовали один или оба меченых праймера. Мечение праймеров [32Р] проводили с использованием полинуклеотидкиназы фага Т4 ("Promega", США) согласно рекомендациям фирмы-поставщика. у[32Р]АТР получали из ГУП ГНЦ РФ физико-энергетического института им. Лейпунского. Синтезированные ПЦР-продукты предварительно очищали. На первом этапе очистки ПЦР-продукты разделяли гель-электрофорезом в 6% ПААГ с последующим вырезанием участка геля, содержащего фрагмент ДНК нужного размера. Затем гель растирали до гомогенного состояния, элюировали из него ДНК раствором 1М NaCl, осаждали ДНК этанолом и растворяли в 200 мкл 0,2 М NaCl. Дальнейшую очистку ДНК-субстрата проводили с использованием хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ("Whatman", Великобритания). ПЦР-фрагмент наносили на предварительно уравновешенную 0,2 М NaCl ДЕАЕ-целлюлозу, промывали носитель тем же раствором и элюировали ДНК 1 М NaCl. Элюированный препарат ДНК осаждали этиловым спиртом в присутствии 20 мкг гликогена ("Roche", Германия) или 5 мкг дрожжевой тРНК (при получении субстрата для реакций этилирования и обработки гидроксильными радикалами), 0,3 М КОАс и растворяли в ТЕ-буфере (10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,1 мМ ЭДТА). 2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции in vitro. Фрагменты ДНК, используемые в дальнейшем в качестве матрицы для транскрипции in vitro, получали с помощью трехпраймерной ПЦР.
Для амплификации каждой из ОРС использовали универсальный праймер (5 obe-u2) и пару специфических праймеров, комплементарных соответственно матричной и кодирующей цепям ДНК: 5 04-cfl и G2-3 (в случае гена hegk), 5 -ph4-cfl и BF-P QiegQ), 5 015-cfl и Serlr (hegC), 5 018-cfl и 3 Gly (hegD). Структура праймеров приведена в таблице 2. В реакционную смесь универсальный праймер, а также праймеры, комплементарные соответственно матричной и кодирующей цепям ДНК, добавляли в соотношении 50:50:1. В реакции амплификации температура отжига праймеров в течение первых 4-х циклов составляла 35С-38С, а в последующих 30-ти циклах - на ГС-3С ниже температуры отжига праймера, комплементарного кодирующей цепи. 2.6. Транскрипция in vitro. Реакцию транскрипции in vitro проводили в 100 мкл смеси, как было описано в (Gurevich et al., 1991; Pokrovskaya and Gurevich, 1994). Реакционная смесь содержала 200 мМ HEPES-KOH (рН 7,6), 30 мМ MgCl2, 40 мМ дитиотрейтол, 7 мМ каждого НТФ ("Roche", Германия), 2 мМ спермидин, 10 мкг бычьего сывороточного альбумина, 25 единиц ингибитора РНаз "RNAguard" ("Amersham/Pharmacia Biotech", США), 4-5 мкг ДНК-матрицы и 500 единиц Т7 РНК-полимеразы ("Roche", Германия). Реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при 37С. РНК экстрагировали фенолом, насыщенным водой, осаждали 3 М LiCl, а затем повторно осаждали этанолом из 2,5 М ацетата аммония. Концентрацию полученного препарата РНК определяли спектрофотометрически. Однородность транскриптов оценивали с помощью электрофореза в 1,2% формальдегидном агарозном геле. Синтезированные in vitro транскрипты транслировали в бесклеточной системе биосинтеза белка из зародышей пшеницы как было описано ранее (Shaloiko et al., 2004). Реакцию трансляции проводили в 25 мкл смеси, содержащей 40 мМ HEPES (рН 7,6), 3,5 мМ Mg(OAc)2, 80 мМ КОАс, 6 мМ дититрейтол, 1 мМ АТФ, 0,1 мМ ГТФ, 0,25 мМ спермидин, 8 мМ креатинфосфат, 60 мкг/мл креатинфосфокиназа (350 ед./мг), 50 мкМ [14С] лейцин (320 мКи/ммоль; "Amersham", Великобритания), 100 мкМ каждой из остальных 19 аминокислот, 8 мкл экстракта из зародышей пшеницы (OD26o=120). Концентрация РНК в реакционной смеси составляла 400 пмоль/мл. Реакцию проводили при 24С в течение 2 часов.
Продукты трансляции анализировали 15% SDS гель-электрофорезом по модифицированной методике (Laemli, 1970). В качестве маркеров молекулярных весов использовали набор фирмы "Roche" (Германия) от 14,4 кДа до 97,4 кДа. Гели визуализировали с использованием системы "Cyclone Storage Phosphor System" ("Packard Instruments Co.", США). 2.8. Анализ нуклеазной активности. Во всех экспериментах, если условия особо не оговариваются, гидролиз ДНК эндонуклеазами проводили в течение 20 мин при температуре 37С в стандартном растворе (15 мкл) следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCh. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ. При первичной характеристике, а также при картировании точек разрывов, вносимых эндонуклеазами F/ll, F-7J7II, F-ТУШІ и F-7/7IV 32Р-меченый ДНК-субстрат инкубировали с соответствующей эндонуклеазой (0,5-0,8 пмоль), синтезированной в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Реакции проводили в стандартных условиях в присутствии ДНК из тимуса теленка (3 мкг). При подборе оптимальных условий гидролиза Р-меченые по одной из цепей фрагменты ДНК "субстрат 5а" или "субстрат 6" инкубировали с очищенным препаратом соответственно эндонуклеаз F-7/Л и FJ1U в стандартных условиях. При проведении этих экспериментов один из компонентов реакционной смеси или температура варьировали следующим образом: 1) Подбор оптимальных значений рН проводили в следующих буферных растворах: MES (рН 6,0), BES (рН 7,0), Tris-HCl (рН 8,0 и рН 9,0), CAPS (рН 10,0 и рН 11,0), концентрация которых в реакционной смеси составляла 50 мМ; 2) Температура от 20С до 60С, при этом вместо 50 мМ Tris-HCl (рН 9,0 при 37С) использовали 50 мМ CHES (рН 9,0 при 30С и 50С); 3) Концентрация NaCl/KCl от 0 до 500 мМ. При изучении зависимости активности ферментов от ионов двухвалентных металлов 32Р-меченые по одной из цепей фрагменты ДНК "субстрат 5а" и "субстрат 7" инкубировали с очищенными препаратами соответственно эндонуклеаз F/Л и F-7y7II в буферном растворе, содержащем 50 мМ BES (рН 7,0) и 100 мМ NaCl. В качестве источника ионов двухвалентных металлов использовали соли MgCb, СаСІг, СоСЬ, MnSC 4, C11SO4, NiS04 и ZnSC 4, концентрация которых варьировала от 0,05 мМ до 10 мМ (в случае эндонуклеазы YJR) или от 0,001 мМ до 10 мМ (в случае эндонуклеазы F-7J7II). Для выполнения этих экспериментов препараты эндонуклеаз тщательно диализовали против раствора, содержащего 25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 50 мМ NaCl. Продукты гидролиза плазмидных ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией фрагментов ДНК в проходящем ультрафиолетовом свете. Продукты гидролиза ПЦР-фрагментов разделяли электрофорезом в 6% ПААГ, содержащем 8 М мочевину.
Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
Поиск последовательностей, гомологичных изучаемым белкам, и их выравнивание Проводили на веб-сайте "NCBI" (http://www.ncbi.nlm.nih.Qov/blast ) с использованием "PSI-BLAST" (Altschul et al., 1997). Поиск белковых доменов и мотивов проводили в базе данных "InterPro" (Mulder et al., 2005). Вторичная структура эндонуклеаз F-7J7I, F-7/711, F-7/7111 и F-7/7IV была предсказана с использованием программы "PsiPred" (Jones, 1999). При предсказании третичной структуры N-концевого участка эндонуклеазы F-7/7IV использовали программы "SAM" (Gough et al., 2001), "PSI-BLAST" (Altschul et al., 1997), "PROSITE" (Falquet et al., 2002) и "SCFHREADER" (Rykunov et al., 2000). Потенциальные неструктурированные участки были предсказаны с помощью "FoldUnfold" (Galzitskaya et al., 2006). В результате сравнения выведенных аминокислотных последовательностей этих ОРС с последовательностями белков базы данных "UniProt" было показано, что trn 2.13 и trn 2.16 (соответственно позиции 3916-4500 н.п. и 2291-2872 н.п. в ДНК фага Т5), trn 2.2 (позиции 9273-9956 н.п. в ДНК фага Т5 и 9166-9849 н.п. в ДНК фага BF23), а также trn 2.11 (позиции 4803-5378 н.п. в ДНК фага (р5) гомологичны известным H-N-H-эндонуклеазам l-Basl (Landthaler and Shub, 2003), lwol (Landthaler et al., 2002), l-Hmul и l-Hmull (Goodrich-Blair and Shub, 1996). Кроме того, анализ аминокислотных последовательностей этих ОРС с целью обнаружения белковых доменов и мотивов выявил в них домен "HNH nuclease" (IPR003615; база данных "InterPro"), соответствующий так называемому H-N-H-мотиву (рис. 10а; Gorbalenya, 1994; Shub et al., 1994), аминокислотные остатки которого принимают участие в формировании каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз (Walker et al., 2002). На основании полученных результатов мы предположили, что trn 2.2, trn 2.11 , trn 2.13 и trn 2.16 кодируют H-N-H-эндонуклеазы, подобные хоуминг-эндонуклеазам, и обозначили их как гены соответственно hegA, hegB, hegC и hegD (homing endonuclease genes). Из результатов множественного аминокислотного выравнивания, представленного на рисунке 10а, видно, что HegB, HegC и HegD гомологичны между собой по всей длине последовательности. В N-концевом участке этих белков был обнаружен составной домен "NUMOD4" (состоит из трех частей: А, В и С; IPR010902), аминокислотные остатки которого участвуют в образовании узнающего домена эндонуклеазы l-Hmul (Shen et al., 2004). Кроме того, вторичная структура этой области, предсказанная для изучаемых белков, соответствует вторичной структуре, рассчитанной для указанного мотива (Sitbon and Pietrokovski, 2003; рис. 106). Белок HegA гомологичен HegB, HegC и HegD преимущественно в области H-N-H-мотива и С-концевой последовательности.
Следует отметить, что половина консервативных остатков, составляющих мотив "NUMOD4", в его аминокислотной последовательности отсутствует (рис. 106). В то же время, N-концевые аминокислотные остатки (а.о. 5-65) HegA гомологичны С-концевым участкам некоторых представителей транскрипционных регуляторов семейств "LuxR" и "FixJ/UhpA" (рис. 10в). Более того, в этом участке аминокислотной последовательности HegA был обнаружен ДНК-связывающий НТН-домен (IPR000792 и IPR009059; "InterPro"), который также характерен для представителей семейств "LuxR" и "FixJ/UhpA". При предсказании третичной структуры N-концевого участка HegA (а.о. 1-65) был проведен поиск возможных гомологов в базе данных "SCOP" и выравнивание структуры указанного белка с ними (анализ проведен С.А. Гарбузинским и О.В. Галзитской, ИБ РАН). Интересно, что наилучшее выравнивание было получено с представителями GerE-подобного SCOP-семейства (семейство транскрипционных регуляторов "LuxR/UhpA"). В состав этого семейства входят четыре домена: однодоменный белок GerE (код белковой структуры (PDB-код) lfse), а также С-концевые домены таких факторов транскрипции как TraR (PDB-коды 1131 и lhom), NarL (PDB-коды 1а04, lje8 и lrnl) и RcsB (PDB-код lp4w) (Ducros et al., 2001; Pristovsek et al., 2003; Vannini et al., 2002; Maris et al., 2002). Эти домены состоят из четырех а-спиралей, причем две центральные сс-спирали участвуют в формировании ДНК-связывающего НТН-мотива, а последняя сс-спираль ответственна за димеризацию белков GerE, TraR и NarL. Следует отметить, что N-концевой участок HegA (а.о. 1-65) хорошо выравнивается со всем GerE-подобным доменом за исключением аминокислотной последовательности с координатами а.о. 44-65, соответствующей последней а-спирали (а-спираль IV) указанного домена. Тестирование активности предполагаемых эндонуклеаз проводили с использованием ПЦР-фрагментов, синтезированных с ДНК близкородственных фагов, у которых исследуемая ОРС отсутствует. Эти фрагменты включали гомологичные участки ДНК, прилегающие к соответствующей ОРС фага Т5 или фага (р5. В соответствии с этой стратегией для тестирования активности предполагаемых эндонуклеаз синтезировали меченые по обеим цепям ПЦР-фрагменты с использованием ДНК фага р5 (для тестирования HegA) или ДНК фага BF23 (для тестирования HegB, HegC и HegD). Синтезированные фрагменты ДНК ("субстрат 1а", "субстрат 2а", "субстрат За" и "субстрат 4") инкубировали с аликвотами смесей, содержащих продукты трансляции in vitro соответственно ОРС hegC, hegD, hegE и hegA (рис. 12).
В результате анализа продуктов этих реакций гель-электрофорезом в неденатурирующих условиях было показано, что только в случае HegA наблюдается гидролиз ДНК-субстрата (рис 12а). В тоже время, анализом продуктов реакций гель-электрофорезом в денатурирующих условиях был выявлен гидролиз ДНК-субстратов белками HegB, HegC и HegD (рис. 126, в и г). Следует отметить, что инкубация меченых ДНК-субстратов, используемых для тестирования активности предполагаемых эндонуклеаз, с экстрактами из зародышей пшеницы не приводит к появлению специфических продуктов гидролиза (данные не представлены). Таким образом, на основании результатов, полученных в этих экспериментах, был сделан вывод о том, что продукты генов hegA, hegE, hegC и hegD являются сайт-специфическими эндонуклеазами, которые были обозначены соответственно как FfIN, F-7/7111, F-7 7I и F-777II (Т five - like bacteriophages) согласно принятой номенклатуре (Belfort and Roberts, 1997). Кроме того, из этих результатов следует, что эндонуклеаза F-7J7IV вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, тогда как остальные - одноцепочечные разрывы. В экспериментах, в которых в качестве ДНК-субстратов использовали Р-меченые по одной из цепей фрагменты ДНК, былоКак было сказано выше, эндонуклеазы Ffll, Fflll и Ffllll гомологичны эндонуклеазам 1-Нти\ и \-Hmull. Известно, что последние два фермента разрезают как ДНК "своего", так и близкородственного фагов. Таким образом, можно было предположить, что изучаемые нами эндонуклеазы также способны разрезать ДНК "своего" фага. Для проверки этого предположения были синтезированы субстраты с использованием ДНК фага Т5 (для тестирования эндонуклеаз Ffll и Fflll) и ДНК фага ф5 (для тестирования эндонуклеазы F-ТуЛІІ). В результате обработки синтезированных фрагментов ДНК ("субстрат lb", "субстрат 2Ь" и "субстрат Зс") соответственно эндонуклеазами F-7/7I, F-7y7II и Ffllll было показано, что первые два фермента, в отличие от последнего, способны расщеплять ДНК "своего" фага (данные не представлены; последовательности обнаруженных сайтов эндонуклеаз FJJI и F-777II приведены на рис. 14а и б). На основании высокой гомологии эндонуклеаз Ffll, F-777II и F-7/7111 можно было также предположить, что они способны узнавать сайты друг друга. Возможность перекрестного узнавания была проверена в экспериментах, в которых субстраты, используемые при характеристике одной эндонуклеазы, инкубировали с другой эндонуклеазой и наоборот (рис. 15). В результате проделанных экспериментов было показано, эндонуклеаза Fflll узнает оба сайта эндонуклеазы Ffllll (рис. 16).
Эндонуклеаза F-7J7II специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания
Грубое картирование сайта узнавания ДНК эндонуклеазы F-ТуЛІ проводили с помощью ДНКазы I. С этой целью ДНК-субстрат, а также комплекс этого субстрата с эндонуклеазой Fflll обрабатывали ДНКазой І. В результате этого эксперимента было показано, что эндонуклеаза Fflll защищает от ДНКазы I нижнюю цепь ДНК-субстрата от положения -24 до положения +12 (рис. 20). Левая граница сайта узнавания по верхней цепи была локализована в положении -23. К сожалению, нам не удалось локализовать правую границу сайта узнавания из-за гидролиза ДНК-субстрата изучаемой эндонуклеазой в условиях проведения эксперимента. Таким образом, эта эндонуклеаза связывает протяженный асимметричный участок ДНК, длина которого составляет 36 н.п. Грубое картирование сайта узнавания ДНК эндонуклеазы F-ТуЛІ проводили с помощью ДНКазы I. С этой целью ДНК-субстрат, а также комплекс этого субстрата с эндонуклеазой Fflll обрабатывали ДНКазой І. В результате этого эксперимента было показано, что эндонуклеаза Fflll защищает от ДНКазы I нижнюю цепь ДНК-субстрата от положения -24 до положения +12 (рис. 20). Левая граница сайта узнавания по верхней цепи была локализована в положении -23. К сожалению, нам не удалось локализовать правую границу сайта узнавания из-за гидролиза ДНК-субстрата изучаемой эндонуклеазой в условиях проведения эксперимента. Таким образом, эта эндонуклеаза связывает протяженный асимметричный участок ДНК, длина которого составляет 36 н.п.Контакты эндонуклеазы FJU1 с сахаро-фосфатным остовом ДНК выявляли с использованием гидроксильных радикалов, которые образуются при восстановлении перекиси водорода ионом Fe . Предполагается, что указанные радикалы атакуют остатки дезоксирибозы остова ДНК, что приводит к его разрыву (Tullius and Dombroski, 1986). Как видно из рисунка 21, остатки дезоксирибозы, защищаемые изучаемым ферментом, локализованы в пределах участка ДНК от положения - 21 до + 8. Таким образом, эндонуклеаза F-7yJII защищает протяженный асимметричный участок ДНК, что согласуется с результатами, полученными в экспериментах по защите ДНК от действия ДНКазы I. Следует отметить, что различия в границах сайта узнавания, выявленные в этих экспериментах, отражают различия размеров атакующих реагентов.
Благодаря небольшим размерам гидроксильных радикалов можно более точно локализовать сайт узнавания. В пределах выявленного участка защищаемые остатки дезоксирибозы локализованы в трех группах: а, Ь, с и а , Ь , с соответственно на верхней и нижней цепях (рис. 21 в). Эти группы контактов отделены друг от друга незащищенными участками ДНК из 5-8 н.п. Пары групп (а/а , b/b и с/с ), расположенные на противоположных цепях, смещены друг относительно друга в 5 -направлении. На основании такого расположения выявленных групп контактов с остовом ДНК можно предположить, что эндонуклеаза F-7y7II контактирует с тремя соседними, большими желобками сайта узнавания. Кроме того, можно также предположить, что этот фермент связывается с двумя малыми желобками, так как группы контактов а /b и Ь7с смещены друг относительно друга в 3 -направлении (Oakley and Dervan, 1990). Следует отметить, что вблизи места гидролиза эндонуклеаза F-7)711, по-видимому, связывается с узнаваемой последовательностью со стороны малого желобка ДНК. Контакты ДНК-связывающих белков с основаниями ДНК локализуют с использованием субстратов, в составе которых отсутствует в среднем один нуклеозидный остаток. Такой субстрат, полученный при обработке ДНК гидроксильными радикалами, инкубировали с эндонуклеазой Fflll и разделяли комплекс и несвязанный субстрат электрофорезом в неденатурирующих условиях. Эти фрагменты ДНК элюировали и анализировали с использованием секвенирующего гель-электрофореза с последующей радиоавтографией гелей (рис. 22а). Затем проводили денситометрическое сканирование радиоавтографов и сравнивали наборы полос, характерные для каждого из этих образцов (рис. 226). При сравнении полагали, что уменьшение интенсивности полосы или ее исчезновение в образце, содержащем комплекс F-ТуШ-субстрат, и одновременное усиление или появление соответствующей полосы в образце, содержащем несвязанный субстрат, определяет положение нуклеозида, существенного для формирования комплекса. Как видно из результатов, суммированных на рисунке 22в нуклеозиды, существенные для образования комплекса, собраны в двух участках, каждый из которых представлен последовательностью из 7 н.о. Эти участки отделены друг от друга последовательностью ДНК из 15 н.п. и расположены асимметрично относительно места внесения разрыва. Интересно, что контакты эндонуклеазы F-7y7II с ДНК выявлены на обеих цепях, причем наиболее сильные из них расположены на верхней цепи одного участка и на нижней цепи - другого.
К сожалению, как видно из рисунка 226, нам не удалось выявить контакты в двух небольших областях (указаны скобками) из-за гидролиза ДНК изучаемой эндонуклеазой в условиях проведения эксперимента. и G+2 в верхней цепи, а также G.H, G.H, А+З И G+4 в нижней цепи. Кроме того, G.2 в верхней цепи слабо защищается от метилирования, а также наблюдается незначительное усиление метилирования остатков Сю, G-9 и G-з в нижней цепи (рис. 23). В параллельной серии экспериментов метилированный ДНК-субстрат инкубировали с эндонуклеазой F-7)711 с последующим разделением связанного и несвязанного с ферментом фрагментов ДНК. Эти фрагменты элюировали из геля и после предварительной обработки щелочью анализировали так же, как описано в пункте 3.8.3. Сравнение между собой наборов полос, характерных для образцов, содержащих связанный и несвязанный ДНК-субстрат, показало, что метилирование остатков, выявленных в предыдущем эксперименте как "сильно защищаемые", также существенно препятствует образованию комплекса (рис. 24). Кроме того, незначительно влияет на комплексообразование метилирование А в положении -15, G - в положении -2, а также G - в положении +10. Следует отметить, что большая часть выявленных пуринов совпадает или прилегает к основаниям, локализованным в эксперименте с ДНК-субстратами с удаленным нуклеозидом. Таким образом, учитывая полученные результаты, можно заключить, что эндонуклеаза Fflll связывается с основаниями двух выявленных участков ДНК в основном со стороны большого желобка ДНК, и только вблизи точки гидролиза она контактирует также и с малым желобком ДНК-субстрата. Этот вывод согласуется с тем заключением, к которому мы пришли в эксперименте по "защите" от гидроксильных радикалов. 5.5.5. Контакты с остатками фосфатов остова ДНК не существенны для образования комплекса FflII-ДНК. Один из подходов при установлении контактов белка с сахаро-фосфатным остовом ДНК заключается в использовании этилированных субстратов. В таких модифицированных молекулах ДНК в среднем один из фосфатов этилирован, что стерически или из-за нейтрализации отрицательного заряда может препятствовать образованию комплекса. Использование этого подхода в случае эндонуклеазы F-777II показало, что этилирование ДНК-субстрата существенно не препятствует образованию комплекса. Между тем, этилирование фосфатов, указанных на рисунке 25, все же незначительно влияет на комплексообразование. Большинство из них (четыре из пяти) расположены в тех же положениях, в которых ранее были локализованы контакты эндонуклеазы F-777II с основаниями. Результаты всех экспериментов по картированию сайта узнавания эндонуклеазы Fflll обобщены на рисунке 26.
