Содержание к диссертации
Введение
1. Доменьї П-глобиновых генов человека и кур. 6
1.1 Общая организация доменов 6-глобиновых генов. 6
1.2. Идентификация области контроля локуса домена 6-глобиновых генов. 9
1.3. Механизм работы области контроля локуса. 15
1.4. Субдомены домена 6-глобиновых генов человека. 22
1.5. Границы домена. 23
2. Домены а-глобиновых генов человека и кур. 28
2.1. Общая организация доменов. 28
2.2. Расположение доменов а-глобиновых генов в перманентно открытой хроматиновой области. 30
2.3. Перекрывание доменов а-глобиновых генов и гена «-14». 32
2.4. Пространственная организация домена а-глобиновых генов. 37
2.5. Изменение характера ацетилирования гистонов в домене а-глобиновых генов. 41
3. Заключение 44
4. Материалы и методы. 45
4.1 Культуры клеток. 45
4.2 Выделение РНК из клеточных культур. 45
4.3 РТ-ПЦР анализ. 46
4.4 Полимеразная цепная реакция. 48
4. 5Перенос по Нозерну. 50
4.6 Синтез РНК-проб для анализа по Нозерну. 51
4.7 Синтез РНК-проб для гибридизации in situ. 51
4.8 Гибридизация in situ. 53
4.9 Выявление сигнала. 54
4.10 Окраска и заключение препаратов. 55
4.11 Флуоресцентная микроскопия. 55
5 Результаты исследований и их обсуждение. 56
5.1.Картирование границы эритроид-специфичной транскрипционной единицы в 5'- концевой области домена а-глобиновых генов кур. 56
5.2. Анализ области транскрипции домена а-глобиновых генов кур в клетках HD3. 61
5.3. Демонстрация непрерывности полнодоменного транскрипта домена глобиновых генов кур. 64
5.4. Одновременная транскрипция с обеих цепей ДНК в домене а-глобиновых генов кур. 67
Выводы 78
- Идентификация области контроля локуса домена 6-глобиновых генов.
- Расположение доменов а-глобиновых генов в перманентно открытой хроматиновой области.
- 5Перенос по Нозерну.
- Анализ области транскрипции домена а-глобиновых генов кур в клетках HD3.
Введение к работе
В настоящее время практически не подлежит сомнению тот факт, что геном эукариот организован в отдельные хроматиновые домены. На сегодняшний день известно, по крайней мере, два типа доменов: структурно-функциональные и функциональные. Типичными доменами, определенными по структурному признаку, являются домены тканеспецифичных генов, характеризующиеся повышенным уровнем чувствительности к нуклеазам и повышенным уровнем ацетилирования гистонов в тех тканях, где домен активен. На границах этих доменов часто расположены инсуляторы, которые ограничивают область действия позитивных регуляторных элементов и препятствуют распространению репрессивных структур хроматина. Типичными примерами таких «классических» хроматиновых доменов, содержащих тканеспецифичные гены, являются домены р-глобиновых генов позвоночных [1], домен овальбуминовых генов кур [2], домен гена лизоцима КУР [3], домен гена аполипопротеина В человека [4]. Можно было бы предположить, что весь геном состоит из единообразно организованных доменов, однако изучение различных геномов показало, что наряду с «классическими» доменами существует и множество «неканонических» доменов, в том числе доменов с перекрывающимися генами и регуляторными системами. Именно к такому типу доменов относятся домены а-глобиновых генов позвоночных. Они расположены в богатых генами хромосомных областях и являются предпочтительно чувствительными к нуклеазам во всех типах клеток. Такие домены было предложено называть доменами «открытого типа» или доменами с «размытыми границами» [5].
Одним из наиболее изученных доменов открытого типа является домен а-глобиновых генов кур. Этот домен перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ggPRX и является одним из первых доменов, где были обнаружены некодирующие межгенные транскрипты. Функциональное значение такого рода транскриптов оставалось неясным. Согласно одной из гипотез, они играют важную роль в поддержании активного статуса хроматинового домена.
Следует подчеркнуть, что домены открытого типа, содержащие одновременно тканеспецифичные гены и гены домашнего хозяйства, привлекли внимание исследователей сравнительно недавно. Принципы взаимодействия регуляторных механизмов, контролирующих работу разных генов в доменах этого типа, изучены недостаточно. В то же время домены открытого типа составляют значительную часть генома. Раскрытие общих принципов организации этих доменов существенно расширит наши знания о механизмах контроля экспрессии генов в эукариотической клетке.
Настоящая работа посвящена изучению полнодоменного транскрипта домена а-глобиновых генов кур, а именно картированию его границ и изучению феномена симметричной транскрипции 5 - концевой области домена.
Идентификация области контроля локуса домена 6-глобиновых генов.
Областью контроля локуса принято называть регуляторный элемент, контролирующий транскрипционный статус протяженного геномного домена, содержащего один или несколько тканеспецифичных генов Первая область контроля локуса (впоследствии получившая сокращенное название «LCR») была открыта при изучении домена р-глобиновых генов человека (рис.2). Известно, что нарушения уровня экспрессии глобиновх генов являются причиной различных серьезных заболеваний - талассемий. Анализ характера геномных нарушений при разных формах талассемий показал, что участки ДНК, расположенные на расстоянии около 5 т.п.н. перед кластером р-глобиновых генов человека, необходимы для нормальной экспрессии р-глобиновых генов [18], [19]. В независимых экспериментах было установлено, что на расстоянии 6-22 т.п.н. перед кластером Р-глобиновых генов человека находится блок участков гиперчувствительности к ДНКазеї, включающий четыре эритроид-специфичных и один перманентный участок [1], [20]. Участки гиперчувствительности к ДНКазе 1 в хроматине, как правило, обозначают положение различных регуляторных последовательностей в ДНК. Были обнаружены делеции 5 -концевой области домена, не затрагивающие собственно глобиновые гены и их промоторы, но приводящие, тем не менее к развитию талассемий. В данном случае делеции и другие геномные перестройки, приводящие к талассемиям, всегда затрагивали блок участков гиперчувствительности к ДНКазеІ. Наиболее короткая из известных делений такого типа (так называемая Испанская делеция), приводящая к у5р-талассемии, удаляла четыре гиперчувствительных участка и 25 т.п.н. перед ними (рис.2А). В эритроидных клетках, содержащих Испанскую делецию, Р-глобиновый домен находится в транскрипционно неактивном состоянии, является устойчивым к действию ДНКаз и позднореплицирующимся. В нормальных эритроидных клетках он реплицируется в начале S-фазы, а в клетках с испанской делецией в конце S-фазы [21]. Это позволило предположить, что блок участков гиперчувствительности к ДНКазеІ, находящийся на расстоянии 6-22 т.п.н. перед кластером р глобиновых генов человека, обозначает положение особого регуляторного элемента, контролирующего транскрипционный статус протяженного геномного домена на уровне упаковки этого домена в хроматин. Этот регуляторный элемент был назван областью контроля локуса (LCR). Ключевые опыты были сделаны на трансгенных мышах.
В лаборатории Гросвельда было продемонстрировано, что фрагмент ДНК домена Р-глобиновых генов человека, содержащий четыре гиперчувствительных сайта (5ТЧС 1-5, рис.2Б), поставленный перед всем кластером Р-глобиновых генов или перед одним из генов, обеспечивает высокий и не зависящий от места интеграции уровень экспрессии этих генов в эритроидных клетках трансгенных мышей [22], [23]. Практически сразу после этого показали, что LCR домена р-глобиновых генов человека работает аналогичным образом и в отношении других трансгенов, поставленных под его контроль [24], [25]. В течение многих лет изучение организации и функциональной активности LCR было возможно лишь в модельных опытах на трансгенных мышах. Однако любая модельная система позволяет лишь частично воспроизвести реальную ситуацию. Существенным недостатком первых опытов по интеграции полного или частично делетированного локуса Р-глобиновых генов в геном трансгенных мышей была множественная интеграция конструкций [22], [23], [24], [25]. При микроинъекции конструкций в пронуклеус яйцеклетки как правило наблюдается тандемная интеграция значительного числа копий конструкции в одно и то же место генома [26]. Понятно, что в таком искусственно возникшем «ампликоне» возможно взаимное влияние регуляторных элементов, расположенных в повторяющихся блоках. Использование фаговых [27] и дрожжевых [28] систем сайт-специфической рекомбинации позволило получать трансгенных животных, геном которых содержит только одну копию генной конструкции [29], [27]. Хотя такая модель более адекватна, однако и она не полностью отражает условия работы LCR в нормальной геномной позиции. Сейчас все более очевидно, что макроокружение и пространственная организация тех или иных геномных элементов в ядре эукариотической клетки заметно влияют на их работу [30]. В связи с этим чрезвычайно важен детальный анализ функциональной активности LCR и его отдельных блоков в нормальной геномной позиции. Первый опыт такого рода поставила, в сущности, сама природа. В данном случае имеется в виду Испанская деления и различные талассемии. Развитие техники направленных делеций (knock-out) позволило охарактеризовать результаты удаления отдельных блоков либо всего LCR из хромосомы. Понятно, что в случае с LCR человека опыты такого рода возможны лишь на культурах клеток. Результаты экспериментов по направленным делециям различных элементов LCR оказались довольно неожиданными. Как и предполагалось, делеций протяженных участков 0-глобинового LCR на человеческой хромосоме приводили к подавлению экспрессии глобиновых генов. Но в противоположность предположениям, базирующимся на изучении клеток с Испанской делецией, домен оставался ДНКаза-чувствительным и ранореплицирующимся. После удаления LCR также Первый опыт такого рода поставила, в сущности, сама природа. В данном случае имеется в виду Испанская делеция и различные талассемии. Развитие техники направленных делеций (knock-out) позволило охарактеризовать результаты удаления отдельных блоков либо всего LCR из хромосомы. Понятно, что в случае с LCR человека опыты такого рода возможны лишь на культурах клеток.
Результаты экспериментов по направленным делециям различных элементов LCR оказались довольно неожиданными. Как и предполагалось, делеций протяженных участков Р- глобинового LCR на человеческой хромосоме приводили к подавлению экспрессии глобиновых генов. Но в противоположность предположениям, базирующимся на изучении клеток с Испанской делециеи, домен оставался ДНКаза-чувствительным и ранореплицирующимся. После удаления ЬСЯсохранялось гиперацетилирование гистонов, характерное для активного хроматинового домена. На основе этих экспериментов были сделаны выводы о том, что LCR не является необходимым для поддержания активной конфигурации р-глобинового домена. Поскольку данные эксперименты были выполнены на культурах клеток, существовала вероятность того, что функция LCR является существенной на некоторых важных стадиях эмбрионального развития. Однако, вероятность подобного факта была исключена при изучении мышей, содержащих делеции в эндогенном р- глобиновом LCR. Направленные делеции некоторых внутренних элементов мышиного р-глобинового LCR имели малое воздействие на экспрессию Р- глобиновых генов, а делеции некоторых из них в 5 -гиперчувствительных сайтах (ГЧС) приводили к снижению уровня транскрипции не более, чем на 20%. Делеция большей части мышиного LCR приводила к резкому снижению уровня транскрипции Р-глобиновых генов как в культурах клеток, так и у трансгенных мышей. Однако, в отличие от сходной делеции у человека, транскрипция не была полностью подавлена в отсутствие LCR. Домен оставался ДНКаза-чувствительным и обнаруживал гиперацетилирование гистонов НЗ и Н4 на всем своем протяжении. Кроме того, был сохранен правильный порядок включения Р-глобиновых генов в процессе развития. В соответствии с результатами этих исследований, делеция 5 ГЧ1-4 у мышей также вызывала Р-талассемический фенотип с низким уровнем экспрессии взрослых Р-глобиновых генов в мутантной аллели гетерозиготных мышиных особей. При низком уровне экспрессии в мутантной аллели нормальный уровень экспрессии наблюдался только в 1-3% эритроидных клеток, тогда как аллель была инактивирована в большей части клеток. Однако хроматиновая структура локуса еще не была подвержена изменениям в результате этой мутации. Исходя из этих данных было сделано заключение о том, что у мыши LCR не является необходимым ни для поддержания активной конформации домена р-глобиновых генов, ни для обеспечения правильного порядка экспрессии этих генов в ходе развития [31].
Расположение доменов а-глобиновых генов в перманентно открытой хроматиновой области.
Домен а-глобиновых генов кур расположен в нуклеаза-чувствительной (открытой) хроматиновой конформации как в эритроидных, так и в неэритроидных клетках. Активация экспрессии глобиновых генов коррелирует с появлением сайтов гиперчувствительности к ДНКазеї (ГЧС) на промоторах всех глобиновьгх генов [89], [90], а также с гиперацетилированием гистонов в границах всего домена. Домен ограничен несколькими группами эритроид-специфичных и конститутивных ГЧС [91]. Некоторые из этих ГЧС колокализованы со структурными и регуляторными элементами, такими как участок начала репликации и области прикрепления к матриксу. Ни одна из ГЧС-богатых областей, идентифицированных в 5 -области домена а-глобиновых генов кур (приблизительно 15 т.п.н. перед %-геном) не обнаруживает функциональной активности LCR. Однако некоторые ГЧС маркируют негативные регуляторные элементы, такие как транскрипционные сайленсеры [92], инсуляторы [93] и избирательно метилированные в неэритроидных клетках CpG-богатые элементы [83]. Как уже было сказано выше, а-глобиновый куриный домен расположен в перманентно открытой богатой генами хромосомной области. Этот факт может объяснить, почему для подавления экспрессии альфа- глобиновых генов могут быть необходимы негативные регуляторные элементы доменного уровня. Наряду с этими негативными элементами существует и позитивный регуляторный элемент, обладающий некоторыми характеристиками LCR Этот регуляторный элемент располагается на значительном расстоянии перед собственно кластером глобиновых генов в интроне гена домашнего хозяйства, транскрибирующемся в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов [94]. Домен а-глобиновых генов кур является одним из первых доменов, где были обнаружены некодирующие межгенные транскрипты [95], [59]. Функциональное значение межгенных транскриптов а-глобинового домена кур остается не ясным. Изучение этого вопроса является одной из задач настоящей работы. Авторы цитированных выше работ полагали, что эти транскрипты могут быть предшественниками глобиновых мРНК. Это предположение не получило однако экспериментальных подтверждений [78]. Мы вернемся к обсуждению данного вопроса в заключительной части диссертации. 2.3. Перекрывание доменов а-глобиновых генов и гена «-14». Ранее было показано, что в 5 - некодирующей области а-глобиновых доменов млекопитающих и птиц расположен высококонсервативный ген «домашнего хозяйства» [96], [97], который транскрибируется в направлении, противоположном направлению транскрипции а-глобиновых генов.
Впервые этот ген был обнаружен у человека. Не зная функции кодируемого геном белка (которая остается неизвестной до настоящего времени), авторы назвали ген «-14», имея ввиду расстояние от первого экзона этого гена до кластера сс-глобиновых генов. LCR-подобные регуляторные элементы кластера а-глобиновых генов расположены в пятом интроне «-14» гена. В домене а-глобиновых генов человека был обнаружен цис-регуляторный элемент (HS-40), обладающий некоторыми свойствами LCR. Он располагается на расстоянии 40 т.п.н. перед эмбриональным а-глобиновым геном. Детальный структурный анализ показал, что HS-40 имеет высокую степень сходства с 0-ГЧ2. Однако в экспериментах с трансфецированными MEL клетками и трансгенными мышами были обнаружены важные функциональные различия. Уровень экспрессии глобиновых генов, связанный с HS-40, ниже, чем у P-LCR. Кроме того, он не имеет строгой зависимости от количества копий в интегрируемом фрагменте и понижается в процессе развития [98], вследствие чего, некоторые последовательности могут быть ассоциированы с другими эритроид-гиперчувствительными сайтами, которые были картированы на расстоянии 4, 8, 10 и 33 т.п.н перед мРНК кэп-сайтом -глобинового гена. Ранее было показано, что сегмент ДНК размером 70 т.п.н., охватывающий весь домен и включающий все известные эритроид-специфические элементы, не обеспечивает полную регуляцию а-глобинового кластера у трансгенных мышей [99]. Идентификация LCR-подобного регуляторного элемента домена сс-глобиновых генов человека базировалась прежде всего на картировании делеций, приводящих к развитию талассемий (как и в случае с доменом Р-глобиновых генов). Кластер а-глобиновых генов человека находится на хромосоме 16 и включает в себя гены 2, а2, а1 и 91.
Было показано, что протяженные делеций, удаляющие область, расположенную перед кластером а-глобиновых генов человека, ассоциированы с отрицательной регуляцией обоих а-генов. Все делеции подобного рода удаляют фрагмент ДНК размером около 20 т.п.н., расположенный на расстоянии 33 т.п.н. перед м РНК кэп-сайта -гена. Эти данные говорят о том, что позитивные регуляторные последовательности существуют в этом сегменте ДНК. На гибридной MEL клеточной линии, содержащей копию человеческой хромосомы 16 с делецией 62 т.п.н., было показано, что экспрессия а- глобиновых генов падает до низкого, но детектируемого уровня. Прежде, естественные делеции давали лишь одну модель для проверки эффекта, который они оказывают на главный а-глобиновый регуляторный элемент в его естественном хромосомном положении. Хотя все естественные мутации делетируют HS-40, они также удаляют протяженные сегменты ДНК, включающие другие эритроид-специфические ДНКазаІ гиперчувствительные сайты, локализованные на расстоянии 33, 10, 8 и 4 т.п.н. перед а-глобиновым кластером , что приводит к серьезным нарушениям в нормальной структуре а-комплекса. Чтобы оценить роль HS-40 в его естественном положении на хромосоме с наименьшими повреждениями, посредством гомологичной рекомбинации был удален фрагмент размером 1.1 т.п.н., содержащий HS-40, с использованием гибридной клеточной линии, содержащей нормальную копию человеческой хромосомы 16. При сравнении уровня экспрессии а-глобиновой мРНК человека в нормальных и мутантных клонах было показано, что уровень экспрессии несколько понижался в отсутствие HS-40. Однако низкий уровень а-глобиновой мРНК был детектирован до и после ииндукции мутантных клеток, которые продемонстрировали приблизительно 3% от уровня экспрессии в нормальных клетках [100]. Экспрессия фетального 61-глобинового гена значительно уменьшалась в мутантных клонах. Этот результат подтверждает предыдущие данные о том, что экспрессия данного гена находится под контролем HS-40 так же как и экспрессия других генов а-глобинового домена. Все эти данные показывают, что ни один из элементов за пределами HS-40 не оказывает активирующего влияния на промоторы а-глобиновых генов. Однако, не исключена вероятность того, что эти элементы при взаимодействии с HS-40 могут усиливать его эффект. То, что низкий уровень экспрессии человеческой а-мРНК наблюдается при отсутствии HS-40, согласуется с предыдущими выводами о том, что гиперчувствительные сайты расположены на а-глобиновых промоторах. Это является подтверждением того, что HS-40 не влияет на их эффект при изменении локальных хроматиновых структур на этих промоторах. Кроме того, было обнаружено, что и другие эритроид-специфические сайты формируются в отсутствие HS-40 [100].
5Перенос по Нозерну.
РНК фракционировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле в буфере ТВЕ, содержащем IxMOPS и 6.3% формальдегида согласно ранее опубликованому протоколу [106]. На каждую точку брали 20 мкг РНК. Перед нанесением на гель РНК денатурировали при 65С в течении 5 минут в смеси ТВЕ с формальдегидом. Затем пробу охлаждали на льду. После электрофореза РНК переносили на мембрану Hybond N+ (Amersham) в 20-кратном растворе SSC согласно методике, предлагаемой производителем. Гель помещали на 3 листа фильтровальной бумаги Watman ЗММ, смоченных в lxSSC и последовательно накрывали нитроцеллюлозной мембраной Hybond-N+, также предварительно смоченной в lxSSC, тремя сухими листами фильтровальной бумаги Watman ЗММ и слоем фильтровальной бумаги толщиной 5-8 см. Наверх помещали груз массой 1 кг и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 часов. После этого мембрану быстро промывали 2xSSC и запекали в течение 2 часов при 80С, а затем инкубировали ее 1 час в Rapid Hyb Buffer (Amersham) при температуре 65С, после чего добавляли предварительно денатурированную пробу. Гибридизацию радиоактивных проб с РІЖ, перенесеной на мембрану проводили в Rapid Hyb Buffer (Amersham) при температуре 65С в течение 12 часов. Синтез РНК-проб для анализа по Нозерну. Для приготовления проб были использованы полученные ранее в лаборатории СВ. Разина субклоны домена. В качестве исходного материала для субклонирования были использованы клоны A,CaG5 и A,CaG6, полученные Энгелем и Додсоном, включающие в себя домен а-глобиновых генов и 5 -концевую область [107]. После расщепления рестриктазами Hind III и Ват HI был получен набор фрагментов ДНК. Те фрагменты ДНК, которые представляли для нас интерес, были переклонированы в вектор pSP73 (Promega Life Science, WI, USA), который содержит промоторы для SP6 и Т7 РНК-полимераз. После этого, с помощью соответствующих рестриктаз, мы линеаризовали плазмидную ДНК, содержащую нужные нам фрагменты, и синтезировали на ней РНК-пробы. Для этого мы использовали SP6/T7 кит для транскрипции (Roche, Switzerland). При приготовлении проб в смесь для синтеза РНК добавляли а Р-УТФ. Синтез РНК-проб для гибридизации in situ. Для синтеза проб нами был выбран участок близко к 3 - концу симметрично транскрибирующейся области.
Для первой части эксперимента, мы выбрали участок ДНК размером около 800 п.н., имеющий позицию39340-40432 в последовательности ДНК (рис. 4 А), депонированной в банке генов под номером AY0160020. Этот фрагмент был вырезан рестриктазами Bglll и Hindlll, а затем клонирован в вектор pSP73. В смесь для транскрипции добавляли УТФ, меченный биотином. Для синтеза проб ко второй части эксперимента мы вырезали фрагмент ДНК, имеющий позицию 31565-32724, рестриктазами Bglll и EcoRV (рис.4 Б). После того, как он был клонирован в вектор pSP73, мы разрезали конструкт рестриктазой Bglll, а затем синтезировали пробы размером 700 и 500 п.н. в противоположных направлениях. Первый фрагмент был транскрибирован в направлении противоположном транскрипции глобиновых генов и помечен биотином, а второй был транскрибирован в глобиновом направлении и помечен дигоксигенином. В данном эксперименте мы синтезировали РНК разных направлений с разных учасков, чтобы не допустить гибридизации проб, меченных биотином и дигоксигенином, между собой. Гибридизация in situ. Клетки фиксировались на стеклах с помощью центрифуги "Cytospin". Для дополнительной фиксации полученные препараты обрбатывались параформальдегидом. Предгибридизационная обработка проводилась в соответствии с ранее опубликованным протоколом [108]. Далее на стекла с клетками наносили смесь для предгибридизации, накрывали парафильмом и помещали во влажную гибризационную камеру, нагретую до 42С, на 2 часа. Затем предгибризационную смесь удаляли и наносили на стекла Юмкл гибридизационной смеси. Гибридизационная смесь содержала 50% формамида, 2xSSC, 10% сульфата декстрана, 0.1% Tween 20, 10 мкг ДНК спермы лосося, обработанной ультразвуком, 10 мкг дрожжевой тРНК и 300-600 нг меченой пробы. После этого препараты снова помещали в гибридизационную камеру и проводили гибридизацию в течение 12-16 часов при температуре 42С. После гибридизации стекла с препаратами подвергали постгибридизационным отмывкам, а затем обрабатывали РНКазой, после чего выявляли сигнал. Выявление сигнала. На стекла наносили блокирующий раствор и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После чего на стекла наносили первичные антитела. Для биотинилированных проб использовали мышиные антитела против биотина, конъюгированные с флуорохромом Alexa 488 (Molecular Probes, Niderlands). Для дигоксигенилированных проб использовали овечьи антитела против дигоксигенина, конъюгированные с родамином (Roche, Switzerland). После удаления первичных антител препараты последовательно обрабатывали еще тремя слоями антител. Инкубацию с антителами проводили в течение 30 минут, после чего стекла промывали 3 раза по 5 минут раствором 4xSSC, содержащим 0.05% Tween 20. Окраска и заключение препаратов. Стекла промывали раствором IxPBS в течение 5 минут, после чего наносили краситель DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) и инкубировали 5 минут. Отмывали DAPI раствором lxPBS, ополаскивали стекла дистиллированной водой и высушивали на воздухе. На стекла наносили заключающую смесь (Dako fluorescent mounting medium, DAKO Corporation) и накрывали предметными стеклами. Флуоресцентная микроскопия. После проявления гибридизационного сигнала каскадом антител препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе Leica DMR. Применяли иммерсионный объектив со 100-кратным увеличением, используя соответствующие фильтры. Просмотренные области препарата фотографировали с помощью встроенной в микроскоп цифровой камеры Leica. І.Картирование границы эритроид-специфичной транскрипционной единицы в 5 - концевой области домена а-глобиновых генов кур. В эритробластах кур протяженная 5 - концевая область домена а-глобиновых генов транскрибируется в глобиновом направлении [109], [59]. По оценкам авторов цитированных публикаций максимальный размер соответствующих транскриптов достигал 17 т.п.н. [59]. Однако границы транскрипционной области домена не были определены. С целью получения информации по данному вопросу представлялось необходимым картировать начало транскрибирующейся области. Кроме того, представлялось интересным выяснить, существуют ли протяженные транскрипты домена о глобиновых генов в неэритроидных клетках.
Анализ области транскрипции домена а-глобиновых генов кур в клетках HD3.
Для того, чтобы картировать всю область, транскрибирующуюся в глобиновом направлении в эритроидных клетках, мы провели гибридизацию по Нозерну ядерной РНК из куриных эритробластов с короткими пробами, взятыми из разных областей домена. Для приготовления проб были использованы полученные ранее в лаборатории СВ. Разина субклонированные фрагменты домена а-глобиновых генов кур. Эти субклоны обозначены в соответствии с их позициями на рестриктной карте домена по рестриктазам Hind III и Bam HI (схема на рисунке 7). При этом Hind III и Bam HI фрагменты обозначены соответственно буквами Н и В с указанием расстояния от некой произвольно выбранной точки (конститутивного участка гиперчувствительности к ДНКазеї) в начале домена. Для удобства сравнения на рисунке 7 под рестрикционной картой расположена шкала расстояний, обозначения на которой даны в соответствии с нумерацией последовательности ДНК, депонированной в банке генов (AY016020). Представляющие интерес фрагменты ДНК были переклонированы в вектор pSP73, который содержит промоторы для SP6 и Т7 РНК-полимераз, позволяющие синтезировать РНК пробы, комплементарные разным цепям ДНК. Использование набора проб, комплементарных цепи ДНК, транскрибирующейся в глобиновом направлении, позволило картировать транскрипционную единицу, направляющую синтез полнодоменного транскрипта в эритроидных клетках. Результаты гибридизации показаны в нижней части рисунка 7. Гибридизационные сигналы над р РНК полосами наблюдались с пробами к 5 -концевой области домена (В-1, НО, Н4, Н7, расположенных на расстоянии 15, 12, 7 и 4 т.п.н. к 5 -концу от л-гена соответственно), л-гену (Н12), ал-гену (В 18) и к участку, расположенному на расстоянии около 1.5 тпн от гена аА (В20). Сильный сигнал в области от 7 и 30 т.п.н. наблюдался только в ядерной РНК и отсутствовал в цитоплазматической. Значительно более слабые полосы с меньшим молекулярным весом видны как в ядерной, так и в цитоплазматической РНК. Они скорее всего представляют собой результат неспецифической сорбции пробы на рибосомные РІЖ. В цитоплазматической РНК полосы, соответствующие мРНК гена аА (0.6 т.п.н.) и относительно стабильному продукту неполного процессинга этой мРНК (0.7 т.п.н.) четко видны при гибридизации с пробой В18 (аА-ген). Присутствие глобиновой мРНК является результатом спонтанной дифференцировки 1-5% клеток HD3 в неиндуцированных культурах.
Чтобы картировать нижнюю границу транскрибируемой области, мы выполнили гибридизацию с олигонуклеотидом, взятым из аА-гена, и имеющим такую же длину и общий нуклеотидный состав как и тестируемый олигонуклеотид из фрагмента В21. Результаты гибридизационного эксперимента ясно показывают, что фрагмент В21 не транскрибируется (рис.7, вставка справа). 3. Демонстрация непрерывности полнодоменного транскрипта домена а-глобиновых генов кур. Результаты анализа по Нозерну, описанные в предыдущем разделе, могут означать, что в клетках HD3 весь домен а-глобиновых генов (включая регуляторную 5 -концевую область), транскрибируется, давая начало протяженной ядерной РНК. До настоящего момента не было ясно, существует ли непрерывная транскрипционная единица, покрывающая всю исследуемую область, или различные субдомены транскрибируются независимо, как в домене р глобиновых генов человека. Для того, чтобы картировать непрерывные транскрипты, использовали метод РТ-ПЦР. Было подобрано несколько наборов праймеров (по 3 праймера в каждом), чтобы инициировать синтез кДНК с различных точек домена (Н7, Н12/тс-ген, В16/а-ген, В18/аА-ген, В20, В21). Эти праймеры были использованы для обратной транскрипции на ядерной РНК. Для последующей амплификации продуктов обратной транскрипции были использованы два набора праймеров для ПЦР, подобранных с целью выявить возможное присутствие последовательностей кДНК, включающих фрагменты В-1 и НЗ. Позитивный сигнал в реакции ПЦР-амплификации служит доказательством наличия ядерных транскриптов, охватывающих область между праймерами для обратной транскрипции и праймерами для ПЦР. Результаты ПЦР-анализа показывают, что кДНК, синтез которых инициирован на участках Н7-В16, содержат последовательности из фрагментов В-1 и НЗ (рисунок 8). В контрольных экспериментах, при ПЦР-анализе кДНК, которая была синтезирована в противоположном направлении, начиная с участка В18, сигнал не был обнаружен ни с одним из соответствующих праймеров. кДНК, синтезированная с глобиновой РНК, начиная с участка В18, содержала последовательности, присутствующие в НЗ, но отсутствующие в В-1. Это может отражать неспособность ревертазы синтезировать столь длинные цепи РНК. В последующих экспериментах нам удалось амплифицировать часть фрагмента HI2 (л-ген), используя в качестве матрицы кДНК, синтезированную на ядерной РНК посредством В18- и В20-специфических праймеров, но не удалось выполнить этого с В21 специфическими праймерами. Эти результаты хорошо согласуются с отсутствием сигнала на Нозерн блоте с В21-специфичным нуклеотидом. Результаты гибридизации и РТ-ПЦР показывают, что изучаемый нами транскрипт действительно является полнодоменным. Конец полнодоменной транскрипционной единицы картируется приблизительно на границе фрагментов В20 и В21, т.е. на расстоянии около 1,5 т.п.н. к 3 -концу от аА-гена. С учетом описанных ранее результатов по картированию начала полнодоменной транскрипционной единицы, можно утверждать, что протяженность ее составляет около 30 т.п.н. 4. Одновременная транскрипция с обеих цепей ДНК в домене а-глобиновых генов кур. В эритроидных клетках протяженная 5 -область домена а-глобиновых генов кур перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ggPRX, который транскрибируется в противоположном направлении [97], [112]. Эти данные были получены посредством анализа по Нозерну со специфичными пробами и РТ-ПЦР амплификации нескольких тест-фрагментов со специфичными праймерами. В связи с этим возник вопрос о том, транскрибируется ли домен а-глобиновых генов кур в обоих направлениях в одной клетке синхронно и РНК-полимераз.
Синтезированную РНК метили биотином с помощью «Random prime labeling kit» (Roche). Полученные пробы гибридизовали in situ с препаратами фиксированных клеток HD3. После гибридизации сигнал выявлялся с помощью каскада антител, коньюгированных с Alexa 488, флюорисцирующей зеленым цветом. На рисунке 10 видно, что обе пробы дают сильный сигнал в большинстве клеток. Из 200 произвольно выбранных клеток 183 дали позитивный сигнал с пробой, узнающей транскрипт ggPRX, a 167 клеток дали позитивный сигнал с пробой, узнающей транскрипт глобинового направления. Если учесть то обстоятельство, что эффективность гибридизации in situ с РНК-пробами никогда не достигает 100%, то можно заключить, что во всех клетках транскрипция идет в обоих направлениях. Чтобы проверить специфичность гибридизации, мы выполнили контрольные эксперименты. Мы проводили гибридизацию одновременно с меченой РНК-пробой и 10-кратным избытком немеченой. Кроме того, препараты гибридизовали с «инертной» РНК, синтезированной с плазмиды pSP73. В обоих контрольных экспериментах сигнала не наблюдалось. Тот факт, что рибопробы, транскрибируемые с одной и той же области в противоположных направлениях, гибридизуются с большинством клеток, уже указывает на то, что в значительной части клеток транскрипция в обоих направлениях происходит одновременно, и оба транскрипта присутствуют в одной и той же клетке. Чтобы подтвердить это заключение, мы выполнили дополнительные эксперименты. Мы выбрали два соседних фрагмента размером около 700 и 500 п.н. в области с координатами 31565-32724, где также имеет место перекрывание транскриптов (область 2 на рисунке 9). Первый фрагмент был транскрибирован в направлении, противоположном транскрипции глобиновых генов, и помечен биотином, а второй был транскрибирован в глобиновом направлении и помечен дигоксигенином. В данном случае мы синтезировали РНК разных направлений с разных участков во избежание гибридизации друг с другом проб, меченных биотином и дигоксигенином. Затем мы гибридизовали смесь этих фрагментов с клетками HD3. присутствуют ли эти транскрипты в ядре одновременно.
